Questo studio ha indagato l'effetto dell'elettroagopuntura (EA) sulla disfunzione vascolare indotta da alto contenuto di sale. L'EA ha invertito danni vascolari e disbiosi intestinali, possibilmente modulando specifici microbi intestinali.
Articolo di ricerca
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Questo studio ha indagato l'effetto dell'elettroagopuntura (EA) sulla disfunzione vascolare indotta da alto contenuto di sale. L'EA ha invertito danni vascolari e disbiosi intestinali, possibilmente modulando specifici microbi intestinali.
Questo studio mira a indagare il potenziale terapeutico e i meccanismi dell'elettroagopuntura (EA) nell'alleviamento della disfunzione vascolare causata da diete ricche di sale, con particolare attenzione alla modulazione del microbiota intestinale. Abbiamo diviso casualmente 21 ratti in gruppi Controllo Normale, Modello ad alto saleggio e Intervento EA (n = 7 per gruppo). Il modello della "sindrome di stasi sanguigna ad alto contenuto di sale" nei ratti Wistar è stato indotto da perfusione intragastrica del 12% di NaCl. I trattamenti sono stati eseguiti tra le 17:00 e le 19:00 ora di Pechino: i ratti sono stati trattenuti con un panno morbido, seguiti da una stimolazione EA di 20 minuti a BL23 e KI3. Dopo l'esperimento sono stati raccolti campioni di sangue di ratto, vasi sanguigni e feci. Gli effetti vascolari sono stati valutati tramite test della funzione coagulante, analisi emoreologiche e valutazione istopatologica arteriosa. Il sequenziamento 16S rDNA è stato utilizzato per analizzare i cambiamenti di composizione e abbondanza del microbiota intestinale. I risultati hanno rivelato che un elevato consumo cronico di sale disturbava la viscosità del sangue, danneggiava l'integrità endoteliale vascolare e causava disbiosi microbica intestinale. In modo sorprendente, il trattamento EA ha effettivamente invertito questi cambiamenti patologici. L'analisi di correlazione ha inoltre identificato specifici microbioti intestinali (ad esempio, Lachnospiraceae e Ruminococcaceae) fortemente correlati con parametri alterati della viscosità del sangue (P < 0,05). Pertanto, il presente studio conclude che la vascolopatia indotta da una dieta ad alto contenuto di sale può essere invertita con il trattamento EA, che può essere attribuito alla capacità dell'EA di regolare il microbiota intestinale coinvolto nel metabolismo degli acidi biliari e nella sintesi degli acidi grassi a catena corta.
Il sale alimentare svolge un ruolo cruciale nel mantenimento dell'equilibrio dei fluidi e dell'omeostasi cellulare, ma un consumo eccessivo rappresenta un fattore di rischio ben consolidato per le malattie cardiovascolarie cerebrovascolari 1. L'Organizzazione Mondiale della Sanità raccomanda di limitare l'assunzione giornaliera di sodio a meno di 5 grammi per gli adultisani 2. Le ricerche hanno dimostrato che una dieta ricca di sale (HSD) compromette la funzione vascolare e che le malattie cardiovascolari (CVD), la malattia più diffusa al mondo, sono spesso accompagnate davascolopatia 3. Questi risultati sottolineano che riparare i danni endoteliali vascolari causati dall'HSD costituisce una strategia fondamentale per prevenire la progressione delle MCV. La "sindrome da stasi sanguigna" (caratterizzata da stagnazione della circolazione sanguigna e accumulo interno di sangue) si allinea con una disfunzione della coagulazione quantificabile nella medicina moderna. I principali biomarcatori di validazione includono un tempo di protrombina (PT) significativamente ridotto e un tempo di tromboplastina parziale attivata (APTT), oltre a un notevole aumento del fibrinogeno (FIB) e del tempo di trombina (TT). Questi indicatori riflettono uno stato ipercoagulabile, direttamente corrispondente alle caratteristiche patologiche della stasi sanguigna.
Il microbiota intestinale, presente in tutto il tratto gastrointestinale, funge da regolatori chiave dei processi immunometabolici e dell'omeostasi intestinale, influenzando al contempo diverse vie fisiologiche epatologiche 4. Le evidenze emergenti indicano che un consumo eccessivo di sale induce disbiosi intestinale e squilibri nutrizionali, scatenando attivazione immunitaria pro-infiammatoria che si manifesta come infiammazione localizzata e promuovendo danni microcircolatori, rimodellamento vascolare e disfunzione endotelialesistemica 1,5. È stato riportato che l'HSD cronica causa un aumento relativo dei livelli di Bacteroides intestinalis, Aspergillus e Prevotella spp. nei topi, ed è stato associato allo sviluppo di ipertensione e infiammazionevascolare 6.
L'agopuntura, un pilastro della Medicina Tradizionale Cinese (MTC), utilizza l'inserimento preciso dell'ago in punti di agopuntura specifici come terapia complementare e alternativa basata su evidenze nella pratica clinica. I National Institutes of Health (NIH) e l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) riconoscono l'agopuntura come un intervento clinicamente validato per molteplici condizioni patologiche. Le evidenze emergenti dimostrano che l'agopuntura ha un doppio meccanismoterapeutico 7,8, modulando la composizione del microbiota intestinale mentre sopprime i mediatori infiammatori vascolari, mitigando così collettivamente la progressione patologica nei disturbi correlati. È importante sottolineare che l'agopuntura è efficace nell'abbassare la pressione sanguigna e nel ripristinare la funzione endoteliale nei vasi sanguignidanneggiati.
L'EA è stata scelta rispetto all'agopuntura manuale per i suoi parametri di stimolazione standardizzati e quantificabili, che riducono la variabilità dipendente dall'operatore e migliorano la riproducibilità dei risultati. Pertanto, abbiamo indagato l'effetto del trattamento con EA sul microbiota intestinale nei ratti con modello di stasi sanguigna ad alto contenuto salino (HSBS) e abbiamo valutato l'efficacia dell'EA sulla vascolopatia indotta da alte sali tramite reologia ematica e cambiamenti istopatologici vascolari. Per comprendere meglio il ruolo del microbiota intestinale nel miglioramento delle lesioni vascolari tramite la terapia EA, abbiamo effettuato un'analisi di correlazione tra diversi generi di microbiota intestinale e la frequenza di taglio del sangue intero e la sedimentazione del sangue.
Abbiamo quindi ipotizzato che l'EA allevia la vascolopatia indotta dall'HSD ripristinando l'omeostasi della microbiota intestinale. Per testare ciò, abbiamo puntato a: (i) quantificare gli effetti protettivi dell'EA sulla funzione e struttura vascolare, e (ii) identificare i taxa microbici intestinali specifici modulati dall'EA che si correlano con questi miglioramenti. Inoltre, l'analisi di correlazione di Pearson ha identificato significative relazioni microbiota-vascolare, in particolare tra fluttuazioni di generi differenzialmente abbondanti e anomalie emorologiche. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo studio a esplorare i meccanismi protettivi dell'EA nel migliorare la vascolopatia indotta dalla dieta ad alto contenuto di sale dal punto di vista del microbiota intestinale. Il disegno sperimentale di questo studio è mostrato nella Figura 1.

Figura 1: Diagramma tecnico sperimentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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L'intero esperimento è stato condotto presso il Centro Sperimentale della Scuola di Medicina di Base dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu. Tutte le procedure di benessere animale e sperimentali sono state approvate dal Comitato Etico per il Benessere degli Animali di Laboratorio dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (Etica n. 2024078). Gli esperimenti sono stati condotti seguendo rigorosamente la Guida NIH per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio (revisione 1986, Pubblicazione 86-23).
Animali e dieta
I ratti Wistar maschi e femmine privi di patogeni specifici (SPF), di età compresa tra 6 e 8 settimane, pesavano 200 ± 20 g. Tutti i ratti venivano alloggiati in stanze ben ventilate con un ciclo chiaro-buio di 12 ore e avevano libero accesso a cibo e acqua.
Modelli e gruppi
I modelli animali sono stati indotti facendo riferimento all'esperienza di ricercaprecedente 10. Dopo un periodo di acclimatazione di 7 giorni, 21 ratti Wistar (distribuzione maschio/femmina del 50%) sono stati assegnati casualmente a tre gruppi sperimentali (n = 7/gruppo) utilizzando il generatore di numeri casuali in Excel, mantenendo il numero di ratti maschi e femmine in ciascun gruppo approssimativamente bilanciato per minimizzare l'impatto del genere suirisultati 11. Controllo normale (NC): Ricevuto una gara gastrica giornaliera (1 mL/100 g) di acqua purificata. Modello ad alto contenuto di sale (HS) e intervento EA (EA): somministrata una soluzione di NaCl al 12% (1 mL/100 g) tramite gavage giornaliero. Tutti gli interventi sono stati mantenuti per 30 giorni consecutivi.
Trattamento EA
Il trattamento è stato avviato il giorno dopo la modellazione riuscita. L'EA è stata scelta rispetto all'agopuntura manuale per i suoi parametri di stimolazione standardizzati e quantificabili, che riducono la variabilità dipendente dall'operatore e migliorano la riproducibilità dei risultati. Le località di BL23 (Shenshu, meridiano della vescica) e KI3 (Taixi, meridiano renale) sono state determinate in base ai criteri di localizzazione dei punti di agopuntura nei ratti della Società Cinese di Agopunturae Moxibustion 12. BL23 è situato a 6 mm lateralmente alla linea mediana dorsale, inferiore alla seconda vertebra lombare. KI3 si trovava nella depressione mediana tra il punto più alto del malleolo mediale e il bordo posteriore del tendine d'Achille. I capelli locali ai punti di agopuntura sono stati rimossi e sterilizzati. Aghi sterili usa e getta (0,18 mm × 13 mm) sono stati utilizzati per perforare verticalmente i punti di agopuntura, con profondità di inserimento di 4-6 mm per BL23 e 3-5 mm per KI3. La clip per elettrodo positivo del dispositivo di elettroagopuntura era collegata al manico dell'ago dell'ago di agopuntura su BL23 da un lato, e la clip per elettrodo negativo a quella di KI3 dallo stesso lato. Parametri del dispositivo di elettroagopuntura: Forma d'onda: Onda densa-scarsa (10/50 Hz); Frequenza: 5 s per onde scarse, 10 s per onde dense; Intensità: 1-2 mA, regolata in base alle risposte convulsive e dolorose dei ratti (urla, comportamenti di resistenza); Larghezza del polso: ≤ 1 MS. Protocollo di stimolazione: L'intervento è stato eseguito quotidianamente dalle 17:00 alle 19:00 (ora di Pechino), della durata di 20 minuti ciascuna. Ciclo: Un ciclo di trattamento consisteva in 7 giorni, con un totale di 4 cicli e 1 giorno di riposo tra un ciclo e l'altro. Il processo specifico è mostrato nella Figura 2 (Creata con BioGDP.com13).

Figura 2: Linea temporale sperimentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Raccolta e preparazione dei campioni
Un mese dopo la gage, è stato prelevato sangue venoso orbitale dai ratti prima dell'intervento di EA. I campioni di plasma sono stati estratti tramite centrifugazione a 1.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Al termine del trattamento, venivano raccolte feci fresche da ogni gruppo di ratti. I ratti sono stati anestetizzati con isoflurano emulsionato al 10% (30 mg/kg) e soppressi. La cavità addominale è stata aperta e circa 5 mL di sangue sono stati raccolti dall'aorta addominale per misurare la viscosità del tasso di taglio del sangue totale (WBSRV) entro 4 ore. I tessuti aortici addominali sono stati raccolti per analisi istopatologica. Tutti i campioni venivano conservati a -80 °C per un uso successivo.
Test WBSRV
Dopo il completamento della modellazione, sono stati prelevati circa 4-5 mL di sangue intero dall'aorta addominale dei ratti utilizzando un ago per la raccolta del sangue e inseriti in tubi anticoagulanti eparinico-sodici. I tubi venivano scossi delicatamente per garantire una buona miscelazione dei campioni di sangue con l'anticoagulante. Nel giro di 4 ore, il WBSRV e la velocità di sedimentazione degli eritrociti (ESR) sono stati misurati utilizzando un analizzatore emorelogico completamente automatizzato.
Istopatologia vascolare
I tessuti vascolari sono stati fissati in soluzione di paraformaldeide al 4% per almeno 24 ore e sezionati a uno spessore di 3 μm per la colorazione con ematossilina-eosina (HE). Le immagini sono state catturate con ingrandimenti del 100× e del 400×.
Sequenziamento 16S rDNA
Il DNA genomico è stato estratto da campioni fecali di ciascun gruppo. Le sequenze di primer V3-V4 (341F: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'; 805R: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') sono state utilizzate per l'amplificazione PCR del DNA totale. Il programma di amplificazione PCR era il seguente: pre-denaturazione a 98 °C per 30 secondi, denaturazione a 98 °C per 10 secondi, ricottura a 54 °C per 30 secondi ed estensione a 72 °C per 45 secondi, con un totale di 32 cicli, seguita da un'estensione finale a 72 °C per 10 minuti. I prodotti PCR venivano purificati e quantificati. Il sequenziamento a estremità accoppiata (2×250 bp) veniva eseguito sulla piattaforma di sequenziamento NovaSeq 6000. Le letture a estremità accoppiata venivano unite e filtrate per ottenere dati di alta qualità. Utilizzando il plugin DADA2 in QIIME 2, sono stati eseguiti filtri per la lunghezza e riduzione del rumore. Questo processo generava varianti di sequenza di amplicon (ASV) e tabelle di abbondanza ASV, seguite dalla rimozione degli ASV singoli. Annotazioni tassonomiche e profilazione dell'abbondanza sono state effettuate sulla base del file di sequenza ASV utilizzando il database SILVA per indagare le differenze tra specie e la composizione delle comunità tra i campioni. La diversità delle specie e i cambiamenti nell'abbondanza relativa sono stati valutati tramite analisi α-diversità e β-diversità, e la visualizzazione dei dati è stata effettuata su questo sito web (https://www.omicstudio.cn/home).
Analisi statistiche
Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando SPSS 26.0. Un valore di P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Per i dati con varianze omogenee, è stata utilizzata ANOVA unidirezionale per confronti tra gruppi, seguita da test post-hoc di minima differenza significativa (LSD) se fossero state riscontrate differenze significative. Per i dati con varianze eterogenee, è stato utilizzato l'ANOVA unidirezionale non parametrica di Kruskal-Wallis per ranghi. L'analisi del test Mann-Whitney U è stata applicata per valutare i cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale e nella struttura della comunità. L'analisi di correlazione di Pearson per classificare è stata utilizzata per valutare le correlazioni tra batteri intestinali differenzialmente abbondanti e altri indicatori. L'analisi di correlazione di Pearson è stata utilizzata perché i dati rispettavano le assunzioni di normalità e linearità, validate dal test di Shapiro-Wilk e dal test di Durbin-Watson. Grafici statistici e heatmap venivano generati utilizzando GraphPad Prism 10.
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Validazione del modello animale
I quattro parametri di coagulazione svolgono un ruolo fondamentale nella ricerca sulle lesioni vascolari monitorando anomalie della funzione coagulante strettamente legate a cambiamenti patologici vascolari. La valutazione post-modellizzazione del sangue del plesso venoso retro-orbitale ha mostrato significative alterazioni nei parametri di coagulazione (PT, APTT, FIB, TT) tra i gruppi HS/EA rispetto ai controlli NC (Figura 3). I valori spe...
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Le lesioni vascolari sono un fattore critico nello sviluppo e nelle manifestazioni patologiche di varie malattie cardiovascolari e patologie metaboliche. I loro effetti dannosi includono disfunzione vascolare, coagulazione sanguigna anomala, deposizione lipidica e formazione di placca, che possono portare a pressione alta, trombosi e formazione di placche arteriose, portando infine a varieCVD 14,15,16.
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Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse.
Questa ricerca è stata finanziata dal Dipartimento Provinciale di Scienza e Tecnologia del Sichuan (Grant n. 2024NSFSC0717). Ringrazio Figdraw per l'aiuto fornito nella preparazione delle figure.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Aghi per agopuntura | Suzhou Medical Supplies Factory Co., Ltd. | 242059 | 0,18 e volte; 13 mm |
| Kit di saggio per il tempo di tromboplastica parziale attivata (APTT) (Metodo della coagulazione) | Beijing Succeeder Technology Inc. | R21D24C4 | |
| Perle XP AMPure | Beckman Coulter Genomica | A63881 | |
| Analizzatore Automatico di Coagulazione | Beijing Succeeder Technology Inc. | SF-8050 | |
| Kit di saggio per fibrinogeno (FIB) (Metodo di coagulazione) | Beijing Succeeder Technology Inc. | R31D24D2 | |
| Tester Automatico di Reologia del Sangue | Beijing Succeeder Technology Inc. | SA-5600 | |
| GraphPad Prism 10 | GraphPad Software, Inc. | ||
| H& Soluzione di colorazione E | Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd | G1005 | |
| Kit di quantificazione della libreria Illumina | Kapa Bioscienze | 7960166001 | |
| Isoflurano | Scienze della Vita RWD | R510-22-10 | 100 mL |
| Kit di estrazione genomica del DNA delle feci a base di perle magnetiche | Biotek | AU46111-96 | |
| Microscopio verticale a luce bianca Nikon Eclipse Ci-L | Nikon | ||
| QIIME 2 | https://qiime2.org/ | ||
| Dispositivo elettronico di agopuntura SDZ-II Huatuo | Suzhou Medical Supplies Factory Co., Ltd. | SDZ-II | |
| Database SILVA | Release 138, https://www.arb-silva.de/ | ||
| Cloruro di sodio | Chengdu Jinshan Chemical Reagents Co., Ltd. | 20231008 | 500 g |
| Ratti Wistar SPF | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | SCXK (Pechino) 2024-0001 | |
| Kit di test Trombombin Time (TT) (Metodo di coagulazione) | Beijing Succeeder Technology Inc. | R4D24E1 |
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