L'RNA circolare ZBTB46 attenua l'apoptosi e lo stress ossidativo nelle cellule endoteliali umane danneggiate da lipopolisaccaridi modulando la segnalazione ERBB2-AKT

Sommario

La lesione renale acuta associata alla sepsi (SA-AKI) è associata a tassi di mortalità considerevoli. Questo studio rileva che circZBTB46 è ridimensionato negli HUVEC indotti da LPS ( SA-AKI in vitro). La sua sovraespressione aumenta la vitalità di HUVEC, riduce apoptosi, infiammazione e stress ossidativo in associazione con la segnalazione ERBB2/AKT, suggerendo un potenziale bersaglio terapeutico rilevante per SA-AKI.

Abstract

Gli RNA circolari sono regolatori emergenti delle risposte allo stress, eppure i loro ruoli nella lesione endoteliale che porta a lesioni renali acute correlate alla sepsi restano incompletamente definite. Abbiamo ipotizzato che l'RNA circolare ZBTB46 (circZBTB46) conferisca protezione endoteliale coinvolgendo la segnalazione ERBB2-AKT. Utilizzando un modello cellulare in cui le cellule endoteliali della vena ombelicale umana sono state sfidate con lipopolisaccaridi, abbiamo quantificato l'espressione di circZBTB46 e testato gli effetti della sua espressione forzata sulla sopravvivenza, l'apoptosi, i mediatori infiammatori e l'omeostasi redox. Saggi di vitalità cellulare e citometria di flusso valutarono la sopravvivenza e l'apoptosi. Saggi immunosorbenti legati a enzimi hanno misurato interleucina-6, fattore di necrosi tumorale α e interleuchina-1β, mentre specie reattive di ossigeno, malondialdeide, superossido dismutasi e catalasi sono stati valutati come indici di danno ossidativo e capacità antiossidante. Per definire il meccanismo, abbiamo eseguito il profiling trascritomico con analisi di arricchimento del set genico, confermato le proteine delle vie tramite Western blotting e valutato la necessità utilizzando l'inibitore ERBB2 AG-825. Lipopolisaccaridi soppressi circZBTB46. La sovraespressione di CircZBTB46 ha aumentato la vitalità, ridotto l'apoptosi, ridotto le citochine pro-infiammatorie e le specie reattive dell'ossigeno, diminuito il malondialdeide e aumentato le attività di superossido dismutasi e catalasi. Le analisi trascrittomiche e proteiche hanno supportato l'attivazione dell'asse ERBB2-AKT, mentre il blocco farmacologico ERBB2 ha attenuato la citoprotezione e invertito i progressi nell'equilibrio redox. Questi risultati identificano circZBTB46 come un freno endogeno sul danno endoteliale indotto da lipopolisaccaridi tramite segnalazione ERBB2-AKT e indicano circZBTB46 come nodo meccanicistico e potenziale bersaglio terapeutico per la lesione renale acuta correlata alla sepsi.

Introduzione

La sepsi, una cascata infiammatoria sistemica potenzialmente letale innescata da invasione patogena, culmina frequentemente in insufficienza^{multiorganica 1}. In questo contesto critico, la SA-AKI emerge come una complicanza predominante e clinicamente significativa nelle unità di terapia^{intensiva 2}. Caratterizzata da un improvviso deterioramento della capacità di filtrazione renale concomitante a un'infezione sistemica, questa condizione mostra tassi di mortalità superiori a quelli dell'AKI non settica del 38%-42% nelle coorti^{cliniche 2}. Si prevede che circa il 60% delle persone diagnosticate con sepsi o shock settico svilupperà^{SA-AKI 3}. Pertanto, la SA-AKI è diventata una sfida importante in terapia intensiva, contribuendo in modo significativo alla morbilità e alla^{mortalità 4}. Attualmente, il meccanismo di SA-AKI rimane incompletamente compreso. Sebbene studi preclinici abbiano coinvolto disfunzioni microcircolatorie, alterazioni nel metabolismo cellulare e squilibri all'interno del sistema renina-angiotensina-aldosterone (RAAS), disfunzioni mitocondriali e disregolazione infiammatoria, il meccanismo fisiopatologico della SA-AKI rimane sfuggente e attualmente mancano misure ottimali a supporto della diagnosi precoce e della gestione^continua 5,6,7,8 . La SA-AKI presenta apoptosi aumentata, stress ossidativo eccessivo e^{infiammazione 9}. All'interno di questo quadro di ricerca, il lipopolisaccaride (LPS) è stato impiegato in un sistema in vitro per imitare le manifestazioni dell'AKI associata alla sepsi nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) per l'esplorazione preliminare del^{bersaglio 5}.

Negli ultimi anni, gli RNA circolari (circRNA), una categoria recentemente identificata di molecole di RNA non codificante, hanno attirato una crescente attenzione per il loro ruolo in varie malattie¹⁰. I circRNA possiedono una struttura circolare stabile e partecipano ai processi fisiologici e patologici cellulari fungendo da spugne molecolari per i microRNA (miRNA), regolando la trascrizione genica o partecipando a interazioni^{proteiche 11}. Le indagini hanno indicato che i circRNA sono coinvolti in modo critico nel modulare l'infiammazione, lo stress ossidativo e le vie apoptotiche, generando così un maggiore focus sulla ricerca sulle possibili implicazioni nella sepsi e nelle condizioni correlate, inclusa la lesione renale^{acuta 12}. Ad esempio, hsa_circ_0072463 è stato identificato come un promettente marcatore diagnostico e bersaglio terapeutico per^{SA-AKI 13}. Circ_001653 fu riportato come un attenuatore di SA-AKI tramite il reclutamento di BUD13-14. Tuttavia, il significato funzionale dei circRNA in SA-AKI rimane in gran parte inesplorato.

Questo studio è stato progettato per esaminare l'influenza di circZBTB46 sulla funzione delle cellule endoteliali, sullo stress ossidativo e sulle risposte infiammatorie utilizzando un sistema SA-AKI in vitro . Costruendo un modello HUVEC indotto da LPS, abbiamo indagato la lesione endoteliale sotto stimolazione endotossica. Va notato che gli HUVEC sfidati con LPS rappresentano un modello di stress endoteliale riduzionista/guidato da TLR4, rilevante ma non equivalente alla fisiopatologia multifattoriale della lesione renale acuta associata alla sepsi. Questo modello cattura principalmente l'attivazione infiammatoria mediata da TLR4, lo stress ossidativo e le risposte endoteliali correlate all'apoptosi, omettendo però componenti chiave in vivo come alterazioni emodinamiche, cascate di complemento e coagulazione, pattern molecolari associati al danno e stimoli microbici eterogenei. All'interno di questo quadro sperimentale, abbiamo indagato se circZBTB46 allevia lo stress ossidativo e l'apoptosi indotti da LPS modulando la via di segnalazione ERBB2, proteggendo così la funzione delle cellule endoteliali. Per quanto ne sappiamo, questo studio fornisce la prima evidenza che collega circZBTB46 alle risposte allo stress endoteliale nel contesto della lesione renale acuta associata alla sepsi. Elucidando i meccanismi molecolari alla base della protezione endoteliale mediata dal circZBTB46, questa ricerca potrebbe approfondire la comprensione dei meccanismi patogeni di SA-AKI e aprire la strada ad approcci terapeutici innovativi basati sul circRNA.

Protocollo

Questo protocollo descrive le procedure sperimentali utilizzate per indagare gli effetti della modulazione circZBTB46 sulla segnalazione infiammatoria, lo stress ossidativo e l'attivazione della via ERBB2-AKT negli HUVEC.

Coltura cellulare
Le cellule HUVEC utilizzate in questo studio sono state ottenute da una fonte commerciale. Gli HUVEC sono stati utilizzati come modello rappresentativo delle cellule endoteliali grazie alla loro ampia disponibilità, alle condizioni di coltura riproducibile e all'elevata efficienza di trasfezione, che facilitano la manipolazione genetica e l'indagine meccanicistica delle vie di segnalazione endoteliale in caso di stress^{infiammatorio 15,16}. Gli HUVEC sono stati coltivati in DMEM integrato con siero fetale bovino al 10% (v/v) e cocktail antibiotico-antimicotico a concentrazione dell'1%. Tutte le colture cellulari sono state mantenute in condizioni fisiologiche standard in una camera umidificata (37 °C, 5%_CO2), che ha promosso una proliferazione cellulare sostenuta preservando al contempo il >95% di vitalità, come confermato dal test di esclusione del blu di tripano. Sebbene i mezzi specifici endoteliali (ad esempio, EGM-2 o M199 integrati con integratori di crescita endoteliale) siano comunemente raccomandati per il mantenimento a lungo termine di HUVEC, in questo studio il DMEM è stato utilizzato per garantire coerenza tra trattamenti sperimentali e compatibilità con la stimolazione LPS e i saggi su inibitori farmacologici. Per gli saggi sugli inibitori dell'AG-825, incubare HUVEC con DMEM fresco contenente 10 μM di AG-825 per 1 ora. Successivamente, si aggiunge la soluzione LPS ai pozzi per ottenere una concentrazione finale di 10 μg/mL e si continua la coltura per 24 ore. Per minimizzare la potenziale deriva fenotipica, gli HUVEC sono stati utilizzati a bassi numeri di passaggio ed esposti a condizioni sperimentali basate su DMEM solo per saghi a breve termine. Tutti gli esperimenti funzionali sono stati condotti entro finestre di trattamento definite piuttosto che durante una coltura prolungata.

Transfezione cellulare
Per chiarire il ruolo biologico di circZBTB46, plasmidi di sovraespressione (oe-circZBTB46) e costrutti di controllo negativi abbinati (oe-NC) sono stati sintetizzati e validati da GenScript. Gli HUVEC sono stati seminati in piastre a 6 pozzi con una densità di 1 x 10⁵ cellule/pozzo e coltivati durante la notte fino a raggiungere il ~70%-80% di confluenza al momento della trasfezione. Per ogni pozzo, 2,5 μg di DNA plasmidico (oe-circZBTB46 o oe-NC) venivano diluiti in 125 μL di mezzo sirico ridotto e mescolati con 2,5 μL di reagente P3000 (tubo A). In parallelo, 3,75 μL di Lipofectamina 3000 sono stati diluiti in 125 μL di mezzo sirico ridotto (Tubo B). Il tubo A e il tubo B sono stati poi combinati, miscelati delicatamente e incubati a temperatura ambiente per 15-20 minuti per permettere la formazione complessiva (volume complesso finale: 250 μL/pozzo). I complessi sono stati aggiunti goccia a goccia alle cellule in un mezzo completo privo di antibiotici. Dopo 6 ore di incubazione a 37 °C, 5% di_CO2, il mezzo di trasfezione è stato sostituito con un mezzo di crescita fresco e completo. Le cellule sono state coltivate per 48 ore prima dei test successivi. Tutte le procedure hanno seguito le istruzioni del produttore.

Modello indotto da LPS
Per generare un modello in vitro SA-AKI, gli HUVEC (5 x 10⁵ cellule/pozzo) trasfettati con oe-circZBTB46 o NC sono stati seminati in piastre da 96 pozzi e mantenuti per 24 ore fino al raggiungimento dell'80% di confluenza. Successivamente, queste cellule sono state trattate con LPS a 10 μg/mL per 24 ore. Gli HUVEC senza trattamento LPS sono stati il gruppo di controllo.

qRT-PCR
L'estrazione totale di RNA dagli HUVEC ha utilizzato un reagente commerciale. La trascrizione inversa per la sintesi del cDNA è stata eseguita con il kit commerciale di reagenti. La PCR quantitativa (qPCR) veniva eseguita in triplicata utilizzando un sistema PCR in tempo reale insieme a un master mix. Le quantità di espressione dei geni target sono state calibrate rispetto a U6, con analisi condotta tramite il metodo 2^{−ΔΔCT 17,18}. Per l'analisi dell'espressione dei circRNA, è stato utilizzato il piccolo RNA nucleare di U6 come riferimento interno per la normalizzazione, poiché è comunemente impiegato per la quantificazione di piccoli RNA non codificanti ed è stato riportato che mostra un'espressione relativamente stabile in condizioni sperimentali in vitro a breve termine. Le sequenze di primer applicate in questo studio sono elencate come segue:

circZBTB46-Avanti: 5'-CGGCGCTCATGAGTAAGAAC-3'

circZBTB46-Retro: 5'-CGCCTCTTCTACAGACTGGG-3'

U6-Attaccante: 5'-TGCTATCACTTCAGCAGCA-3'

U6-Retro: 5'-GAGGTCATGCTAATCTTCTCTCTG-3'.

Test CCK-8
La fattibilità degli HUVEC è stata valutata utilizzando CCK-8 acquistati commercialmente. In breve, le cellule venivano seminate in una piastra a 96 pozzi e le cellule venivano sottoposte a colture di adesione per 24 ore. Dopo ciò, sono stati aggiunti 10 μL di soluzione di CCK-8 a ciascun pozzo e le cellule sono state ulteriormente incubate a 37 °C per 2 ore. Un lettore di microplacche è stato utilizzato per misurare la densità ottica (OD) a una lunghezza d'onda di 450 nm. Le osservazioni preliminari hanno dimostrato che 10 μg/mL di LPS riducevano significativamente la vitalità degli HUVEC, portando alla selezione di questa concentrazione per processi sperimentali successivi.

Citometria a flusso
Inizialmente, gli HUVEC venivano staccati con tripsina priva di EDTA secondo le procedure standard. In conformità con le linee guida del produttore per il kit di analisi sull'apoptosi Annexin V-APC/PI, le sospensioni a celle sono state centrifugate a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C, dopo dissociazione enzimatica. Le celle a pellet sono state poi lavate 2 volte con PBS gelato in condizioni identiche e risospese in 100 μL di tampone di legame 1x. Ogni campione è stato trattato con 5 μL di coniugato Annexin V-FITC e 5 μL di soluzione di colorazione con iodio propidio (PI), seguita da un'incubazione di 10 minuti al buio a temperatura ambiente (20-25 °C). Infine, sono stati aggiunti 400 μL di tampone di legame 1x a tutti i campioni e l'apoptosi è stata analizzata entro 1 ora utilizzando un citometro a flusso. Gli eventi sono stati inizialmente bloccati da FSC/SSC per escludere i detriti. Per l'analisi dell'apoptosi, sono state poi applicate porte quadrantiche sul grafico Annexin V-FITC vs PI utilizzando controlli appropriati (non colorati e controlli a colorazione singola/compensazione) per definire popolazioni vive (Annexin V^-/PI^-), apoptotiche precoce (Annexin V⁺/PI^-), apoptotiche tarde (Annexin V⁺/PI⁺) e necrotiche (Annexin V^-/^PI+). Lo stesso modello di accesso e le stesse soglie sono stati applicati su tutti i campioni.

Saggio ELISA
Le concentrazioni di fattori infiammatori - fattore di necrosi tumorale α (TNF-α), interleucina-6 (IL-6) e interleucina-1β (IL-1β) - nel sovrantante di HUVEC coltivati sono state misurate utilizzando kit ELISA disponibili in commercio. In particolare, secondo le istruzioni del produttore, sono stati utilizzati il kit ELISA TNF-α umano, il kit ELISA IL-6 umano e il kit ELISA IL-1β umano. Per ogni saggio, 50 μL di soprantantante di coltura cellulare non diluita venivano caricati per pozzo. Le curve standard venivano generate utilizzando le diluizioni seriali fornite (TNF-α: 0-1000 pg/mL; IL-6: 0-500 pg/mL; IL-1β: 0-200 pg/mL). Dopo il campione e l'aggiunta standard, le piastre sono state incubate a 37 °C per 90 minuti, seguite da cinque lavaggi con tampone di lavaggio. È stato poi aggiunto un anticorpo di rilevamento coniugato con biotina e incubato a 37 °C per 60 minuti. Dopo un altro passaggio di lavaggio, è stata aggiunta la streptavidina-HRP e incubata a 37 °C per 30 minuti. Dopo un lavaggio finale, è stato aggiunto substrato di 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) e incubato a 37 °C al buio per 15 minuti. La reazione è stata terminata con soluzione di stop e l'assorbanza è stata immediatamente misurata a 450 nm con una lunghezza d'onda di riferimento di 630 nm. Ogni campione e standard veniva analizzato in duplicato, e tutti gli esperimenti includevano tre repliche biologiche indipendenti. I livelli di marcatori di stress ossidativo—malondialdeide (MDA), dismutasi superossido (SOD) e catalasi (CAT)—nel soprantantante sono stati valutati utilizzando rispettivamente il MDA ELISA Kit, SOD ELISA Kit e CAT ELISA Kit, seguendo i protocolli^{forniti 19, 20, 21}. Per gli saggi MDA e SOD, sono stati utilizzati 40 μL di soprantantante per pozzo senza diluizione; per il CAT, i campioni sono stati diluiti 1:10 con tampone per il test prima del caricamento. Le curve standard furono preparate secondo le specifiche del kit (MDA: 0-60 nmol/mL; SOD: 0-100 U/mL; TAC: 0-100 U/mL). I passaggi di incubazione sono stati eseguiti come segue: MDA - 60 min a 37 °C; SOD - 60 min a 37 °C; CAT: 30 min a 37 °C. Le piastre sono state lavate 4 volte tra una fase chiave di incubazione. Lo sviluppo del colore è stato ottenuto aggiungendo i rispettivi substrati e incubando a 37 °C (MDA: 15 min; SOD: 20 min; CAT: 15 min). L'assorbanza è stata rilevata a 450 nm per SOD e CAT, e a 532 nm per MDA. Tutte le misurazioni sono state effettuate in pozzi duplicati e ripetute su tre repliche biologiche indipendenti.

Sequenziamento dell'RNA
L'RNA totale veniva estratto dagli HUVEC utilizzando reagenti commerciali secondo le istruzioni del produttore. La purezza e la concentrazione dell'RNA sono state valutate utilizzando uno spettrofotometro misurando l'assorbanza a 260 nm e 280 nm (A260/A280), e l'integrità dell'RNA è stata verificata con un bioanalizzatrice. Solo campioni di RNA con un RNA Integrity Number (RIN) ≥ 7 sono stati utilizzati per la successiva preparazione della libreria. L'RNA ribosomico è stato rimosso durante la preparazione della biblioteca utilizzando una procedura standard di deplezione dell'rRNA eseguita da una società commerciale. Dove necessario, il trattamento RNase R è stato applicato prima della costruzione della libreria per digerire selettivamente gli RNA lineari e arricchire le specie di RNA circolari. La frammentazione dell'RNA è stata poi eseguita a temperature elevate seguendo il protocollo standard del manuale del Kit di Preparazione della Biblioteca di RNA per generare frammenti di RNA di dimensioni adeguate. Le librerie di sequenziamento venivano preparate utilizzando il RNA Library Preparation Kit secondo le istruzioni del produttore e sequenziate su una piattaforma Illumina utilizzando una strategia di sequenziamento a estremità abbinata con una lunghezza di lettura di 150 bp (PE150). La profondità di sequenziamento era sufficiente a supportare l'analisi a livello di trascritoma. Le letture di sequenziamento grezzo venivano processate utilizzando procedure standard di controllo qualità per rimuovere sequenze di adattatori e letture di bassa qualità. Le letture pulite sono state allineate al genoma di riferimento umano e i livelli di espressione genica sono stati quantificati di^{conseguenza 22,23}. I geni differenzialmente espressi (DEG) tra gli HUVEC circZBTB46 sovraespressivi e quelli trattati con NC sotto stimolazione LPS sono stati identificati utilizzando metodi statistici consolidati. L'analisi dell'arricchimento dei set genici (GSEA) è stata effettuata per identificare le vie di segnalazione associate alla sovraespressione di circZBTB46. I geni sono stati classificati in base all'espressione differenziale tra i gruppi sperimentali. Per l'analisi di arricchimento sono stati utilizzati set genici selezionati dal Molecular Signatures Database (MSigDB). La significatività dell'arricchimento è stata valutata sulla base del punteggio di arricchimento normalizzato (NES) e del tasso di false scoperte (FDR), con FDR < 0,25 considerato statisticamente significativo. Il sequenziamento del circRNA e tutte le relative analisi bioinformatiche sono stati esternalizzati.

Identificazione dei DEG
Per selezionare i DEG, i livelli di espressione tra due gruppi distinti venivano messi a confronto tramite il pacchetto software DESeq (2012) R. Le soglie per la significatività statistica sono state definite come p < 0,05 con un |log2FC| valore superiore a 0,58. La heatmap è stata generata dal pacchetto pheatmap R, e il grafico del vulcano ha utilizzato il pacchetto Goplot2 R per il disegno.

Analisi dell'arricchimento funzionale
Le analisi di arricchimento GO e KEGG derivate da trascrizioni lineari sono state condotte utilizzando la piattaforma online EnrichR, e il Bubble Chart è stato disegnato basandosi sul pacchetto GOplot R. Il software GSEA è stato utilizzato, basato sulla matrice di espressione e sui file del set genico forniti dal database MSigDB, con parametri di analisi impostati (ad esempio, numero di permutazioni e metodi statistici). L'arricchimento dei set genici è stato valutato utilizzando il punteggio di arricchimento normalizzato (NES), il valore P e il valore FDR, fornendo un'esplorazione approfondita delle funzioni e dei potenziali meccanismi biologici dei geni espressi differenzialmente.

Tachia occidentale
La proteina totale è stata estratta dagli HUVEC (circa 1 x 10⁶ cellule) utilizzando il tampone di lisi RIPA integrato con inibitori di proteasi e fosfatasi. La concentrazione proteica è stata determinata con un BCA Protein Quantification Kit. Quantità uguali di proteine (20 μg per corsia) sono state risolte tramite elettroforesi su gel di dodecil-poliacrilammide al 10% (SDS-PAGE) a 80 V per 30 minuti, seguiti da 120 V per 60 minuti. Successivamente, le proteine sono state trasferite alle membrane di polivinilidene fluoruro (PVDF) utilizzando un sistema di trasferimento a umido a 100 V per 90 minuti a 4 °C. Le membrane sono state bloccate con il 5% di latte scremo in soluzione salina Tris-buffer con 0,1% Tween-20 (TBST) per 1 ora a temperatura ambiente, seguita da incubazione con anticorpi primari diluiti nello stesso tampone bloccante (tipicamente 1:1000 per le proteine target e 1:5000 per GAPDH) a 4 °C durante la notte. Gli anticorpi principali utilizzati erano i seguenti: ERBB2, p-AKT, AKT e GAPDH. Dopo l'incubazione, le membrane sono state lavate 3 volte (10 min per lavaggio) con TBST e poi incubate con un anticorpo secondario anti-coniglio IgG coniugato con perossidasi di rafano (HRP) (1:5000 in buffer bloccante) per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo tre ulteriori lavaggi TBST (10 min ciascuno), le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un kit di substrato Western Blotting a Chemiluminescence Enhanced (ECL) e fotografiate con un sistema di imaging. Le intensità delle bande sono state quantificate tramite software.

Analisi statistica
Le valutazioni statistiche sono state effettuate utilizzando GraphPad Prism 10. I dati sono visualizzati come mezzi ± errore standard delle medie (SEM). È stato definito un p-valore < 0,05 per indicare la significanza statistica.

Risultati

Analisi qRT-PCR dell'espressione circZBTB46 in un modello in vitro SA-AKI
Questo insieme di esperimenti è stato condotto per testare l'ipotesi che l'espressione di circZBTB46 sia alterata durante la stimolazione LPS e che la modulazione di circZBTB46 influenzi la vitalità delle cellule endoteliali e l'apoptosi in un modello in vitro SA-AKI. Inizialmente, l...

Discussione

Durante la sepsi, i pattern molecolari associati al patogeno (PAMP), come il LPS rilasciato dai patogeni, attivano recettori simili al Toll (ad esempio, TLR4), avviando una risposta infiammatoria^{sistemica 26}. Questo processo innesca la secrezione di molteplici mediatori pro-infiammatori, come TNF-α, IL-6 e IL-1β, dando origine a una tempesta di^{citochine 27}. Contemporaneamente, la LPS danneggia direttamente le cellule endoteliali vascolare, ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
AG-825 (inibitore di ErbB2)	MedChemExpress	HY-10197	10 & mu; M per blocco del percorso
Bioanalizzatore Agilent 2100	Agilent	G2939BA	Integrità dell'RNA (RIN≥ 7)
Anticorpo AKT	Proteintech	60203-2-IG	WB (1:15000)
Kit di apoptosi Annexin V-APC/PI	Elabscience	E-CK-A327	Rilevamento dell'apoptosi
Antibiotico-Antimicotici	Gibco	15240062	Concentrazione dell'1%
Kit di quantificazione delle proteine BCA	Beyotime	P0012	Concentrazione proteica
CAT ELISA Kit	MEIMIANA	MM-0897H2	Enzima antiossidante
CCK-8 Kit	Dojindo	CK04	Saggio di viabilità cellulare
CircRNA seq	Fuzhou Huarong Kehui Biotechnology Co., Ltd.	PE150	Sequenziamento del circRNA e tutte le analisi bioinformatiche associate
Citometro a flusso CytoFLEX	Beckman Coulter	B53000	Analisi dell'apoptosi
DMEM	Gibco (Invitrogen)	11965092	Mezzo di coltura cellulare
Kit di substrato ECL	Millipore	WBKLS0100	Rilevamento delle proteine
Anticorpo ERBB2	Sino Biologico	100271-T32	WB (1:10000)
Siero Fetale Bovino (FBS)	Industrie biologiche	04-001-1ACS	Integratore al 10% (v/v)
Anticorpi GAPDH	Proteintech	60004-1-IG	WB (1:50000)
HUVEC	Sistema Procell	CP-H082	Origine della linea cellulare
IL-1 e beta; ELISA Kit	MEIMIANA	MM-0181H2	Fattore infiammatorio
IL-6 ELISA Kit	MEIMIANA	MM-0049H2	Fattore infiammatorio
Illumina NovaSeq 6000	Illumina	20012850	Sequenziamento dell'RNA
Lipofectamina 3000	Invitrogen	L3000008	Reagente di trasfezione
LPS (E. coli O111:B4)	Sigma-Aldrich	L2630	10 & mu; g/mL per il modello SA-AKI
MDA ELISA Kit	MEIMIANA	MM-2037H2	Marcatore di stress ossidativo
NanoDrop 2000	Thermo Fisher	ND-2000	Quantificazione dell'RNA
Kit NEBNext Ultra II per la Libreria RNA	NEB	E7770S	Preparazione della libreria RNA-seq
plasmide oe-circZBTB46	GenScript	Sintesi personalizzata	Vettore di sovraespressione circZBTB46
Plasmide OE-NC	GenScript	Sintesi personalizzata	Vettore di controllo negativo
Anticorpo p-AKT (Ser473)	Proteintech	66444-1-IG	WB (1:1200)
Kit di reagenti PrimeScript RT	Takara	RR047A	Sintesi del cDNA
Membrane PVDF	Millipore	IPVH00010	Trasferimento di Western Blot
Sistema QuantStudio 5	Thermo Fisher	A28137	PCR in tempo reale
Ribonucleasi R	Lucigen	RNR07250	Rimozione dell'rRNA
Buffer di lisi RIPA	Beyotime	P0013B	Estrazione proteica
RNAiso Plus	Takara	9109	Estrazione totale di RNA
SOD ELISA Kit	MEIMIANA	MM-25469H2	Enzima antiossidante
TB Green Premix Ex Taq	Takara	RR420A	Reagente qPCR
TNF-α ELISA Kit	MEIMIANA	MM-0122H2	Fattore infiammatorio