Articolo metodologico

Una piattaforma innovativa per lo stretching e l'imaging cellulare in vitro

DOI:

10.3791/69779

⸱

10 marzo 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Northeastern University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un dispositivo innovativo che applica forme d'onda di deformazione isotrope e uniassiali alle cellule, supportando al contempo la coltura su substrati con rigidità sintonizzabile e matrici proteiche personalizzabili. Questa piattaforma semplice ed economica consente ai ricercatori di indagare come i segnali meccanici regoli la funzione cellulare sia in studi fondamentali che in contesti rilevanti per la malattia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule rispondono a segnali meccanici provenienti dal loro ambiente, come i cambiamenti nella rigidità della matrice extracellulare (ECM) e lo sforzo ciclico, che regolano processi cellulari tra cui la determinazione del destino cellulare, la comunicazione intercellulare e lo sviluppo. Alterazioni in queste forze contribuiscono o guidano la progressione della malattia in condizioni come asma, ipertensione e cancro. Sebbene i dispositivi di stretching in vitro esistenti possano imporre deformazioni uniaxiali o isotrope, spesso utilizzano rigidità non fisiologiche, limitano l'imaging dal vivo o non possono raggiungere ampiezze di deformazione elevate rilevanti per condizioni fisiologiche e patologiche. Qui presentiamo un dispositivo compatto compatibile con il microscopio che applica una tensione isotropa o uniaxiale controllata alle cellule aderenti su piastre di coltura elastomeriche. Questi piatti presentano un modulo di Young sintonizzabile e sono compatibili con una varietà di rivestimenti proteici a matrice per l'adesione cellulare, consentendo una modulazione indipendente della rigidità del substrato e della composizione ECM. È importante sottolineare che la facilità di utilizzo del dispositivo è facilitata dal suo design azionato da motori passo-passo, che supporta la generazione di forme d'onda cicliche programmabili. Dimostriamo la capacità del dispositivo quantificando la dinamica intracellulare del calcio e le forze di trazione cellulari nelle cellule muscolari lisce delle vie aeree primarie umane sotto stretching meccanico. Questa piattaforma fornisce uno strumento versatile per indagare l'effetto dei segnali meccanici sulla funzione cellulare sia in contesti sani che rilevanti per la malattia.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule sperimentano forze meccaniche provenienti dall'ambiente circostante che svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione di molti aspetti della funzione cellulare, tra cui determinare il destinocellulare 1,2, la comunicazioneintercellulare 3,4 e la crescitasana 2,5. Inoltre, cambiamenti in queste forze meccaniche possono portare a un aumento della progressione della malattia e all'insorgenza della malattia, inclusi il rimodellamento della matrice extracellulare(ECM) 6 e la crescitatumorale 7,8,9,10. Le cellule possono percepire e rispondere a questi segnali meccanici, che includono cambiamenti nella rigiditàdell'ECM 4, così come la tensione ciclica in organi come cuore, polmoni emuscoli 11,12. Gli studi in vitro hanno dimostrato che la rigidità e la composizione dell'ECM possono influenzare la rigidità del citoscheletro cellulare, sia a riposo che dopo l'esposizione agli agonisticontrattili 13. Numerosi studi in vitro e in situ hanno esaminato come le tensioni transitorie, statiche e cicliche influenzino cellule e tessuti, mostrando che le risposte variano in base al tipo, alla velocità e all'ampiezzadella deformazione 14. Ad esempio, studi recenti hanno rilevato che uno stiramento temporaneo riduce la rigidità delle cellule aderenti in proporzione alla deformazione applicata, in cui un aumento sostenuto della deformazione porta a un rapido incremento iniziale della rigidità, seguito da un rilassamentograduale 15. Inoltre, la segnalazione del calcio, il principale regolatore molecolare della generazione delle forze, è influenzata dallo stiramento e da altre forzemeccaniche 4,16,17,18,19,20. Studiare come rigidità e sforzo influenzino le vie meccanobiologiche richiede di modulare entrambi i fattori mentre si monitorano le risposte cellulari. Pertanto, abbiamo sviluppato un nuovo stretcher cellulare compatibile con microscopio in grado di indurre sia allungamento isotropo che uniassiale, con controllo indipendente sulla rigidità del substrato, sul rivestimento proteico della matrice e su una gamma di forme d'onda programmabili.

In passato, i ricercatori hanno creato dispositivi simili per imporre movimenti specifici e allungamenti meccanici sulle colture cellulari e suitessuti 21,22. Il caso più semplice, il moto uniaxiale, è uno stiramento meccanico imposto a una singola dimensione. Ad esempio, sono stati sviluppati alcuni dispositivi per imporre allungamento meccanico e sforzo sulle strisce tissutali23 e sulle fibre di collagene24, oppure per allineare l'orientamento cellulare e indurre la migrazionecellulare 25. Lo stiramento isotropo si riferisce a un tipo di stiramento in cui una forza uguale viene applicata a un gel o a un substrato da tutte le direzioni, risultando in una deformazione uniforme sul materiale. Questo allungamento simula la distribuzione uniforme delle forze che le cellule sperimentano in determinati ambienti fisiologici, come all'interno degli alveoli dei polmoni, dove le cellule sono soggette a espansione e contrazione radiale durante il processorespiratorio 26,27.

I dispositivi di barella esistenti presentano diverse limitazioni che ne limitano l'uso nella ricerca legata alla meccanobiologia. Molti progetti utilizzano valori di rigidità del substrato superiori al tipico intervallo fisiologico per resistere allo sforzo meccanico e sostenere il peso del mezzo di colturacellulare 28. Tuttavia, l'uso di tale rigidità non fisiologica può anche influenzare il comportamento cellulare, limitando potenzialmente la rilevanza del modello agli ambienti tissutalinaturali 29. Inoltre, alcuni modelli di barella ostruiscono il percorso obiettivo o luminoso, impedendo l'immagini, mentre altri utilizzano membrane troppo spesse per un'osservazionechiara 28. Anche quando i barallatori sono compatibili con i microscopi e utilizzano substrati sottili, sono comuni problemi come l'affondamento della membrana e la perdita di messa a fuoco. Piattaforme commerciali come Flexcell utilizzano deformazioni basate sul vuoto per allungare membrane flessibili. Sebbene questo approccio possa generare campi di deformazione stabili e omogenei, non è ottimizzato per la microscopia a cellule vive e configurazioni compatibili con microscopio richiedono costosi accessori aggiuntivi. Inoltre, queste piattaforme possono raggiungere una tensione massima di soli 21,8%, mentre le profondità possono produrre ceppi superiori al 30%, con ceppi ancora più elevati osservati in malattie come asma eBPCO 31.

Perciò, abbiamo progettato un nuovo dispositivo di stiramento delle celle che consente un controllo preciso della rigidità del substrato e della composizione ECM, consentendo al contempo l'applicazione di deformazioni isotrope e uniaxiali variabili alle celle aderenti. Questa piattaforma è particolarmente adatta a ricercatori che indagano questioni meccanobiologiche che richiedono immagini in tempo reale durante la stimolazione meccanica con substrati con rigidità fisiologicamente rilevante. Il dispositivo utilizza un approccio meccanico ispirato alla geometria di una sfera di Hoberman bidimensionale, che si espande e si contrae tramite giunti simili a forbici (Figura 1, Figura supplementare 1). Un singolo motore passo a passo aziona 16 bracci disposti radialmente attraverso un meccanismo di collegamento, che produce espansione e contrazione coordinate di otto montanti di fissaggio. Questa configurazione genera una deformazione omogenea nel piano applicando contemporaneamente uno spostamento radiale uguale a tutti i piloni. Il design unico e l'ingombro compatto del dispositivo facilitano l'imaging a cellule vive con un microscopio a fluorescenza invertita durante l'allungamento isotropo e uniassiale in piano, a una frazione del costo delle alternative commerciali. Il motore passo passo lineare è controllato con un codice Arduino personalizzato, che consente forme d'onda cicliche programmabili con periodi e ampiezze regolabili. In questo studio, dimostriamo che il dispositivo fornisce ceppi precisi e riproducibili che vanno da meno dell'1% al 15%, con una capacità geometrica superiore al 200%. Inoltre, quantifichiamo gli effetti dello stiramento meccanico sulla dinamica intracellulare del calcio e sulle forze di trazione cellulari delle cellule muscolari lisce delle vie aeree primarie umane.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule muscolari lisce delle vie aeree umane primarie (ASMC) utilizzate in questo studio sono state prelevate dall'ATCC (Virginia) e le informazioni sui donatori sono state deidentificate in conformità con le linee guida NIH. Questo studio è stato approvato dal Comitato di Biosicurezza della Northeastern University prima della sperimentazione.

NOTA: Per le istruzioni riguardanti la fabbricazione del dispositivo e le dimensioni del dispositivo, si prega di consultare il file CAD disponibile nel nostro repository GitHub: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging.

1. Progettazione di uno stampo stampato in 3D

  1. Dimensioni degli stampi isotropi
    1. Il diametro esterno dello stampo è di 37 mm.
    2. L'altezza esterna dello stampo è di 4,1 mm.
    3. Lo spessore della parete esterna è di 2,1 mm.
    4. Lo spessore della base dello stampo è di 2 mm.
    5. I fori di fissaggio si trovano a 2 mm dal bordo.
    6. L'area interna del pozzo di coltura cellulare ha un diametro di 20 mm e una profondità di 1,9 mm.
      NOTA: Lo stampo PDMS completato dovrebbe avere uno spessore dell'area di coltura cellulare di 200 μm.
  2. Dimensioni dello stampo uniassiale
    1. Le dimensioni esterne dello stampo sono 41 mm x 12 mm x 4 mm (L x L x H).
    2. I fori di fissaggio sono a 3 mm dal bordo largo e a 4 mm dal bordo della lunghezza con una profondità di 1 mm.
    3. Lo spessore della parete esterna è di 1,5 mm sul bordo di larghezza e di 2 mm sul bordo di lunghezza.
    4. Le dimensioni del pozzo interno per la coltura cellulare sono 26 mm x 5,5 mm x 1 mm (L x L x H).
    5. Lo spessore della base è di 2 mm.
      NOTA: Gli stampi sono stati progettati in SolidWorks, stampati in 3D utilizzando un sistema di resina grigio liquido FormLabs e realizzati presso il makerspace della Northeastern University.
  3. Istruzioni solo per l'uso iniziale dello stampo
    1. Carteggia i bordi ruvidi della stampa dello stampo.
    2. Rivestire lo stampo negativo con smalto trasparente per facilitare la successiva rimozione della muffa PDMS dopo l'indurimento. Lascia asciugare la muffa all'aria per 24 ore.

2. Fabbricazione di gel otticamente trasparenti ed elastici con rigidità del substrato sintonizzabile per la coltura cellulare

NOTA: Indossa DPI appropriati (guanti, camice da laboratorio, protezione per gli occhi) quando maneggi PDMS e NuSil.

  1. Aggiungi la base e l'agente di polimerizzazione Sylgard 184 in un rapporto 10:1 in peso in una ciotola di plastica.
  2. Mescola energicamente con un depressore linguale (o strumento simile) per 2-3 minuti.
  3. Degasa la miscela per 1 ora.
  4. Versare la miscela PDMS nello stampo negativo personalizzato (Figura 2A,B).
    1. Aggiungi 1,3 g allo stampo isotropo.
    2. Aggiungi 0,5 g per lo stampo uniaxiale.
      NOTA: Fai attenzione a distribuire il gel in modo uniforme sullo stampo.
  5. Degasa lo stampo per 1 ora.
  6. Lascia sedimentare il gel nello stampo su una superficie piana a temperatura ambiente per 2 ore.
  7. Indurire a 60 °C durante la notte.
  8. Mixa le parti A e B di NuSil Gel-8100 in proporzioni uguali (1:1) per 15 minuti.
    1. Mescola con il reticolatore Sylgard 184 allo 0,36% del volume totale per ottenere un substrato con una rigidità di 13 kPa 32.
    2. Non aggiungere reticolatore per ottenere un substrato con rigidità di 0,3 kPa.
  9. Degasa la miscela per 30 minuti.
  10. Rimuovi con attenzione il gel PDMS dallo stampo personalizzato. Applica il gel su una copertura da 40 mm.
    NOTA: Fai attenzione a non strappare i gel perché sono fragili.
  11. Versa la miscela NuSil sull'area negativa del gel PDMS.
    1. Gel isotropo: 100 μL.
    2. Gel uniaxiale: 50 μL.
  12. Rivestire i rispettivi gel PDMS con la miscela NuSil utilizzando un coater a spin per 50 secondi a 7 x g per ottenere uno spessore uniforme del substrato di 100 μm.
  13. Lascia sedimentare il gel su una superficie piana a temperatura ambiente per 2 ore prima di polimerizzare a 60 °C durante la notte.
    NOTA: Si prega di assicurarsi che tutti i passaggi di polimerizzazione vengano eseguiti su una superficie pianeggiante. Un gel irregolare non permetterà che l'intera regione di interesse rimanga nel piano di imaging del microscopio. Se l'imaging rivela variazioni di messa a fuoco lungo il campo visivo, il gel potrebbe essersi atdurito su una superficie irregolare e dovrebbe essere rifatto.
  14. Conservare le piastre di coltura cellulare completate in piastre di Petri coperte fino all'uso (Figura 2D-E).

3. Rivestimento proteico a matrice

  1. Aggiungere 500 μL di poli-L-lisina (PLL, 500 μg/mL) a ciascun substrato.
  2. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
  3. Lavare i substrati per 3 × con 1 mL di PBS, seguiti da 3 × con 1 mL di tampone HEPES da 10 mM (pH 8,0).
  4. Aggiungi 500 μL di mPEG-SVA (50 mg/mL) a ciascun substrato.
  5. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
  6. Lava i substrati per 3 × con 1 mL di PBS.
  7. Sostituire il PBS con 500 μL di PLPP (14,5 mg/mL).
  8. Utilizzando il sistema di micropattern PRIMO con il software Leonardo, proiettare il pattern predefinito sulla superficie del substrato con luce UV per 30 secondi.
  9. Lava i substrati per 3 × con 1 mL di PBS e mettili sotto UV per 15 minuti per la sterilizzazione.
  10. Aggiungi 500 μL di gelatina coniugata con fluoresceina allo 0,1% a ciascun substrato.
  11. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
  12. Lava 3 × con 1 mL di PBS.
    NOTA: Per visualizzare i pattern, incubare con gelatina coniugata con fluoresceina allo 0,1% per 1 ora a temperatura ambiente.
  13. Procedi con l'imaging di esperienza.

4. Coltura di cellule muscolari lisci delle vie aeree umane in piatti elastici

NOTA: Eseguire tutte le procedure di coltura cellulare in una cappa di biosicurezza utilizzando la tecnica asettica standard.

  1. Ottenere le cellule muscolari lisce delle vie aeree umane primarie (ASMC) dall'ATCC (Virginia) e assicurarsi che le informazioni sui donatori vengano de-identificate in conformità con le linee guida NIH. Confermare l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Biosicurezza prima della sperimentazione.
  2. Utilizza cellule di tre donatori umani sani di sessi ed età diversi, senza una storia di asma o malattia. Esempio: una donna (18 anni) e due uomini (34 e 59 anni).
  3. Coltura le cellule in condizioni standard (37 °C, 5% CO ₂) e utilizza cellule fino al passaggio 6 per tutti gli esperimenti.
  4. Coltivare le cellule nel seguente mezzo di crescita completo:
    1. DMEM/F12 (500 mL)
    2. Siero bovino fetale al 10% (FBS) (50 mL)
    3. 1× penicillina/streptomicina (5 mL)
    4. 1× AMMINOACIDI non essenziali (5 mL)
    5. Anfotericina B (0,5 mL)
  5. Cambia cellula su un mezzo senza siero almeno 24 ore prima delle misurazioni. Prepara un mezzo senza siero con:
    1. F-12 medio di Ham (500 mL)
    2. 1 × penicillina/estreptomicina (5 mL)
    3. Anfotericina B (50 μg/L)
    4. 1× AMMINOACIDI non essenziali (5 mL)
  6. Sterilizza i piatti di cultura cellulare elastici con UV per 15 minuti.
  7. Incubare piatti sterilizzati con gelatina allo 0,1% per 1 ora a temperatura ambiente prima della semina (Figura 2F).
    1. Per substrati a modello:
      1. Le cellule seme in colture cellulari elastiche si sviluppano a una densità di 104 cellule/cm2.
      2. Incubare in mezzo siero al 10% per 10 minuti per favorire l'attacco alle aree con modelli.
      3. Lava i pozzi con PBS per rimuovere le cellule non attaccate.
      4. Riempi i pozzi con mezzo siero al 10% e incuba per 24 ore.
      5. Sostituisci con un mezzo senza siero e incuba per 24 ore prima delle misurazioni.
    2. Per substrati non modellati:
      1. Cellule seme alla densità desiderata: 102 cellule/cm 2 per cellule isolate. 103 cellule/cm 2 per celle sparse. 104celle/cm 2 per celle confluenti.
      2. Incubare in un mezzo siero al 10% per 24 ore.
      3. Sostituisci con un mezzo senza siero e incuba per 24 ore prima delle misurazioni.

5. Imaging e analisi del calcio fluorescente

  1. ASMC delle vie aeree carezze di siero per 24 ore.
  2. Prepara il colorante FLIPR Ca2+ 6 secondo le istruzioni del produttore.
  3. Mescola il colorante FLIPR Ca2+6 con medium senza siero in un rapporto 1:1.
  4. Incubare le cellule con la soluzione FLIPR Ca ² ⁺ 6 a 37 °C e il 5% di CO ₂ per 2 ore.

6. Configurazione dell'imaging

  1. Usa un microscopio rovesciato Leica DMi8 dotato di:
    1. Fotocamera Leica DFC6000
    2. Motore leggero Leica LED8
    3. Obiettivo asciutto 5×/0,12
  2. Imposta l'eccitazione a 480/40 nm e l'emissione a 527/50 nm.
  3. Acquisire immagini a 16 bit a una frequenza di 2 Hz durante esperimenti di stretching.

7. Analisi dei dati

  1. Importare sequenze di immagini in Fiji (ImageJ) 33.
  2. Definire manualmente le regioni di interesse (ROI) nel citoplasma di ciascuna cellula.
  3. Estrarre i valori medi di intensità in scala di grigi per ogni ROI nel tempo.
  4. Elabora i dati di intensità di fluorescenza utilizzando uno script MATLAB personalizzato.
    NOTA: L'intensità della fluorescenza è proporzionale a quella citosolica [Ca2+].

8. Misurazioni e analisi della forza di trazione

NOTA: Tutti i codici, inclusi quelli per l'analisi delle immagini, la microscopia della forza di trazione e il controllo motore, sono disponibili nel nostro repository GitHub: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging

  1. Riveste i substrati gel PDMS-NuSil con uno strato di perle fluorescenti per fungere da marcatori fiduciali per la microscopia della forza di trazione.
  2. Prepara una soluzione allo 0,025% di microsfere rosse fluorescenti modificate con carbossilato di 1 μm di diametro in HBSS diluendole a un rapporto 1:4000.
  3. Vortice la soluzione per 10 secondi.
  4. Aggiungi la soluzione per perline al gel.
    1. 880 μL al gel isotropo.
    2. 420 μL al gel uniaxiale.
  5. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora per permettere alle perline di aderire.
  6. Dopo 1 ora, rimuovere con cura la soluzione.
    NOTA: Versare delicatamente la soluzione per la perla sui gel morbidi. Una rimozione impropria impedisce la corretta distribuzione delle perline.
  7. Tampona delicatamente eventuali residui con un cotton fioc o un Kimwipe.
  8. Immagini le perle con un microscopio Leica DMi8 dotato di un obiettivo a secco 10x/0.32.
  9. Acquisire immagini nella condizione pre-stretching e continuamente durante tutto il protocollo di stretching.
    NOTA: Esegui tutte le immagini al centro del substrato, dove l'uniformità della deformazione è maggiore. Se necessario, rifocalizza il microscopio nella posizione allungata prima di catturare le immagini.
  10. Analizza le immagini utilizzando un codice MATLAB personalizzato basato sulla microscopia della forza di trazione di Fourier per calcolare i vettori di spostamento e i corrispondenti campi di deformazione planari 34.
  11. Rappresenta i dati come la media di N studi.

9. Calibrazione del dispositivo di allungamento delle celle

  1. Aggiungere 500 μL di H₂O al pozzo per simulare il peso del materiale di coltura cellulare e mantenere umido il modello proteico.
  2. Per il protocollo relativo alla creazione di specifici pattern proteici, si veda la sezione 3 intitolata "Matrix Protein Coating".
  3. Immagini i modelli fluorescenti ogni 400 μm passi di spostamento motore, aumentando fino a un massimo di 2800 μm, per poi tornare a zero in incrementi inversi di 400 μm.
  4. Caratterizzare la relazione tra lo spostamento lineare dal motore passo passo e la deformazione isotropa del piatto di coltura cellulare elastico sia su scala macroscopica che regionale misurando i cambiamenti di area ed eccentricità delle lettere fluorescenti a pattern proteico che scrivono "BREATHE" sul substrato elastico durante lo stiramento. Usa una casella di delimitazione rettangolare che comprenda tutte le lettere per calcolare l'area e l'eccentricità dell'intera parola.
  5. Applica la segmentazione delle immagini in MATLAB per quantificare questi parametri per ogni singola lettera.
  6. Definisci lo spostamento zero per le dimensioni non allungate della piastra di coltura cellulare.
  7. Ripeti ogni esperimento su due o tre pozzi di coltura cellulare elastici preparati indipendentemente per garantire la riproducibilità.

10. Presentazione dei dati e test statistici

  1. Per gli esperimenti di calibrazione con barella, definisci le prove come il numero di cicli.
  2. Mostra ogni prova separatamente invece di combinarle in una singola curva per dimostrare la ripetibilità del sistema.
  3. Indica le barre di errore come deviazione standard.
  4. Utilizzare un'ANOVA unidirezionale per testare differenze significative nei dataset con tre o più gruppi influenzati da un fattore indipendente.
  5. Utilizzare ANOVA bidirezionali seguite da confronti a coppie post hoc per testare differenze significative tra insiemi di dati influenzati da due fattori indipendenti.
  6. Applicare il test t per i confronti a coppie quando i dati sono normalmente distribuiti.
  7. Applicare il test della somma dei rangi di Mann-Whitney per confrontare i valori mediani quando i dati non sono normalmente distribuiti.
  8. Riporta i test specifici utilizzati, il numero di campioni e i corrispondenti valori P, insieme ai risultati.
  9. Utilizzare una soglia di valore P di 0,05 per determinare differenze statisticamente significative tra i dataset.
  10. Esegui test statistici su SigmaStat.
  11. Immagini di grafica in GraphPad Prism e MATLAB.

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Risultati

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Lo stretcher cellulare induce cambiamenti macroscopici dell'area che riflettono deformazioni localizzate. Per valutare il comportamento isotropo, abbiamo misurato i cambiamenti di area di un pattern proteico di gelatina fluorescente che forma la parola "BREATHE" su un pozzo di coltura cellulare elastico, insieme alle sue singole lettere, su un substrato isotropo. I nostri risultati hanno dimostrato che sia la parola che le singole lettere mostravano variazioni equivalenti di area (Figura...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo protocollo, descriviamo la progettazione, lo sviluppo, la validazione e l'implementazione di un nuovo stretcher cellulare compatibile con il microscopio che può imitare ceppi isotropi e uniaxiali mentre simulterrano le cellule vive riguardo. Questo dispositivo è compatto e può montare su un microscopio Leica DMi8, confinando tutte le parti mobili su un unico piano per permettere immagini in tempo reale mantenendo la messa a frecchio sul substrato e sulle cellule sottostanti. Qu...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nessuno degli autori ha interessi concorrenti da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano il signor Noah Joseph per il suo aiuto nella fabbricazione degli stampi. Gli autori ringraziano Heitor Mourato e Glenn Thayer della Boston University Scientific Instrument Facility per il loro aiuto nella lavorazione del dispositivo. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (NSF) Career Grant #2047207 assegnata a Harikrishnan Parameswaran. H.P. concepì la ricerca. S.E.S. e S.R.P. svilupparono il design complessivo del dispositivo, mentre S.E.S. e H.P. progettarono gli esperimenti isotropi. S.E.S ha condotto gli esperimenti sugli stampi isotropi, analizzato i dati sperimentali e interpretato i risultati insieme a H.P. V.C. che ha progettato gli stampi uniassiali, ottimizzato la preparazione del gel e la formazione di perline. B.M.G ha condotto gli esperimenti con gel uniaxiale, analizzato i dati sperimentali e interpretato i risultati insieme a H.P. e V.C.S. S.E.S. e B.M.G. che hanno preparato le figure. B.M.G, S.E.S., V.C. e H.P. contribuirono alla stesura e alla revisione del manoscritto. H.P. approvò la versione finale del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
  Dulbecco' s Eagle modificata s medium/F12Fisher Scientific12634010500 mL 
(4-benzoilbenzil) cloruro trimetilammonio (PLPP)Alvé OleN/A14,5mg/mL
0,1% di gelatina coniugata con fluoresceina  InvitrogenG13187
Soluzione di gelatina allo 0,1%Sigma-AldrichES-006500 mL 
1 & mu; Microsfere fluorescenti rosse modificate con carbossilato con diametro mFluoSpheresF8816
1× Soluzione di amminoacidi non essenziali MEMSigma-AldrichM7145100 mL
1× Penicillina/streptomicinaFisher Scientific15-140-122100 mL
Siero fetale bovino al 10%Termo-ScientificoA5256701500 mL 
Tubo da 15 mLFisher Scientific14-959-53A
1x glutamine  Fisher ScientificMT10010CM
1x Integratore di Crescita di Insulina-Transferrina-SelenioScienze della Vita di Corning25-800-CR
Amfotericina BSigma-AldrichA294225 & mu; g/litro
Cuscinetti a sfereMcMaster-Carr N/A
Diidrato di cloruro di calcioSigma-Aldrich223506
Ferrovia per carrozzeMcMaster-Carr N/A
FLIPR Ca2+ 6Dispositivi molecolariR8190
GraphPad PrismDotmaticsN/A
Prosciutto' s F-12 medium & nbsp;Sigma-AldrichN8641500 mL 
La soluzione salina bilanciata di Hanks Termo-Scientifico14025092500 mL 
BUFFER HEPES Termo-Scientifico15630080100 mL
Leonardo SoftwareAlvé OleN/A
MatlabMathworksN/A
metassil polietilenico glicole e linea; Succinimidile Valerato (mPEG-SVA)Laysan Bio IncN/A50mg/mL
Nusil Gel-8100Nusil N/A
Piatti di PetriTermo-Scientifico26399190 mm 
soluzione salina tamponata fosfato  Sigma-Aldrich10010023500 mL 
poli-L-lisina (PLL)Sigma-AldrichP8920500μ g/mL
Cellule muscolari lisce delle vie aeree umane primarie  ATCCPCS-130-011
Modulo ottico PRIMO  Alvé OleN/A
VitiMcMaster-Carr N/A
SigmaStatSystat SoftwareN/A
Rivestimento a filaturaLaurellModello WS-650MZ-23NPPB
Componenti di attacco per barella e palco Struttura per strumenti scientifici dell'Università di BostonN/AAcciaio inox
Kit base Elastomer e Agente di Polimerizzazione Sylgard 184DowH047J8Q026
Fiaschetta per coltura tessutale T-25 - Tappo di ventilazione, sterileCellTreat229331
Depressore linguale Termo-Scientifico22-363-154

Riferimenti

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