Articolo metodologico

Differenziazione e induzione dell'accumulo di gocce lipidiche negli adipociti umani come modello per lo studio dell'obesità in vitro

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DOI:

10.3791/69759

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20 marzo 2026

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1Department of Cell Pathology, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw

In questo articolo

Sommario

Il protocollo presentato mira a sviluppare un modello cellulare che imiti l'obesità umana. Per raggiungere questo obiettivo, le cellule staminali umane derivate dalle adipose vengono differenziate in adipociti, che vengono poi ingrassate utilizzando una miscela di acidi grassi selezionati.

Abstract

I cambiamenti legati all'obesità nel tessuto adiposo alterano i profili secretori locali e influenzano le interazioni con altre cellule circostanti, comprese le cellule tumorali. La continua fornitura di nutrienti modifica il metabolismo delle cellule adipose, facendole agire come un serbatoio lipidico. Tipicamente, la ricerca sui meccanismi dell'obesità si basa su modelli animali che, tuttavia, non permettono l'analisi dei processi metabolici a livello cellulare. Pertanto, è necessario sviluppare un modello affidabile in vitro dell'obesità umana che possa aiutare a esplorare i cambiamenti nella funzione degli adipociti obesi rispetto ai loro omologhi magri. Questo lavoro presenta un protocollo per la differenziazione degli adipociti umani dai loro precursori (cellule staminali derivate dalle adipose) utilizzando una miscela di insulina, isobutil-1-metilxanthina, desametasone e indometacina. Successivamente, gli adipociti differenziati sono stati incubati con un insieme di acidi grassi, tra cui linoleato, palmitato e oleato, per favorire l'accumulo di lipidi. Di conseguenza, è stato ottenuto un modello prezioso che imita le cellule ipertrofiche in condizioni di obesità, che può essere utilizzato per ulteriori studi.

Introduzione

Si ritiene che l'obesità sia un fattore di rischio importante per una vasta gamma di malattie, come disturbi muscoloscheletrici, malattie cardiovascolari, resistenza all'insulina, sindrome metabolica, diabete e alcuni tipi selezionati dicancro 1. L'obesità è uno dei problemi di salute pubblica più percepibili e sottovalutati, con cause multielementari. In breve, l'obesità è scatenata da uno squilibrio tra calorie consumate e spese, che porta a un aumento dell'accumulo digrasso 2. L'eccesso calorico porta a un'espansione patologica e a una disfunzione del tessuto adiposo (AT), l'elemento chiave nel controllo dell'omeostasi energetica da parte del corpo.

Gli adipociti sono la principale componente cellularedell'AT 3. Il principale contributo alla crescita dell'AT in condizioni di obesità è l'ipertrofia cellulare, cioè l'aumento del volume degli adipociti tramite un incremento della quantità di grasso immagazzinato nel citoplasma sotto forma di gocce lipidiche (LDs)4. Anche se l'obesità è un disturbo patologico complesso, studi sul funzionamento biologico degli adipociti possono servire da modello per analizzarne le cause e esplorare nuove strategie terapeutiche. Ciò evidenzia la necessità di una comprensione più profonda dei meccanismi molecolari che guidano le alterazioni della funzione degli adipociti per sviluppare nuove strategie terapeutiche che mirino alle malattie correlate all'obesità.

I modelli animali sono i più vicini a riflettere condizioni fisiologiche, il che li rende ampiamente utilizzati per studi in vivo sull'obesità5. Tuttavia, trarre conclusioni sui processi biologici fondamentali a livello cellulare rimane altamente difficile in un sistema multistrato, che favorisce l'uso di modelli adipociti in vitro . La ricerca in vitro si basa più spesso sul modello cellulare 3T3-L1 del topo che, in condizioni appropriate, acquisisce un fenotipo6 simile a un adipocito. Tuttavia, a causa della sua origine, questo modello non può essere utilizzato per analisi più complesse, come condizioni di co-coltura con cellule umane, e i risultati non possono sempre essere direttamente tradotti in adipociti umani. Per tutte queste ragioni, si sta cercando un modello che imiti l'obesità negli esseri umani, e l'uso delle cellule staminali derivate dall'adipo umano (ADSC) con la loro successiva differenziazione sembra razionale. Questo modello è quindi più adatto allo studio dell'ipertrofia degli adipociti umani in vitro grazie alla sua bassa complessità. Permette il confronto dei parametri di un singolo tipo di coltura cellulare in condizioni diverse, cosa irraggiungibile in vivo a causa della presenza di molteplici tipi cellulari nel tessuto adiposo.

I preadipociti umani e le cellule staminali derivate dall'adiposo isolati dall'AT sono gli esempi più comuni per studiare la disfunzione di questotessuto 6. Queste cellule, dopo la differenziazione, rappresentano un modello interessante per modulare i livelli di LD negli adipociti tramite ulteriore ingrassamento. Tuttavia, esistono relativamente pochi studi che esaminino l'ipertrofia nelle cellule umane 7,8,9, e la maggior parte utilizza un solo tipo di acido grasso (FA) per indurre l'accumulo di LD.

Questo protocollo propone di integrare gli adipociti umani con una miscela di FA (palmitato, oleato e linoleato) per imitare gli ambienti di obesità. Questo permette di realizzare uno strumento basato su adipociti umani sovraccarichi di lipidi, che possono essere direttamente confrontati con cellule adipose di controllo (ingenue). Questo modello può essere successivamente utilizzato per studiare i cambiamenti fenotipici e funzionali tra adipociti normali e ipertrofici, oppure, se necessario, per esperimenti con condizioni di co-coltura.

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Protocollo

Utilizzare tecniche sterili per eseguire tutti i passaggi del protocollo in un cappuccio di coltura cellulare a flusso laminare. Consulta la Tabella dei Materiali per dettagli su tutti i reagenti e le attrezzature. Il protocollo di differenziazione descritto di seguito è adatto alle cellule staminali umane derivate dall'adiposo e può differire tra altri tipi cellulari e la loro origine. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione degli ADSC per la differenziazione

  1. Preparare il mezzo di crescita ADSC (ADSCs GM): Integrare il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, contenente 1 g/L di glucosio con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM di glutammina e antibiotici - soluzione antimicotica (100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di estreptomicina, 0,25 μg/mL di anfotericina B).
  2. Riscaldare la soluzione GM degli ADSC, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e tripsina/EDTA a 37 °C.
    NOTA: Gli ADSC sono ottenuti da fonti commerciali. Usa le celle nei primi corridoi. Passaggi multipli portano a una diminuzione del potenziale di differenziazione degliADSC 10.
  3. Rimuovere asepticamente il GM degli ADSC dagli ADSC che crescono in una fiaschetta T75 dedicata alla coltura cellulare.
  4. Lava via i residui di ADSC GM risciacquando il piatto di coltura cellulare con 5 mL di PBS.
  5. Rimuovi tutto il volume di PBS dalla fiaschetta.
  6. Aggiungi 2 mL di tripsina/EDTA alla teglia di coltura e incuba a 37 °C finché le cellule non si staccano. Monitora questo processo con un microscopio invertito.
    NOTA: Puntare la ciotola di coltura accelererà il distacco cellulare.
  7. Blocca l'attività della tripsina aggiungendo 6 mL di GM ADSC freschi.
  8. Sposta l'intero volume di sospensione cellulare dalla piastra di coltura a un tubo adatto alla centrifugazione.
  9. Centrifuga le celle a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
  10. Rimuovi il soprannatante.
  11. Sospendere le celle in 2 mL del GM ADSC appena aggiunto.
  12. Calcola la densità e la vitalità cellulare con un emocitometro o un contatore automatico cellulare.
    NOTA: La vitalità cellulare può essere valutata utilizzando la colorazione con colorante blu di tripano.
  13. Semina le cellule nel numero desiderato di pozzi, 15.000 cellule/pozzo, piastra plastica da 96 pozzi in 100 μL di mezzo di crescita ADSC.
    NOTA: Le cellule semi sono sempre in duplicato per ottenere adipociti destinati al controllo e all'incubazione con condizioni di FA. A seconda del tipo di esperimento, gli ADSC possono essere seminati su diversi tipi di piatti o piatti di plastica. La densità di semina raccomandata è di 30.000-60.000 cellule percm2. A seconda del numero di cellule necessario per le analisi successive o gli esperimenti a valle, si regola il formato della piastra di coltura cellulare per piastre a 6 o 12 pozzi.
  14. Coltivare le cellule a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2.
  15. Quando le cellule hanno raggiunto il 100% di confluenza (tipicamente 24-48 ore dopo la placcatura), inducono la loro differenziazione in adipociti seguendo le istruzioni seguenti.
    NOTA: È importante raggiungere un alto livello di confluenza cellulare prima dell'induzione della differenziazione. In altri casi, può influire sull'efficienza della differenziazione. Se per le cellule placcate ci vogliono più di 48 ore per raggiungere un'alta confluenza, cambia il mezzo ogni 3-4 giorni per il nuovo substrato di crescita dell'ADSC.

2. Induzione della differenziazione adipogenica

  1. Preparare il mezzo di differenziazione (DM): integrare il mezzo DMEM/F12 con FBS al 10%, 2 mM glutammina, antibiotici - soluzione antimicotica (100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di estreptomicina, 0,25 μg/mL di anfotericina B), 5 μg/mL di insulina, 0,5 mM di 3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX), 5 μM di desametasone e 200 μM di indometacina.
    NOTA: Prepara DM solo nel volume necessario per un uso diretto. Non conservarla a lungo e usa sempre DM appena preparato. Prima dell'uso, riscaldare il DM in un bagno d'acqua a 37 °C. IBMX e indometacina possono precipitare se vengono aggiunti al mezzo a una temperatura inferiore a 37 °C. Per solubilizzarlo, riscalda il liquido in un bagno-maria a 37 °C.
  2. Rimuovere e scartare asepticamente l'intero volume del mezzo dagli ADSC confluenti.
    NOTA: Il substrato di crescita dell'ADSC dovrebbe essere rimosso completamente prima di aggiungere DM.
  3. Aggiungi con attenzione 100 μL/pozzo di DM alle cellule che crescono in una piastra a 96 pozzi.
    NOTA: Non lasciare che le cellule si secchino quando si cambia il substrato.
  4. Incubare le cellule in incubatrice a una temperatura di 37 °C, 5% di CO2 per 7 giorni.
  5. Rimuovi e scarta l'intero volume di DM dagli ADSC.
  6. Aggiungi con attenzione 100 μL/pozzo di DM fresco alle cellule che crescono in una piastra a 96 pozzi.
  7. Incubare le cellule nell'incubatrice a una temperatura di 37 °C, 5% di CO2, per i successivi 7 giorni.
    NOTA: Il progresso della differenziazione adipogenica può essere rilevato osservando in campo chiaro le vacuole lipidiche presenti nelle cellule indotte.

3. Ingrassamento degli adipociti

  1. Prepara un mezzo di coltura adipocitaria integrato con FA: integrare medium DMEM/F12 con FBS al 10%, 2 mM di glutammina, antibiotici - soluzione antimicotica (100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di estreptomicina, 0,25 μg/mL di anfotericina B), 0,33 mM di linoleato, 0,17 mM di palmato e 0,17 mM di oleato.
  2. Prepara il mezzo di coltura di adipociti controllo: integrare il mezzo DMEM/F12 con FBS al 10%, 2 mM di glutammina, antibiotici - soluzione antimicotica (100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di estreptomicina, 0,25 μg/mL di anfotericina B), albumina sierica bovina allo 0,44% (BSA) e etanolo allo 0,26% (questi ultimi due composti sono stati utilizzati anche come solventi per FA).
    NOTA: Preparare il controllo e integrare con i mezzi di coltura di adipociti FAs solo nel volume necessario per l'uso diretto. Non conservarla per un lungo periodo e usa sempre substrati appena preparati. Prima dell'uso, riscalda il substrato in un bagno d'acqua a 37 °C.
  3. Dopo un totale di 14 giorni di differenziazione, rimuovere e scartare con cura l'intero volume di mezzo DM dagli adipociti differenziati su una piastra a 96 pozzi.
  4. Aggiungere con cura 100 μL/pozzo di mezzo per coltura di adipociti integrato con FA a metà dei pozzi con cellule che crescono in una piastra da 96 pozzi.
  5. Aggiungere con attenzione 100 μL/pozzo di mezzo di coltura di adipociti di controllo nella seconda metà dei pozzi, con le cellule che crescono in una piastra da 96 pozzi.
    NOTA: Non lasciare che le cellule si secchino quando si cambia il substrato.
  6. Incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 per le successive 48 ore.
  7. Dopo 48 ore, utilizzare le cellule di controllo e le cellule incubate con le FA per gli esperimenti successivi.
    NOTA: In questa fase, gli adipociti ingrassati raggiunti possono essere utilizzati per molteplici scopi sperimentali, come la colorazione cellulare, l'analisi del metabolismo cellulare o la co-coltura con altri tipi cellulari.

4. Colorazioni di gocce lipidiche

  1. Prepara il mezzo per coltura adipocitaria: integrare il mezzo DMEM/F12 con FBS al 10%, 2 mM di glutamine e antibiotici - soluzione antimicotica (100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di estreptomicina, 0,25 μg/mL di anfotericina B).
  2. Diluire il colorante fluorescente per colorare le LD nel mezzo di coltura di adipociti in una diluizione di 1:1000.
  3. Rimuovere e scartare l'intero volume del mezzo di coltura di adipociti di controllo e del mezzo di coltura di adipociti integrato con FA provenienti da cellule in crescita in una piastra a 96 pozzi.
  4. Aggiungi con attenzione 50 μL/pozzo di mezzo per coltura di adipociti con colorante fluorescente.
    NOTA: Non lasciare che le cellule si secchino quando si cambia il substrato.
  5. Incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 per 15 minuti.
  6. Lava via il colorante di fluorescenza sostituendolo con il mezzo di coltura adipocitario da 100 μL/pozzo.
  7. Acquisizione dell'immagine nel canale di rilevamento della fluorescenza verde (Ex 427 nm/Em 585 nm) con il microscopio fluorescente.
    NOTA: Questo è il protocollo per la colorazione delle cellule vive. La colorazione può essere eseguita anche dopo la fissazione delle cellule con formaldeide.

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Risultati

Il metodo descritto qui consente la differenziazione degli ADSC umani in adipociti maturi, seguita da un aumento dell'accumulo lipidico, imitando le cellule ipertrofiche osservate in condizioni di obesità. Il corso temporale della differenziazione degli ADSC umani è mostrato nella Figura 1. Al giorno 0, quando le cellule raggiungono il 100% di confluenza (Figura 1A), gli ADSC mostrano una morfologia allungata simile a un fuso. A...

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Discussione

L'attuale protocollo è una procedura replicabile in due fasi per la differenziazione degli ADSC, seguita da incubazione con FAs per ottenere un modello cellulare che imita l'obesità. Il passaggio critico che ne determina l'efficacia è il numero di passaggi degli ADSC dopo il loro isolamento. I passaggi multipli portano a una diminuzione del potenziale di differenziazione di questecellule 10.

Durante la differenziazione degli adipociti, ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Ringraziamenti

L'articolo è stato finanziato dal Centro Nazionale della Scienza della Polonia, con sovvenzioni ricevute da Dorota Nowak (OPUS 22, n. 2021/43/B/NZ3/01458) e Aleksandra Simiczyjew (SONATA, 2020/39/D/NZ5/02330).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX)MerckI5879
0,25% tripsina/0,05% EDTA pH 7,2IITD PAN, Wrocfigure-materials-1aw, Polonia20-500
Piastra a 96 pozziThermo130188
Antibiotici-Soluzione antimicoticaSigma-AldrichA5955
Albumina Sirica Bovina (BSA)Sigma-AldrichA3294
Contatore cellulariN/AN/A
CentrifugaN/AN/A
DesametasoneSigma-AldrichD4902
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)IITD PAN, Wrocfigure-materials-2aw, Polonia10-500contenente 1 g/L di glucosio
Medium Eagle Modificato di Dulbecco: Miscela Nutriente F12Gibco11320-033
EtanoloChempur113964200#1L
Siero fetale bovino (FBS)GibcoA5256701
hADSC Cellule Staminali Umane Derivate dalle AdiposeLonzaPT-5006
IncubatoreN/AN/A
IndometacinaSigma-AldrichI8280-5G
InsulinaSigma-AldrichI9278
Microscopio rovesciatoN/AN/A
L-glutaminaSigma-Aldrich25030-024
Acido linoleico sale di sodioSigma-AldrichL8134
LipidSpot fluorescenteBiotium70065
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Thermo10010023
Soduim oleateSigma-AldrichO7501
Soduim palmatoSigma-AldrichP9767
Fiaschetta di coltura cellulare T75Thermo130190
Blu di tripanoSigma-Aldrich95896HJ

Riferimenti

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