Articolo metodologico

Un metodo semplificato per la trasformazione mediata da agrobatteri di Phytophthora palmivora

DOI:

10.3791/69753

⸱

20 marzo 2026

 ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of Georgia

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo un protocollo semplice, efficace e riproducibile per la trasformazione mediata da Agrobacterium di Phytophthora palmivora, applicabile anche a P. capsici.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phytophthora è un genere di oomiceti che contiene numerosi patogeni vegetali distruttivi, tra cui la specie di ampio raggio ospite P. palmivora. La genomica funzionale di Phytophthora è stata limitata dalla limitata disponibilità di metodi di trasformazione robusti e facili da implementare. Tra gli approcci disponibili, la trasformazione mediata da Agrobacterium (AMT) è particolarmente attraente perché richiede attrezzature specializzate minime e spesso produce trasformanti stabili con inserimenti genici a copia singola. La maggior parte dei protocolli AMT per la trasformazione fungina e oomiceta utilizza sali a medium minimo (MM) nei mezzi di induzione e co-coltivazione di Agrobacterium . La preparazione di questi mezzi di solito comporta la realizzazione e la miscelazione di più soluzioni di fondo, alcune delle quali contengono numerosi componenti a diverse concentrazioni. Il processo richiede tempo e soggetta a errori, portando quindi a un successo di trasformazione incoerente. Qui presentiamo un protocollo AMT semplificato, snello e riproducibile per P. palmivora che utilizza il mezzo basale Murashige e Skoog (MS) disponibile in commercio per preparare il mezzo di induzione e co-coltivazione di Agrobacterium . Questo protocollo è stato applicato con successo anche per trasformare P. capsici e può essere applicato anche ad altre specie di Phytophthora .

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phytophthora, un genere di oomiceti, comprende molti dei patogeni vegetali più distruttivi al mondo, responsabili di gravi perditeeconomiche 1,2. Tra queste, Phytophthora palmivora è un patogeno a vasta gamma di ospiti che infetta molte colture economicamente importanti, tra cui cacao epapaya 3. È l'agente causale più diffuso del marciume del baccello nero nel cacao, un albero perenne tropicale che produce la componente principale dell'industria del cioccolato, da miliardi didollari. Comprendere i meccanismi di patogenicità molecolare di questo patogeno distruttivo è fondamentale per progettare strategie di controllo delle malattie nuove ed efficaci, e la trasformazione genetica è uno strumento essenziale per consentire tali indagini.

Sono stati sviluppati diversi metodi per trasformare le specie di Phytophthora, tra cui il bombardamento dimicroproiettili 7, la trasformazione del protoplasto mediata da polietilenglicole e dicloruro di calcio (PEG/CaCl 2) 8,9,10,11, l'elettroporazione zoospora 12,13,14 e la trasformazione mediata da Agrobatterio (AMT)15.16. Tra questi approcci, l'AMT offre vantaggi chiave poiché genera tipicamente integrazione genicaa copia singola 15,16 ed è relativamente facile da eseguire senza necessità di apparecchiature specializzate.

Un protocollo per la trasformazione efficiente di P. palmivora utilizzando AMT è stato precedentemente sviluppato16. Con questo metodo, abbiamo trasformato con successo P. palmivora con costruttimultipli 17,18. Questo metodo utilizza mezzi di induzione e co-coltivazione a base di Agrobacterium a base di semi minimi (MM), comunemente utilizzati per la trasformazione fungina eoomiceta 15,16,19. Sebbene il protocollo di trasformazione basato su MM si sia dimostrato efficace nella generazione di trasformanti, preparare più soluzioni stock e combinarle per creare media può essere un compito che richiede tempo e soggetto a errori.

Qui presentiamo un metodo molto semplificato per l'AMT di P. palmivora utilizzando il mezzo basale commerciale Murashige e Skoog (MS) per sostituire i componenti del medium a base di sale MM nel mezzo di induzione e co-coltivazionedi Agrobacterium 16. Questo metodo elimina la necessità di preparare più soluzioni chimiche stock, rendendo il processo meno dispendioso in termini di tempo e altamente riproducibile. Inoltre, questo approccio sembra garantire un'efficienza di trasformazione superiore rispetto al metodo16 descritto in precedenza, ed è applicabile anche a P. capsici.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparazione di soluzioni stock, materiali e altri materiali necessari per la trasformazione

  1. Soluzioni antibiotiche per stock
    1. Prepara soluzioni stock di kanamicina (50 mg/mL), G418 (15 mg/mL) e cefotassima (100 mg/mL): sciogli le quantità appropriate degli antibiotici in acqua, filtra la sterilizzazione delle soluzioni, prepara aliquote da 1 mL e conservale a -20 °C.
    2. Prepara la soluzione di rifampicina (15 mg/mL): Sciogli la quantità appropriata di rifampicina in DMSO, prepara aliquote da 1 mL, avvolgile nella stagnola e conservale a -20 °C.
      NOTA: Assicurarsi di filtrare le soluzioni chimiche preparate in DMSO utilizzando filtri a siringa realizzati con materiali compatibili DMSO, come Nylon o PTFE (Teflon).
  2. Mezzi per la crescita di Agrobacterium
    1. Mezzo liquido Luria-Bertani (LB): Per preparare 250 mL di substrato, aggiungere 6,25 g di polvere LB a 250 mL d'acqua, autoclavare la soluzione e conservarla a temperatura ambiente (RT).
    2. Substrato agarico LB: Per preparare 250 mL di substrato, aggiungi 6,25 g di polvere LB e 3,75 g di agar a 250 mL d'acqua, autoclave la soluzione e conserva in RT. Aggiungi gli antibiotici appropriati all'agar LB fuso prima di preparare le lastre. Conserva i piatti integrati con antibiotici a 4 °C.
  3. Supporti per la crescita e la trasformazione di P. palmivora
    1. Agar V8 al 10%: Per preparare 500 mL, aggiungi 50 mL di succo originale di V8 al 100% a 450 mL d'acqua. Poi aggiungi 0,5 g di CaCO3 alla sospensione e mescola per mescolare bene. Autoclave la soluzione e versarla nei piatti.
      NOTA: Aggiungi gli antibiotici appropriati quando necessario. Conserva i piatti integrati con antibiotici a 4 °C.
    2. Mezzo liquido Murashige e Skoog a metà forza (1/2 MS): Aggiungi 2,15 g di mezzo basale Murashige e Skoog (MS) a 950 mL d'acqua, regola il pH a 5.6 con 1 N KOH e aggiungi acqua fino a 1 L. Usa direttamente per produrre 1/2 MS agar (passo 1.3.3), autoclave il residuo di 1/2 MS liquido e conservalo a RT.
    3. 1/2MS agar per agar di co-coltivazione Agrobatterium-zoospora (AZCA): Per preparare 600 mL di AZCA, miscela 567 mL di 1/2 MS liquido del passo 1.3.2 con 9 g di agar. Autoclave la soluzione e memorizzala su RT.
    4. 50% glicerolo: Mescola 50 mL di glicerolo con 50 mL d'acqua, autoclave la soluzione e conserva in regime di autoclave.
    5. 1M MES (pH 5,6): Per preparare 200 mL, aggiungere 39,048 g di MES Hydrate a 160 mL d'acqua, poi regolare il pH a 5,6 con la soluzione di NaOH. Successivamente, aggiungi acqua fino a 200 mL, filtra la soluzione e conservala in RT in condizioni buie.
      NOTA: Il MES si dissolve gradualmente man mano che il pH aumenta. Inizialmente, usa NaOH a 10 N per avvicinare il pH a 5,6, che quasi dissolverà la polvere. Poi, aggiungi 1 N NaOH per portare il pH esattamente a 5,6.
    6. 20% di glucosio: sciogliere 10 g di glucosio in 40 mL d'acqua, poi aggiungere acqua fino a 50 mL, filtrare la soluzione e conservarla a RT.
    7. 200 mM Acetosirone (AS): Sciogliere 40 mg di 4'-Idrossi-3',5'-dimetossiacetofenone in 1 mL di DMSO (vedi NOTA sotto 1.1.2) e coprire la soluzione con carta stagnola. Rendilo fresco il giorno della trasformazione.
    8. Mezzo di induzione agrobatterico (AIM): Per preparare 40 mL di substrato, aggiungere 400 μL di glicerolo al 50%, 400 μL di glucosio al 20%, 1,6 mL di 1 M MES (pH 5,6), 40 μL di 200 mM di AS a 37,6 mL di soluzione liquida da 1/2 MS (pH 5,6) (preparata nello step 1.3.2) in un tubo sterile da 50 mL. Mescola bene la soluzione, copri il tubo con la carta stagnola e usala fresca entro alcune ore.
    9. Agar di co-coltivazione agrobatterio-zoospora (AZCA): Per preparare 600 mL di agar, aggiungere 6 mL di glicerolo al 50%, 3 mL di glucosio al 20%, 24 mL di 1 M MES (pH 5,6), 600 μL di 200 mM AS per autoclavare e fondere 567 mL 1/2 agar MS (pH 5,6) (preparato nel passo 1.3.3). Versa la soluzione in piatti e coprili con un panno nero per proteggerla dalla luce.
      NOTA: Aggiungere le soluzioni chimiche a mezzo agar fuso (passo 1.3.9) quando la temperatura è di 55-60 °C. Spegni le luci nel cofano durante i passaggi 1.3.7-1.3.9 perché l'AS è sensibile alla luce. Esegui questi tre passaggi il giorno della trasformazione.
    10. Agaro Plich: Per preparare 1 L di agar, in 950 mL d'acqua, aggiungere 0,5 gKH 2PO4, 0,25 g di MgSO 4,7H2O, 1 g di L-asparagina, 5 g di glucosio, 0,5 g di estratto di lievito, 10 μL di tiamina (100 mg/mL in acqua, conservata a 4 °C), 10 mg di β-sitosterolo (sciogliere in 3 mL di etanolo prima di aggiungere). Mescola la soluzione per sciogliere tutti gli ingredienti, poi aggiungi acqua per portare il volume fino a 1 L. Dividi la soluzione in porzioni da 500 mL e aggiungi 7,5 g di agar a ciascuna quantità da 500 mL. Autoclave la soluzione e aggiungi gli antibiotici appropriati quando la temperatura scende a 55 °C, poi versa la soluzione nei piatti.
    11. Membrana Hybond N+: Taglia la membrana con i fogli protettivi in pezzi di 5 cm x 6 cm, avvolgi i pezzi in carta stagnola e autoclave. Durante la posizione della membrana autoclavata su un supporto AZCA, maneggiala con una pinza sterile e scarta i fogli protettivi.

2. Coltivazione di P. palmivora

  1. Sette-otto giorni prima della trasformazione, coltiva l'isolato di papaya P1 16 di P. palmivora su piastre di agar al 10% appena preparate, posizionando un tappo di agar di una coltura di Phytophthora già coltivata (o dal stock) al centro della piastra di Petri.
    NOTA: Per ottenere una concentrazione più elevata di zoospore, è importante utilizzare agar V8 al 10% non chiarificato appena preparato.
  2. Incubare le piastre a 25 °C in un ciclo di 12 ore di luce e di 12 ore di buio per 7-8 giorni fino alla trasformazione.

3. Preparazione di Agrobacterium tumefaciens

  1. Tre giorni prima della trasformazione, la striscia di A. tumefaciens ceppo EHA105 trasporta pCB301TOR-GFP16 su una piastra agar LB integrata con rifampicina (15 μg/mL) e kanamicina (50 μg/mL). Incubare la piastra a 28 °C per 2 giorni.
    NOTA: La preparazione iniziale di Agrobacterium (passo 3.1) può essere effettuata una settimana prima della trasformazione, e le placche possono essere conservate a 4 °C dopo il periodo di incubazione di 2 giorni.
  2. Il giorno prima della trasformazione, si prende una piccola quantità di cellule di Agrobacterium e spargile su una nuova piastra agar LB integrata con antibiotici (come descritto nel passo 3.1) utilizzando la base inferiore e piatta di un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 mL. Per una diffusione più semplice, aggiungi 20 μL di substrato liquido al centro della piastra di agar LB, mescola le cellule batteriche con il mezzo LB e poi distribuiscile uniformemente sulla placca. Incubare la piastra a 28 °C durante la notte per circa 16-18 ore.
  3. Scavare le cellule coltivate durante la notte con una punta di pipetta da 1 mL e risospesile in un mezzo di induzione Agrobacterium (AIM) da 1 mL pipettando su e giù. Diluire le celle a OD600 = 0,4 con AIM in un tubo sterile da 50 mL rivestito con una pellicola stagnola. Produrre almeno 5 mL da utilizzare per la co-incubazione con zoospore di P. palmivora (passo 5.1).
    NOTA: Un OD600 con valori compresi da 0,1 a 0,8 permetterebbe una trasformazione efficace. OD600 = 0,4 è usata regolarmente poiché questa concentrazione ha prodotto la massima efficienza di trasformazione quando per la trasformazione sono stati utilizzati mezzi minimi di induzione e co-coltivazione a base di sale a base di Agrobacterium (MM).
  4. Incubare i batteri in RT in condizioni di buio per 1,5-2 ore su un agitatore a piattaforma con una leggera agitazione (circa 70 giri/min).
    NOTA: Si consiglia di tenere spente le luci della cappa durante il passaggio 3.3 e di allentare il tappo del tubo da 50 mL durante l'incubazione (passo 3.4).

4. Rilascio delle zoospore

  1. Dopo 1 ora di incubazione di Agrobacterium tumefaciens (passo 3.4), inondare una piastra di P. palmivora vecchia di 7-8 giorni con 10 mL d'acqua preraffreddata a 4°C, rimuovere le bolle d'aria sulla superficie del mezzo battendo delicatamente con la punta di una pipetta e incubare la piastra a 4 °C per 15 minuti, seguita da 15 minuti a RT sotto luce.
  2. Trasferire delicatamente le zoospore rilasciate (circa 7-8 mL) in un tubo centrifuga sterile da 15 mL con una pipetta senza disturbare miceli e sporangi.
  3. Per misurare la concentrazione delle zoospore, si trasferisce parte della sospensione della zoospora (ad esempio 20 μL) in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e si diluisce 10 volte con acqua (180 μL H2O per zoospore da 20 μL). Vortice il tubo per 1 minuto per incapsulare le zoospore e facilitare il conteggio, poi contare il numero di zoospore al microscopio usando un emocitometro. Moltiplicare il numero contato per un fattore 10 per determinare la concentrazione della sospensione zoospora preparata nel passo 4.2.
    NOTA: La concentrazione di zoospore viene misurata per calcolare l'efficienza della trasformazione. Utilizziamo tipicamente concentrazioni che vanno da 1,5 × 106 a 5 × 106 zoospore per mL, con successo nella trasformazione.

5. Co-incubazione di Agrobacterium e zoospore

  1. Aggiungi 5 mL di Agrobacterium (preparato nel passo 3.4) a 5 mL di sospensione zoospora (preparato nel passo 4.2) in un tubo sterile da 50 mL coperto con un foglio di alluminio. Mescola delicatamente e incuba il tubo a RT per 2 ore al buio. Tieni il coperchio allentato e non scuotere il tubo durante la co-incubazione.
  2. Durante il periodo di co-incubazione (passo 5.1), prepara le placche AZCA (passo 1.3.9). Quando il mezzo si solidifica, posiziona un pezzo di membrana sterilizzata Hybond N+ (preparata nel passo 1.3.11) su ciascuna piastra AZCA e tieni le piastre al buio.
  3. Dopo 2 ore di co-incubazione tra Agrobatterium e zoospora (passo 5.1), distribuisci 300 μL della miscela su ciascuna membrana Hybond N+ posta sopra le piastre AZCA (passo 5.2) con una punta di pipetta, lasciando i margini liberi dal liquido.
  4. Lascia asciugare la miscela all'aria per circa 10 minuti nel cappuccio lasciando le piastre di Petri scoperte. Copri le placche non appena la soluzione sulla membrana smette di scorrere.
    NOTA: Durante i passaggi 5.1-5.4, tieni spente le luci del cofano. Se necessario, usa delle luci mentre aggiungi e spargi la miscela sulle membrane (passo 5.3).
  5. Dopo l'asciugatura all'aria, incubare le piastre a 25 °C al buio per 2 giorni.

6. Selezione dei trasformanti resistenti al G418

  1. Dopo 48 ore di co-incubazione (passo 5.5), trasferire le membrane Hybond N+ capovolte, utilizzando pinze sterilizzate su piastre agar Plich integrate con G418 (30 μg/mL) e cefotassima (100 μg/mL). Durante la posizione delle membrane sulle lastre, non trascinarle sulla superficie del medio.
    NOTA: La concentrazione di G418 per la selezione dei trasformanti per ciascun isolato di P. palmivora deve essere determinata, poiché si osservano diversi livelli di sensibilità per diversi isolati. Per farlo, si posiziona un tappo di micelio di 0,5 cm di diametro al centro delle piastre di agar Plicit, integrato con una serie di concentrazioni di G418 in incrementi di 5 μg/mL a partire da zero. Prepara tre piastre replicanti per ogni concentrazione. Incubare le piastre a 25 °C per 7 giorni. Identificare la concentrazione più bassa di G418 che inibisce completamente la crescita dell'isolato di Phytophthora e usarla per la selezione dei trasformanti.
  2. Usa la base piatta di un tubo microcentrifuga da 1,5 mL per premere e scorrere delicatamente sulla superficie della membrana, assicurandoti che sia a stretto contatto con il mezzo. Osserva la parte inferiore delle piastre per verificare la presenza di bolle d'aria tra la membrana e il mezzo. Spremete delicatamente la bolla d'aria, se c'è, usando la base piatta dello stesso tubo della microcentrifuga.
  3. Incubare le placche in un ciclo di 12 ore di luce e di 12 ore di buio a 25 °C per 2-3 giorni.
  4. Dopo 3 giorni di incubazione, rimuovere le membrane con una pinza sterile e continuare a incubare le placche nelle stesse condizioni. Le membrane possono essere rimosse dopo 2 giorni se compaiono colonie visibili sulle placche.
    NOTA: I trasformanti compaiono tipicamente entro 1-3 giorni dalla rimozione della membrana, ma alcune colonie possono comparire più tardi. Per ottenere più trasformanti, monitorare le placche per circa una settimana dopo la rimozione delle membrane.
  5. Trasferire i trasformanti su piastre di agar V8 al 10% con la stessa concentrazione di G418 o una concentrazione ridotta del 30%.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seguendo questo protocollo, abbiamo condotto due esperimenti indipendenti per trasformare P. palmivora utilizzando A. tumefaciens EHA105 che trasportava pCB301TOR-GFP16. Come previsto, la co-incubazione di zoospore con Agrobacterium ha prodotto colonie resistenti al G418 su piastre agar di Plich integrate con 30 μg/mL di G418, mentre nessuna colonia è stata osservata sulle piastre di controllo senza infezione da Agrobacterium (Figura 1A). Il numero di trasformanti resistenti a G418 ogni 107 zoospore prodotte da questi due esperimenti era rispettivamente 55 e 50 (Tabella 1), quasi il doppio del numero più alto (27 ± 5) precedentemente ottenuto con il precedenteprotocollo 16.

I veri trasformanti sono stati verificati con due metodi: primo, l'osservazione della fluorescenza GFP con un microscopio a fluorescenza, e secondo, l'amplificazione PCR di un frammento a 550 bp del gene EGFP usando Taq 2X Master Mix (NEB) con la coppia di primer EGFP-F2 (5'- GACGTAAACGGCCACAAGTTC-3') ed EGFP-R2 (5'-GGGTGCTCAGGTAGTTTG-3'). Nell'esperimento (Exp) 1, 15 su 18 trasformanti resistenti a G418, e in Exp 2, 17 su 21 trasformanti hanno mostrato fluorescenza GFP (Tabella 1, Figura 1B). Per i sette trasformanti resistenti al G418 che non hanno mostrato fluorescenza in entrambi gli esperimenti, tre sono stati confermati come veri trasformanti tramite PCR (Figura 1C). In totale, il tasso di veri trasformanti è stato stimato al 90%.

Inoltre, siamo riusciti a trasformare con successo un isolato di zucca P. capsici , PC2024-14sz, utilizzando A. tumefaciens EHA105 che trasporta pCB301TOR-GFP, seguendo il protocollo con una piccola modifica nella preparazione delle sospensioni zoospore (il periodo di incubazione a 4 °C dopo l'allagamento di una piastra di P. capsici vecchia di 7 giorni con acqua preraffreddata è stato esteso a 30 minuti). Il numero di trasformanti resistenti a G418 (30 μg/mL) ogni 107 di un singolo esperimento era di 13. Nove trasformanti sono stati osservati al microscopio a fluorescenza e tutti hanno prodotto fluorescenza (File Supplementare 1), suggerendo che siano veri trasformanti.

figure-results-1
Figura 1: Trasformazione di P. palmivora utilizzando A. tumefaciens EHA105 portatore di pCB301TOR-GFP. (A) Comparsa di trasformanti P. palmivora resistenti a G418 su agar Plich integrato con 30 μg/mL di G418. (B) Rilevamento dell'espressione di GFP al microscopio a fluorescenza in un ceppo rappresentativo di trasformante e P. palmivora wild-type (WT). Le immagini sono state scattate sia sotto canali di fluorescenza a campo chiaro (BF) che GFP. (C) Amplificazione PCR di EGFP da quattro trasformanti con fluorescenza rilevabile di GFP e sette senza fluorescenza di GFP. La coppia di primer universale ITS4/ITS520 è stata utilizzata per amplificare la regione interna del trascritto distanziatore (ITS) al fine di verificare l'integrità del DNA. I trasformanti senza fluorescenza GFP sono evidenziati in testo in grassetto e sottolineato. Abbreviazioni: M = NEB 100 pb scala del DNA; WT = isolato P. palmivora di tipo selvatico P1; N = PCR a controllo negativo usando H2O come modello. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

EsperimentoOD600 di AgrobacteriumConcentrazione di zoospore (/mL)Volume della zoospora (mL)Numero di trasformanti resistenti al G418Numero di trasformanti con segnale GFP rilevabile (Rilevato / Osservato)Numero di trasformanti resistenti a G418/ 107 zoospore
10.41.8 x 1064.34315/1855
20.42,9 x 1064.66717/2150

Tabella 1: Efficienza della trasformazione mediata dagli agrobatteri di P. palmivora utilizzando A. tumefaciens EHA105 portatore di pCB301TOR-GFP.

File supplementare 1: Espressione di GFP al microscopio a fluorescenza in P. capsici di tipo selvatico (WT ) e un trasformante rappresentativo generato utilizzando A. tumefaciens EHA105 che trasporta pCB301TOR-GFP. Le immagini sono state scattate sia sotto canali di fluorescenza a campo chiaro (BF) che GFP. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo utilizza mezzo basale Murashige e Skoog a metà forza (1/2 MS) per sostituire i componenti dei sali a medium minimo (MM) comunemente utilizzati nei mezzi di induzione e co-coltivazione di Agrobacterium per la trasformazione di oomiceti e fungi. La preparazione di substrati a base di sale MM richiede la produzione di più soluzioni stock da numerosi prodotti chimici individuali e poi la combinazione di questesoluzioni 19. 1/2 MS contiene anche molti componenti chimici; tuttavia, poiché la MS è ampiamente disponibile commercialmente come polvere premiscelata, la preparazione del medium è semplificata sciogliendo la polvere in acqua. Questa modifica riduce significativamente i tempi di preparazione dei materiali e minimizza il rischio di errore umano. Inoltre, il protocollo migliora l'efficienza della trasformazione, producendo un numero maggiore di trasformanti rispetto al metodoAMT 16 descritto in precedenza. È anche efficace per trasformare P. capsici ed è probabilmente applicabile ad altre specie di Phytophthora . A ulteriore supporto della sua potenziale applicazione più ampia, il mezzo a base di SM è stato precedentemente utilizzato per co-coltivare ceppi di Agrobacterium tumefaciens che esprimono le zoospore AtVIP1 (Arabidopsis thaliana VirE2-interagente 1) e P. infestans , permettendo la trasformazione efficace di P. infestans21.

È importante notare che questo protocollo può generare una bassa percentuale di falsi positivi. Tra i 39 trasformatori resistenti al G418 testati tramite osservazione della fluorescenza con GFP o PCR, quattro non hanno mostrato né fluorescenza né amplificazione dell'EGFP (Tabella 1, Figura 1C). Poiché l'integrazione parziale del T-DNA durante la trasformazione mediata da Agrobacterium non èinsolita 22,23, è possibile che solo la porzione del T-DNA contenente il gene NPTII dal plasmide pCB301TOR-GFP16 sia stata integrata nel genoma di P. palmivora. In alternativa, i falsi positivi possono derivare da un contatto insufficiente tra la membrana e il mezzo selettivo, permettendo la fuga dalla selezione di G418. Garantire che la membrana rimanga in pieno contatto con il mezzo (passo 6.2) è quindi essenziale.

Questo protocollo può essere ulteriormente semplificato. Ad esempio, il MES nel mezzo di induzione Agrobacterium (AIM) e nell'agar di co-coltivazione Agrobacterium-zoospore (AZCA) può potenzialmente essere omesso. Il MES è comunemente utilizzato come agente tampone in esperimenti di biochimica e biologia molecolare per mantenere un pH stabile; tuttavia, preparare una soluzione MES stock di 1 milione al pH 5,6 richiede un tempo sufficiente e aumenta il costo. Nell'AMT di piante, come il basilicodolce 24 e lapapaya 25, sono stati utilizzati mezzi simili di induzione e co-coltivazione a base di Agobacterium senza MES, suggerendo che il MES potrebbe non essere essenziale per la trasformazione di P. palmivora . Sono necessari ulteriori esperimenti per confermare che l'omissione della MES non comprometta l'efficienza della trasformazione.

Nel complesso, questo protocollo semplificato fornisce una piattaforma pratica e accessibile per la manipolazione genetica di routine di P. palmivora, P. capsici e potenzialmente altri oomiceti. Supporta un'ampia gamma di studi fondamentali, alcuni dei quali hanno potenziali traslazioni, tra cui la marcatura fluorescente dei patogeni per monitorare la dinamica delle infezioni, il marcatore delle proteine per esaminare la localizzazione subcellulare e analisi funzionali attraverso cambiamenti mirati nell'espressione genica o nelle sequenze codificanti proteiche. Quando abbinato all'editing genomico basato su CRISPR, il protocollo dovrebbe accelerare la dissezione dei meccanismi di patogenicità e l'identificazione dei fattori chiave di virulenza in questi patogeni distruttivi. Le intuizioni risultanti permetteranno, a loro volta, lo sviluppo di nuove strategie di controllo delle malattie basate su meccanismi.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo studio è supportato dalla National Science Foundation (NSF Award n. 2418799) e dal National Institute of Food and Agriculture (Premio NIFA n. 2023-67013-42262).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubi microcentrifughe da 1,5 mLVWR525-1126
4'-Idrossi-3',5' dimetossiacetofenoneTCID2666Acetosirone (AS)
Tubo da 50 mLGreiner Bio-one227261
Etanolo AssolutoBioReagenti FisherBP28184
AgarBioReagenti FisherBP1423-500
Carta stagnola
Membrana ibondante-N+ (30 cm e volte 3 m)CytivaRPN303B
Carbonato di calcioSigma-Aldrich239216-500GCaCO3
Cefotassime sale sodicoChimici TermoscientificiAAJ6269006
D-(+)-GlucosioSigma-AldrichG8270-1KG
DNeasy PowerLyzer Kit MicrobicoQiagen12255-50
Pinza
Microscopio a fluorescenzaZeissMicroscopio a fluorescenza ZEISS Axioscope 5 con set filtro 38 HE
G418 solfatoChimici TermoscientificiAC329400010
GliceroloSigma-Aldrich911046-1L
Emacitometro (Linea Luminosa)Hausser Scientific
Kanamicina solfatoSanta Cruz BiotecnologiaSC-257635
L-Asparagina anidroMP BiomediciICN10079425
LB Broth, MillerBioReagenti FisherBP1426-2
Solfato di magnesio eptaidratoSigma-Aldrich63138-250GMgSO4· 7H2O
MES HydrateSigma-AldrichM2933-100G
Medium Basale Murashige e SkoogSigma-AldrichM5519-50L
Piastra di Petri (100 mm x 15 mm)VWR25384-342
Fosfato diidrogeno di potassioSigma-Aldrich1370391000KH2PO4
RifampicinaSanta Cruz BiotecnologiaSC-200910
Taq 2X Master MixNEBM0270L
Cloridrato di tiaminaSigma-AldrichT4625-5G
Spettrofotometro UV-VisibileFisher Scientific14-385-355
V8 Original 100% Succo di VerdureCampbell Zuppa Company
VorticeFisher Scientific14-955-163
AcquaGrado di biologia molecolare, purificato con il sistema di purificazione dell'acqua Mill-Q
Estratto di lievitoACROS611805000Attualmente disponibile tramite Thermo Scientific Chemicals
β-SitosteroloSigma-Aldrich85451-100G

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kamoun, S., et al. The top 10 oomycete pathogens in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol. 16 (4), 413-434 (2015).
  2. Jones, J. D., Staskawicz, B. J., Dangl, J. L. The plant immune system: From discovery to deployment. Cell. 187 (9), 2095-2116 (2024).
  3. Tocafundo, F., et al. Direct and cross-pathogenicity of Phytophthora palmivora against cacao, papaya, and peach palm. Trop Plant Pathol. 46 (6), 664-673 (2021).
  4. Morales-Cruz, A., et al. Independent whole-genome duplications define the architecture of the genomes of the devastating West African cacao black pod pathogen Phytophthora megakarya and its close relative Phytophthora palmivora. G3 (Bethesda). 10 (7), 2241-2255 (2020).
  5. Ali, S., et al. PCR-based identification of cacao black pod causal agents and identification of biological factors possibly contributing to Phytophthora megakarya's field dominance in West Africa. Plant Pathol. 65 (7), 1095-1108 (2016).
  6. Marelli, J. -P., et al. Chocolate under threat from old and new cacao diseases. Phytopathology. 109 (8), 1331-1343 (2019).
  7. Cvitanich, C., Judelson, H. S. Stable transformation of the oomycete, Phytophthora infestans, using microprojectile bombardment. Curr Genet. 42 (4), 228-235 (2003).
  8. Judelson, H. S., Tyler, B. M., Michelmore, R. W. Transformation of the oomycete pathogen, Phytophthora infestans. Mol Plant Microbe Interact. 4 (6), 602-607 (1991).
  9. Wang, W., et al. an oxathiapiprolin-resistance gene, functions as a novel selection marker for Phytophthora transformation and CRISPR/Cas9 mediated genome editing. Front Microbiol. 10, 2402(2019).
  10. Dai, T., et al. An improved transformation system for Phytophthora cinnamomi using green fluorescent protein. Front Microbiol. 12, 682754(2021).
  11. Fang, Y., Cui, L., Gu, B., Arredondo, F., Tyler, B. M. Efficient genome editing in the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9. Curr Protoc Microbiol. 44 (1), 21A.1.1-21A.1.26 (2017).
  12. Evangelisti, E., Yunusov, T., Shenhav, L., Schornack, S. N-acetyltransferase AAC (3)-i confers gentamicin resistance to Phytophthora palmivora and Phytophthora infestans. BMC Microbiol. 19 (1), 265(2019).
  13. Dong, L., et al. Establishment of the straightforward electro-transformation system for Phytophthora infestans and its comparison with the improved PEG/CaCl2 transformation. J Microbiol Methods. 112, 83-86 (2015).
  14. Huitema, E., Smoker, M., Kamoun, S. A straightforward protocol for electro-transformation of Phytophthora capsici zoospores. Methods Mol Biol. 712, 129-135 (2011).
  15. Vijn, I., Govers, F. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of the oomycete plant pathogen Phytophthora infestans. Mol Plant Pathol. 4 (6), 459-467 (2003).
  16. Wu, D., Navet, N., Liu, Y., Uchida, J., Tian, M. Establishment of a simple and efficient Agrobacterium-mediated transformation system for Phytophthora palmivora. BMC Microbiol. 16 (1), 204(2016).
  17. Gumtow, R., Wu, D., Uchida, J., Tian, M. A Phytophthora palmivora extracellular cystatin-like protease inhibitor targets papain to contribute to virulence on papaya. Mol Plant Microbe Interact. 31 (3), 363-373 (2018).
  18. Pettongkhao, S., Navet, N., Schornack, S., Tian, M., Churngchow, N. A secreted protein of 15 kDa plays an important role in Phytophthora palmivora development and pathogenicity. Sci Rep. 10 (1), 2319(2020).
  19. Minz, A., Sharon, A. Electroporation and Agrobacterium-mediated spore transformation. Molecular and Cell Biology Methods for Fungi. Sharon, A. , Humana Press. Totowa, NJ. 21-32 (2010).
  20. Bellemain, E., et al. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: An in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10 (1), 189(2010).
  21. Wang, L., et al. A modified Agrobacterium-mediated transformation for two oomycete pathogens. PLoS Pathog. 19 (4), e1011346(2023).
  22. Wu, E., et al. Optimized Agrobacterium-mediated sorghum transformation protocol and molecular data of transgenic sorghum plants. In Vitro Cell Dev Biol Plant. 50 (1), 9-18 (2014).
  23. Sun, L., et al. TDNAscan: A software to identify complete and truncated T-DNA insertions. Front Genet. 10, 685(2019).
  24. Navet, N., Tian, M. Agrobacterium-mediated transformation of sweet basil (Ocimum basilicum). Bio Protoc. 10 (22), e3828-e3828 (2020).
  25. Hasley, J., Dinulong, R. -J., Adhikari, A., Christopher, D., Tian, M. Genome editing of papaya using both Cas9 and Cas12a. bioRxiv. , (2025).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Agrobacterium TransformationPhytophthora PalmivoraZoospore Co IncubationGFP ExpressionGene Function AnalysisFluorescence MicroscopyOomycete TransformationMurashige Skoog MediumG418 SelectionProtein Localization

Articoli correlati