Articolo di ricerca

Quantificazione PCR in tempo reale del DNA batterico del complesso rosso e dello stato parodontale in chi porta dentiere parziale rimovibile

DOI:

10.3791/69774

⸱

2 gennaio 2026

 ,  , 
1Department of Prosthodontics, Dental School, Faculty of Medicine, University of Prishtina, 2Department of Reconstructive Dentistry and Gerodontology, School of Dental Medicine, University of Bern, 3Oral Implantology Research Institute, 4School of Dental Medicine, University of Zagreb

In questo articolo

Sommario

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La reazione a catena della polimerasi in tempo reale (PCR) è stata utilizzata per quantificare il DNA dei batteri rossi complessi nei portatori di dentiere parziali rimovibili (RPD). Questo studio promette un approccio innovativo alle future strategie di trattamento protesiche per questi pazienti, considerando il ruolo di questi batteri nello sviluppo della peri-implantite.

Abstract

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L'inserimento di dentiere parziali rimovibili (DPR) nella cavità orale è associata a cambiamenti nella microflora orale nel tempo. Tuttavia, esiste una scarsità di letteratura che esamini la presenza di batteri del complesso rosso (RCB) in questi pazienti. Dato il ruolo consolidato della RCB nello sviluppo della parodontite, della peri-implantite e di varie malattie sistemiche, è fondamentale indagare sull'impatto delle DPR su questi batteri. Questo studio mira a quantificare il carico subgingivole dei denti da pilastre in RCB-Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia e Treponema denticola-in di pazienti parzialmente edentuli riabilitati con RPD, utilizzando reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR). Un obiettivo secondario era valutare lo stato parodontale dei denti da sostegno e di quelli non da spalla e determinare le correlazioni tra carico microbico e indici parodontali clinici.

Sono stati iscritti trenta partecipanti che necessitavano di RPD. L'acido desossiribonucleico (DNA) è stato isolato da campioni batterici ottenuti dai denti del pilone prima di (T0) e 3 mesi dopo l'inserimento (T3). La quantificazione RCB è stata eseguita tramite RT-PCR ed espressa come "Lg (equivalenti genomici/campione)". I parametri clinici - indice di placca (PI), indice gengivale (GI), profondità di sondaggio (PD) e mobilità dentale (TM) - sono stati registrati sia per i denti con il sostegno che per quelli non abuttati in entrambi i momenti.

I denti del pilastro hanno mostrato aumenti statisticamente significativi dei carichi RCB in tutte e tre le specie target da T0 a T3: P. gingivalis (1,99 ± 2,01 contro 3,64 ± 2,21, p = 0,00003), T. forsythia (2,20 ± 2,17 contro 3,56 ± 2,33, p = 0,00009) e T. denticola (0,82 ± 1,41 contro 2,35 ± 2,21, p = 0,0001). Sebbene i parametri parodontali fossero elevati tra denti a sostegno e non a pilone dopo il trattamento, le differenze non hanno raggiunto significatività statistica. Tra i patogeni, T. forsythia ha mostrato la correlazione positiva più forte con gli indici parodontali.

L'uso a breve termine delle RPD è associato a un aumento significativo della colonizzazione RCB dei denti del pile, suggerendo cambiamenti microbici e infiammatori precoci che potrebbero precedere una manifesta degradazione parodontale clinica.

Introduzione

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La cavità orale ospita un microbioma dinamico il cui equilibrio ecologico è fondamentale per mantenere la saluteparodontale 1. La perturbazione di questa omeostasi microbica, dovuta a fattori endogeni ed esogeni, può alterare l'omeostasi microbica, creando condizioni favorevoli alla crescita di batteri patogeni, inclusi patogeni parodontali come Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia e Treponema denticola, collettivamente definiti batteri del complesso rosso (RCB)2. Questi patogeni sono fondamentali nella patogenesi della parodontite e della peri-implantite, agendo in sinergia per eludere le difese dell'ospite, promuovere l'infiammazione e facilitare la distruzione dei tessuti parodontali, spesso portando alla perdita dei denti 3,4. La perdita dei denti influisce negativamente sulla capacità di mangiare e parlare, contribuendo a una diminuzione della fiducia in sé stessi e del benessere, aumentando così la necessità di compensazione protesica. Tra i metodi più comuni impiegati, soprattutto negli anziani a causa di varie condizioni locali e generali, è il trattamento protesico con dentiere parziali rimovibili (DPR). Tuttavia, col tempo, i RPD5 possono portare a una varietà di problemi.

Prove solide suggeriscono che l'uso delle DPR può causare accumulo di placca dentale e lo sviluppo di infiammazione delle gengive e dei tessuti parodontali, in particolare nei denti delpendente 6,7,8,9,10. Tuttavia, la comparsa di tali disturbi orali dipende anche dall'impegno del paziente verso l'igiene orale così come dalla cura e manutenzione delladentiera 11,12,13,14. Bassi et al. hanno sottolineato nelle loro ricerche l'importanza di controllare la placca dentale. Hanno esaminato pazienti che avevano portato le RPD per un periodo di 6-12 anni e hanno riscontrato che la condizione parodontale dei denti a spalla era simile a quella dei denti non a spalla nei casi con regolare igiene orale. Al contrario, la condizione parodontale è peggiorata nel gruppo di pazienti che non ha dato importanza al follow-up e al mantenimento dell'igieneorale 13.

Nonostante i vantaggi funzionali delle DPR, la loro inserzione nella cavità orale ostacola il libero flusso della saliva, predisponendo alla formazione di uno strato pellicoloso sulla superficie della protesi che può portare alla colonizzazione batterica. Sono stati identificati diversi tipi di batteri nocivi nei pazienti conPRPD 15. Studi recenti hanno dimostrato che i livelli di patogeni che causano infezioni associati alla carie dentale, come Streptococcusmutans 16, così come quelli di Staphylococcus aureus17, possono aumentare significativamente dopo la posazione delle dentiere. Oltre a funzionare come indicatore dello stato della mucosa orale, le variazioni del livello di batteri derivanti dall'uso delle DPR possono anche portare allo sviluppo di malattie dentali nei dentirimanenti 18. Pertanto, se i pazienti trascurano di mantenere correttamente i loro DPR, possono formarsi condizioni anaerobiche sotto la base della dentiera, che possono portare a una crescita eccessiva di batteri patogeni. Alcuni tipi di patogeni parodontali possono entrare nella circolazione sanguigna generale attraverso il portale orofaringeo, rappresentando un considerevole fattore di rischio per lo sviluppo di varie malattiesistemiche 19,20.

Tuttavia, esistono ancora scarsità di studi sui cambiamenti microbiologici nel solco gengivale dei denti del pilastro nei pazienti conRPDs 21,22,23,24. Tra i pochi studi su questo argomento sono stati utilizzati metodi convenzionali per la rilevazione dei patogeni parodontali, tra cui il test BANA-ZymeTM e il metodo della coltura. Considerando che la maggior parte dei patogeni parodontali sono anaerobi facoltatori, l'uso di tali metodi può causare difficoltà nella loro coltivazione, poiché in questo contesto sono necessarie condizioni di alta intensità riducente e per cui l'ossigeno ètossico 25. Inoltre, la letteratura odontoiatrica disponibile non ha ancora affrontato in modo soddisfacente la relazione tra tali patogeni e i diversi indici parodontali in questa prospettiva.

Pertanto, per superare i limiti della coltura microbica convenzionale e migliorare la precisione diagnostica, questo studio ha utilizzato la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR) per quantificare le cariche batteriche del complesso rosso (RCB) nei denti del pilone dei portatori di RPD. Parallelamente, lo stato parodontale sia dei denti dell'abutment che di quelli non abutment è stato valutato utilizzando indici clinici standardizzati. Lo studio ha inoltre indagato le correlazioni tra carico batterico e parametri parodontali per chiarire meglio l'interazione biologica tra l'uso protesico e la disbiosi microbica.

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Protocollo

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Questo studio ha incluso 30 pazienti parzialmente edentuli che hanno cercato cure protesistiche presso la Clinic of Dental Protetics del University Dentistry Clinical Center of Kosovo, tra settembre 2021 e marzo 2022. L'approvazione etica è stata ottenuta dal comitato di revisione istituzionale (Approvazione n. 378/19) e tutte le procedure hanno rispettato i principi della Dichiarazione di Helsinki. È stato ottenuto il consenso informato scritto da tutti i partecipanti.

La dimensione del campione è stata determinata sulla base di ricerche precedenti, che indicano che da 11 a 30 partecipanti sono sufficienti per ottenere risultati significativi nei parametri microbici e parodontali tra i portatori diRPD 21,23. Assumendo un test t accoppiato a due code con un livello alfa di 0,05, l'analisi di potenza ha indicato che un campione di 28 partecipanti fornirebbe l'80% di potenza per rilevare una differenza statisticamente significativa di questa magnitudine. Per tenere conto dei potenziali abbandoni, abbiamo iscritto 30 partecipanti. Inoltre, un periodo di follow-up di tre mesi è stato sufficiente per osservare un aumento del carico batterico in questipazienti 24.

I pazienti idonei erano i primi utilizzatori di protesi, presentandosi sia con dentizione naturale adiacente che antagonista. I criteri di esclusione includevano: profondità di sondaggio >4 mm, stato immunodepresso (ad esempio, chemioterapia), uso di antibiotici negli ultimi 90 giorni, fumo pesante (>25 sigarette al giorno) e deficit cognitivo che ostacolano la comprensione delle procedure RPD.

Tutti i partecipanti hanno ricevuto RPD a fermaglio con fermaglio realizzati con una struttura in metallo cobalto-cromo e resina acrilica (polimetilmetacrilato). Il design di ogni RPD è stato personalizzato in base alla classificazione dell'edentulismo, alla qualità della cresta residua e a considerazioni biomeccaniche.

Procedura di raccolta del campione

La raccolta del campione è stata effettuata esclusivamente sui denti di spalle delle dentiere parziali rimovibili (RPD) tra i punti temporali T0 e T3. Ai partecipanti è stato inizialmente chiesto di fare gargarismi accurati con acqua per eliminare eventuali residui alimentari. Prima della raccolta del campione, il dente del pilone selezionato veniva isolato utilizzando rotoli di cotone per mantenere un ambiente di lavoro asciutto. Due punte sterili di carta (n. 35; 04 affusolate) sono state inserite nel solco gengivale sulle parti mesiale e distale della superficie buccale del dente e lasciate in posizione per 1 minuto. I punti di carta venivano poi trasferiti in un microtubo sterile contenente 1,5 mL di soluzione salina normale e trasportati in un laboratorio microbiologico designato. I campioni venivano conservati a -20°C fino al processo di isolamento del DNA.

Preparazione e amplificazione del DNA batterico:

Il test Parodontoscreen (Tabella dei Materiali) è stato utilizzato per identificare T. denticola, T. forsythia e P. gingivalis utilizzandoRT-PCR 26. Il test consiste in: preparazione del DNA; amplificazione PCR in tempo reale usando reagenti specifici (una miscela per l'amplificazione batterica universale, una miscela per l'amplificazione batterica opportunistica e una miscela per l'amplificazione genomica del DNA umano); e la registrazione e interpretazione dei risultati dell'amplificazione.

L'estrazione del DNA è stata effettuata utilizzando un kit di estrazione del DNA (Tabella dei Materiali), seguendo le linee guida del produttore per garantire la massima qualità del DNA. Il test utilizza analisi qualitativa PCR in tempo reale con una miscela PCR sigillata in paraffina. Questa combinazione include un Controllo Interno per verificare la validità dell'esecuzione PCR e un Controllo di Assunzione del Campione (SIC) per valutare la qualità dell'estrazione e confermare DNA sufficiente per un'amplificazione accurata.

L'amplificazione PCR è stata eseguita utilizzando strisce e condensatori specializzati, con reagenti che includevano soluzione di Taq-polimerasi, miscela master sotto strato di paraffina, campione di DNA e olio minerale. Il programma PCR è il seguente: (i) denaturazione iniziale a 80 °C per 30 secondi, (ii) denaturazione a 94 °C per 1 min 30 s, (iii) 5 cicli da 30 s a 94 °C (denaturazione), 15 s a 64 °C (legame e allungamento del primer per rilevamento), (iv) 45 cicli di 10 s a 94 °C (denaturazione), 15 s a 64°C (legame e allungamento dell'innesco, rilevamento della fluorescenza), (v) 5 s a 94 °C (denaturazione finale).

La rilevazione della fluorescenza veniva effettuata sui canali di rilevamento Fam e Hex, ad eccezione del tubo n. 5, che conteneva il marcatore (dove la fluorescenza veniva rilevata sui canali Fam e Rox). Il processo di amplificazione è stato condotto utilizzando ciclatori termici in tempo reale (Tabella dei Materiali). Il Software RealTime dello strumento (versione 7.9) è stato utilizzato per la registrazione automatica, l'interpretazione e l'analisi quantitativa dei dati di amplificazione PCR, consentendo una stima precisa del carico patogeno.

I carichi microbici erano rappresentati come "Lg (equivalenti genomici/campione)". I risultati sono stati presentati in tre intervalli nel referto del test Parodontoscreen per ciascun paziente, basati sui livelli di carico batterico come segue: P. gingivalis (normale <5,0; moderato ≥5,0; grave >6,0); T. forsizia (normale <5,0; moderata ≥5,0; grave >5,5); e T. denticola (normale <3,5; moderata ≥3,5; grave >5,0).

Esame clinico

L'esame clinico includeva un esame dettagliato delle condizioni parodontali dei denti a sostegno e non a spalla a T0 e T3. L'indice della placca (PI) è stato valutato utilizzando una sonda dentale secondo i criteri Silness-Loe (0-3)27. La condizione gengivale è stata valutata in sei punti sulla superficie del dente utilizzando l'indice gengivale (IG) secondo i seguenti criteri: 0, nessuna infiammazione; 1, lieve infiammazione; 2, infiammazione con sanguinamento gengivale durante il sondaggio; 3, infiammazione grave con possibile sanguinamento gengivalespontaneo 28.

La profondità di sondaggio (PD) è stata misurata utilizzando la sonda Williams dal margine gengivale fino all'estremità della profondità clinicadella tasca 29. La mobilità dentale (TM) è stata determinata dalla palpazione bimanuale nelle direzioni orizzontale e verticale, secondo il criterio30 di Miller.

Tutti i partecipanti allo studio hanno ricevuto un adeguato trattamento parodontale non chirurgico prima dell'esame clinico, inclusa la rimozione della placca dentale e del calcolo attraverso la decalcazione a ultrasuoni. I soggetti sono stati inoltre istruiti nelle procedure di igiene orale, come lavarsi i denti e pulire le dentiere, oltre a ricevere consigli sulla rimozione delle dentiere durante la notte.

Analisi statistica

I dati sono stati analizzati utilizzando Microsoft Excel e IBM SPSS Statistics for Windows. Sono state calcolate statistiche descrittive (media, deviazione standard e intervallo) per età, carichi microbici e indici parodontali, inclusi PI, GI, PD e TM. Le variazioni nei parametri clinici e microbiologici tra prima di (T0) e 3 mesi dopo l'inserimento (T3) sono state valutate utilizzando il test Wilcoxon con rango segnato per dati non parametrici accoppiati. Il test esatto di Fisher (simulazione di Monte Carlo, a due lati) è stato utilizzato per valutare dati categorici relativi alla classificazione del carico microbico. Il coefficiente di correlazione di rango (ρ) di Spearman è stato utilizzato per valutare le associazioni tra carichi microbici e parametri parodontali. Un valore p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo per tutte le analisi.

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Risultati

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Demografia dei partecipanti

La Tabella 1 presenta la distribuzione dei parametri demografici. Dei 30 partecipanti, 16 erano maschi (53,3%) e 14 femmine (46,7%). L'età media dei partecipanti era di 64,6 anni, con un intervallo da 48 a 76 anni. Ulteriori dettagli riguardanti la demografia sociale sono forniti nella Tabella 1.

Esame clinico

La Tabella 2 most...

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Discussione

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Mantenere un'igiene orale ottimale diventa sempre più difficile con l'età, a causa della ridotta reattività immunitaria e delle limitazioni meccaniche imposte da protesi come i DPR a fermaglio. Queste condizioni favoriscono l'accumulo di biofilm patogeni, in particolare intorno ai denti del pilone, che fungono da strutture portanti critiche ma sono anche vulnerabili al deterioramento parodontale. Questo studio ha cercato di affrontare queste preoccupazioni quantificando i carichi di batt...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubi microcentrifughe da 1,5 mL con blocco di sicurezzaBiotekMT1.5/100
Pinzette dentaliBader17/4021-1
Ciclatori termici DTprime in tempo realeDNA-TecnologiaCiclatori termici in tempo reale
IBM SPSS IBM CorpVersione 21.0 
Microsoft Excel Microsoft Office 2010
Punti cartacei (n. 35; 04 affusolati)DiaDentMP210-602
Kit di rilevamento PCR in tempo reale ParodontoScreenDNA-TecnologiaR1-P808-S3/5EU
Sonda parodontaleMEDESY548/9PT
PREP-GS PLUSDNA-TecnologiaP-003/2EUkit di estrazione del DNA  
Software in tempo realeDNA-TecnologiaVersione 7.9
Cloruro di sodio 0,9%VIOSER

Riferimenti

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