Risposta alla temperatura dei tassi di decomposizione della materia organica nel suolo: costruzione e applicazioni di un blocco a gradiente di temperatura

Sommario

Introduciamo un blocco a gradiente di temperatura e ne dettagliamo la costruzione e l'utilizzo. Il blocco fornisce 22 temperature discrete, distribuite linearmente in un intervallo definito dall'utente da 0 a 90 °C. I dati raccolti da questo sistema permettono di testare e sviluppare nuove teorie sulla risposta alla temperatura dei tassi di decomposizione della materia organica nel suolo.

Abstract

Il suolo è il più grande serbatoio di carbonio (C) della Terra, contenendo quasi il doppio della quantità di C rispetto all'atmosfera. L'aumento delle temperature indotto dal cambiamento climatico potrebbe aumentare la decomposizione della materia organica del suolo (SOM), potenzialmente rilasciando anidride carbonica (CO₂) nell'atmosfera, causando così un feedback positivo sul cambiamento climatico. Questo pone la domanda: come possiamo definire la risposta dei tassi di decomposizione SOM ai cambiamenti di temperatura a breve termine? Possiamo utilizzare questi dati per adattare equazioni meccanicistiche nei modelli del sistema terrestre per le previsioni climatiche? La maggior parte delle ricerche finora si è concentrata sulle incubazioni del suolo in laboratorio a diverse temperature discrete. Tuttavia, ciò non comporta una curva dettagliata di risposta alla temperatura, necessaria per testare nuove ipotesi imposte dagli ultimi sviluppi nel campo, come la teoria del tasso macromolecolare (MMRT). In questo articolo introduciamo un blocco a gradiente di temperatura, modificato e migliorato rispetto ai lavori precedenti, ne dettagliamo il processo di costruzione e forniamo una spiegazione dettagliata del suo utilizzo. Il blocco gradiente di temperatura è un blocco di alluminio con quattro file di 22 fori discreti, che consente l'incubazione simultanea di 88 microcosmo (fiale da 60 mL). Il blocco viene raffreddato da un'estremità e riscaldato all'altra, creando una distribuzione lineare della temperatura. Fornisce 22 punti di temperatura discreti lungo un intervallo definito dall'utente entro limiti da 0 a 90 °C. Dopo 3,5 ore di incubazione, la produzione di_CO2 viene misurata da ciascuno degli 88 microcosmo. I risultati dimostrano che il blocco produce il gradiente di temperatura definito dall'utente e facilita la costruzione delle curve di risposta alla temperatura della decomposizione SOM. Inoltre, i dati raccolti da questo sistema possono essere utilizzati per testare e sviluppare nuove ipotesi e teorie riguardo all'impatto delle variazioni di temperatura sui tassi di decomposizione della SOM, un'area di crescente importanza nel contesto del cambiamento climatico.

Introduzione

L'aumento delle concentrazioni di anidride carbonica (CO₂) nell'atmosfera porta a temperature più alte sulla Terra¹. Questo fenomeno fu segnalato per la prima volta nel 1856 da Eunice^{Foote 2}, che condusse un esperimento semplice ma rivoluzionario. Riempì una bombola con aria ambiente e un'altra con_CO2 e registrò le temperature in^{entrambe le 1}. I risultati erano chiari: i cilindri con concentrazioni più elevate di_CO2 hanno mostrato temperature più elevate, dimostrando l'effetto riscaldante dell'aumento della_CO2 1 atmosferica^. Questa osservazione ha implicazioni significative per il cambiamento climatico. Oggi, le prime intuizioni di Foote continuano ad informare la scienza climatica contemporanea, guidando la ricerca su come l'aumento dei livelli di_CO2 influenzi il riscaldamento globale e influenzi vari ecosistemi.

I suoli immagazzinano quasi il doppio del carbonio (C) dell'atmosfera nel primo metro, svolgendo un ruolo cruciale nel ciclo^{globale C 3}. Un processo chiave che influenza le scorte di C nel suolo è la decomposizione della materia organica del suolo (SOM), che determina la velocità con cui il C viene ririlasciato^{nell'atmosfera 4,5}. Le temperature medie annuali più elevate, dovute al cambiamento climatico, hanno il potenziale di stimolare la decomposizione della materia organica del suolo (SOM), accelerando il rilascio di_CO2 ^{nell'atmosfera 6,7}. Questo rappresenta un meccanismo di retroazione positiva al cambiamento climatico, in particolare quando temperature più elevate accelerano le perdite di C tramite la decomposizione del SOM più di quanto stimolino gli input fotosintetici^{del C 6}. Nonostante ricerche approfondite sull'argomento, l'entità e la direzione del cosiddetto feedback terra-carbonio-clima rimangono ampiamente^dibattuti 8,9,10,11. Questa incertezza è dovuta in gran parte a lacune fondamentali di conoscenza riguardo alla risposta termica dei tassi di decomposizione della SOM. Affrontare queste lacune è essenziale per perfezionare i modelli del sistema terrestre e incorporare rappresentazioni teoricamente a terra della risposta termica ai tassi di decomposizione SOM.

La risposta termica dei tassi di decomposizione SOM è comunemente rappresentata dal valore di Q₁₀ e dall'equazione di Arrhenius. Il valore Q₁₀ è definito come il fattore per cui una velocità viene moltiplicata quando la temperatura aumenta di 10 °C. Nonostante le sfide alla sua^{validità 12,13,14,15}, il Q₁₀ è diventato l'approccio predefinito per confrontare la risposta alla temperatura di diversi trattamenti e suoli. La teoria di Arrhenius suggerisce un aumento esponenziale dei tassi di processo, come quelli della decomposizione SOM, con l'aumento della temperatura¹⁶. Tuttavia, le attività enzimatiche effettive tendono a seguire una forma unimodale con un ottimale termico distinto e a diminuire a temperature^{più elevate 17, 18, 19}. Le equazioni basate su Arrhenius cercano di spiegare questo declino suggerendo una denaturazione enzimatica oltre l'ottimale^{termico 6}. Tuttavia, la denaturazione enzimatica avviene a temperature più elevate rispetto a quelle comunemente presenti nei suoli, indicando che gli enzimi raggiungono un ottimale termico prima che avvenga^{la denaturazione 19,20}. Inoltre, aggiungere semplicemente una seconda funzione all'equazione di Arrhenius per tenere conto del collasso delle frequenze respiratorie dovuto alla denaturazione non permette di stimare la temperatura di un punto di flessione - la temperatura alla quale la velocità di variazione della respirazione è^{massimizzata 21,22}. Di conseguenza, le equazioni basate su Arrhenius non riescono a catturare pienamente la forma comunemente misurata della risposta complessiva alla temperatura dei tassi di decomposizione SOM all'interno dell'intervallo di temperature generalmente osservato nei suoli^14,23.

Per affrontare i limiti della teoria di Arrhenius, sono state sviluppate molteplici equazioni per rappresentare la sensibilità alla temperatura dei processi biologici; tuttavia, pochi sono fondati sulla teoria biologica o sono stati applicati ai^{suoli 24,25}. Tra gli approcci basati sulla biologia, la teoria della velocità macromolecolare (MMRT) supera alcune delle limitazioni dell'equazione di Arrhenius incorporando le proprietà termodinamiche delle macromolecole biologiche, come gli^{enzimi 26}. Analogamente, la teoria di Arrhenius assistita dall'enzima (EAAR) spiega il ruolo dipendente dalla temperatura degli enzimi nell'abbassare l'energia di attivazione della^{reazione 24}. Entrambe le equazioni sono state applicate con successo a studi sulla risposta termica delle reazioni biochimiche nei suoli e nei microrganismi 17,24,27,28. Queste equazioni forniscono preziose intuizioni meccanicistiche sulla risposta termica della decomposizione SOM e sulle fasi di reazione sottostanti. Tuttavia, la loro ampia adozione e parametrizzazione sono spesso ostacolate da sfide sperimentali.

Sia gli studi sul campo che quelli di laboratorio presentano vantaggi e limitazioni per comprendere la risposta termica ai tassi di decomposizione SOM. Gli esperimenti sul campo forniscono preziose informazioni sulla risposta a lungo termine ai tassi di decomposizione della SOM in temperatura a lungo termine. Tuttavia, interpretare le misurazioni del flusso di CO₂ sul campo può essere difficile a causa di variabili di confusione come la respirazione autotrofa, la variabilità dell'umidità e l'accessibilità del^{substrato 29,30,31,32,33.} Sebbene queste interazioni siano essenziali per quantificare processi reali, tali studi si concentrano generalmente sulle risposte ecosistemiche a lungo termine piuttosto che sulle misurazioni dei processi meccanicistici a breve termine. Comprendere la risposta termica a breve termine è cruciale per parametrizzare equazioni definite da teorie recenti, come MMRT e EAAR, e per questo gli studi di laboratorio sono fondamentali. Molti studi di laboratorio soffrono tipicamente di effetti di confusione dovuti all'esaurimento del substrato, che aumentano con i tempi di incubazione e i trattamenti^{a temperatura} 34,35,36. Inoltre, la maggior parte degli esperimenti di laboratorio utilizza solo pochi trattamenti di temperatura 37,38,39,40, che porta a adattare semplici equazioni esponenziali o a calcolare rapporti Q₁₀ invece di equazioni più avanzate, che richiedono di misurare i tassi a un numero maggiore di temperature^{discrete 41}. Per affrontare questi problemi, è fondamentale sviluppare nuovi approcci sperimentali che permettano misurazioni accurate dei tassi di decomposizione SOM in un intervallo più ampio di temperature, supportando così i rigorosi test e lo sviluppo delle teorie di decomposizione SOM in relazione alla risposta alla temperatura.

In questo articolo descriviamo la costruzione e l'utilizzo di un blocco a gradiente di temperatura, che non solo affronta le attuali limitazioni sperimentali, ma fornisce anche uno studio all'avanguardia per dimostrare la risposta a breve termine della decomposizione SOM alla temperatura. Il disegno qui presentato è un adattamento della metodologia sviluppata per la prima volta da Thomas et al. (1963)⁴² e successivamente modificata da Robinson et al. (2017)⁴¹. Le principali differenze includono: 1) un miglioramento del sistema di raffreddamento, 2) una riduzione dei tempi operativi tramite l'accoppiamento del blocco a un analizzatore di_CO2 per la misurazione diretta delle concentrazioni di_CO2, e 3) l'eliminazione della necessità di trasportare le fiale durante l'esperimento. Mentre i rapporti^{precedenti 21, 41, 43} hanno fornito una descrizione ampia del blocco di temperatura, il design dettagliato, i metodi di costruzione e i test sono stati minimi, limitando la possibilità per altri ricercatori di utilizzare questo approccio. Qui forniamo dettagli completi sia del progetto che della costruzione, e presentiamo i risultati di molteplici test per dimostrare la corretta funzionalità dell'impianto per diversi campioni di terreno.

Protocollo

Qui presentiamo la costruzione dettagliata e l'utilizzo approfondito del blocco gradiente di temperatura. Tutti i materiali con le rispettive specifiche si trovano nella Tabella Supplementare 1 e nella Tabella dei Materiali. Il costo di costruzione e assemblaggio del blocco a gradiente di temperatura fu di circa 20.000 €, escludendo il costo dell'analizzatore di gas. Questo blocco a gradiente di temperatura è chiamato 'Eunice' in onore di Eunice Foote.

1. Costruzione del blocco gradiente di temperatura

1. Consulta la Figura 1 per il design del corpo del blocco a gradiente di temperatura.
2. Costruzione del blocco di alluminio
   1. Posiziona e fissa il blocco di alluminio grezzo in una fresatrice universale. Inserisci le misurazioni e le posizioni di ogni foro nel software della macchina. La Figura 2 specifica la posizione e il diametro di ciascun foro per l'allestimento.
   2. Forare i fori per le aste riscaldanti. A un'estremità del blocco, forare due fori con un diametro di 16 mm e una profondità di 133 mm. Posizionare questi fori in modo che i loro centri siano posizionati a 25 mm dal bordo superiore e a 36,25 mm dai bordi laterali (Figura 2).
   3. Crea un motivo a castello come agente refrigerante. All'estremità opposta del blocco, si trivellare un motivo di castello lungo 180 mm (Figura 3A). Assicurarsi che il modello del castello abbia uno spessore di 16 mm e una profondità di 140 mm. Forare 12 fori aggiuntivi all'interno del modello del castello, ciascuno con un diametro di 10 mm e una profondità di 140 mm. Consulta la Figura 3B per la posizione precisa e la distribuzione di questi fori.
      NOTA: Il pattern del castello è stato creato per aumentare il contatto dell'agente refrigerante con il blocco, e i 12 fori servono a prevenire il traboccamento.
   4. Crea una guarnizione per il motivo del castello. Taglia una guarnizione in alluminio per racchiudere l'agente refrigerante all'interno del blocco e posizionarlo sopra il motivo del castello. Questo viene utilizzato per prevenire la perdita dell'agente refrigerante.
   5. Forare i fori per la connessione del dissipatore. Sul lato anteriore e posteriore del blocco, praticare fori con un diametro di 15 mm per la connessione del raffreddatore (Figura 4). Posiziona il centro dei fori a una profondità di 75 mm. Assicurati che il foro sul lato anteriore sia a 18 mm dal bordo e quello sul retro a 162 mm dal bordo. Assicurati che questi due fori colleghino l'inizio e la fine del modello del castello.
   6. Forare i fori per i sensori di temperatura. Forare 8 fori con un diametro di 3 mm e una profondità di 150 mm. Questi sensori sono posizionati al centro del blocco e distribuiti uniformemente lungo tutta la sua lunghezza. Assicurati che il centro del primo foro sensore sia a 940 mm dal bordo e che l'ultimo foro del sensore sia a 205 mm dal bordo.
   7. Forare i fori per le fiale da 60 mL. Creare 88 fori, ciascuno con un diametro di 28 mm e un'altezza di 144 mm. Questi fori sono distribuiti uniformemente nel blocco. Il centro del primo e dell'ultimo foro della fiala si allinea con i centri del primo e dell'ultimo foro del sensore.
3. Preparazione dell'isolamento
   NOTA: Il materiale isolante è in poliiscianurato con uno spessore di 40 mm.
   1. Utilizzando una sega circolare, taglia il materiale isolante a forma di trapezio con un angolo di 135°. Per coprire i quattro lati lunghi del blocco di alluminio, tagliare il materiale isolante in un rettangolo di 1080 mm per 230 mm. Taglia ciascuno dei quattro lati di questo rettangolo con un angolo di 135° per farlo aderire perfettamente al blocco. Uno di questi lati sarà incollato al coperchio del blocco. Usa del nastro in alluminio per proteggere il materiale isolante del coperchio del blocco.
   2. Per i due lati corti del blocco, taglia il materiale isolante in un quadrato di 230 mm per 230 mm. Ancora una volta, taglia ciascun lato del quadrato con un angolo di 135° per garantire una calzata corretta.
4. Collegamento del sistema di raffreddamento (Figura 5)
   NOTA: Il sistema di raffreddamento utilizzato in questa configurazione è compatto ed efficiente dal punto di vista energetico. Questo sistema di raffreddamento è azionato facendo circolare un agente naturale di raffreddamento con capacità di raffreddamento fino a -30 °C.
   1. Fissa il ginocchio e la spina del tubo al blocco (Figura 5C). Poi, collega il tubo che indirizza l'agente refrigerante al dissipatore.
   2. Copri il tubo con materiale isolante flessibile per coprirlo completamente. Questo manterrà l'agente refrigerante alla temperatura desiderata. Taglia il materiale isolante flessibile e fissalo saldamente al tubo, usando un sigillante adesivo per fissare l'isolamento.
5. Inserire la barra riscaldante e i sensori nel blocco per garantire la calzata (Figura 5D).
6. Consulta la Figura 5 per una panoramica dei passaggi spiegati sopra.

Figura 1: Progettazione del corpo e parti del blocco gradiente di temperatura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: blocco gradiente di temperatura che delinea la posizione e il diametro dei fori utilizzati per molteplici usi. La lettera "S" indica sensore. Le dimensioni sono in millimetri (mm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Progettazione e misurazioni del modello del castello utilizzato come agente di raffreddamento. (A) Misurazioni dello spessore, della lunghezza e del diametro del motivo del castello, e (B) distanza e posizione di 12 fori utilizzati per prevenire il traboccamento. Le dimensioni sono in millimetri (mm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Vista laterale del blocco gradiente di temperatura che indica la profondità di ogni foro e la posizione delle connessioni del raffreddatore. La lettera "S" indica sensore. Le dimensioni sono in millimetri (mm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Panoramica della costruzione del blocco gradiente di temperatura. (A) Forare i fori per posizionare le fiale da 60 mL; (B) costruire il materiale isolante che copre il blocco di alluminio; (C) collegamento e involucro per l'agente refrigerante; (D) inserire la barra riscaldante e i sensori nel blocco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Costruzione della custodia in acciaio inox.

1. Taglia l'acciaio inossidabile per i lati lunghi con le dimensioni 1080 mm x 230 mm x 230 mm. Per i lati corti, taglia l'acciaio inox con dimensioni 230 mm x 230 mm. Assicurati di fare dei fori per il tubo di raffreddamento, i sensori, le barre riscaldanti e le maniglie.
   NOTA: Uno dei lati lunghi viene usato come coperchio del blocco.
2. Collega termicamente le maniglie, le cerniere del coperchio e le chiusure alla carcassa in acciaio inox.

3. Costruzione dell'unità elettronica

NOTA: Solo un elettricista qualificato può costruire l'unità elettronica. Il protocollo qui descritto è stato sviluppato in conformità con le leggi olandesi e dell'UE. Di seguito è riportata una breve panoramica dei principali componenti utilizzati; istruzioni dettagliate sul cablaggio sono fornite nel Fascicolo Supplementare 1.

1. Progetta il diagramma elettronico (Figura 6).
2. Monta le scatole di derivazione.
   NOTA: Le scatole di derivazione sono installate per proteggere i componenti elettrici e le connessioni da oggetti esterni e danni.
   1. Fissa saldamente le tre scatole di derivazione all'alloggiamento in acciaio inoxabile usando le viti di montaggio.
   2. Punti di ingresso per cavi preparati. Nella scatola di derivazione principale, scavare sei fori per le ghiappole a cavi. Nelle due scatole più piccole, fai due fori per le ghiappoine. Una scatola ospiterà l'interruttore a due vie, e l'altra i collegamenti dei cavi della barra del riscaldamento.
      NOTA: L'interruttore a due vie serve ad accendere e spegnere l'unità, il che significa che fornisce alimentazione al mini interruttore automatico.
   3. Nella scatola di derivazione principale, fai un foro sulla parte superiore per il LED verde.
      NOTA: Questa spia LED indica quando l'unità è accesa e l'alimentazione è disponibile per ogni componente.
   4. Taglia e monta la rotaia DIN nella scatola di derivazione principale. Poi, segna tre fori per le viti di montaggio che tengono la rotaia DIN. Monta la rotaia DIN nella scatola di derivazione principale.
      NOTA: La rotaia DIN viene utilizzata per facilitare il montaggio dei componenti elettrici. Preferibilmente, posizionala approssimativamente al centro della scatola di derivazione principale.
3. Installazione di componenti elettrici.
   NOTA: Usa la Figura 7 come riferimento e installa ogni componente elettrico.
   1. Trova la scatola di derivazione per l'interruttore a due vie. Rimuovi la metà superiore dell'interruttore per trovare la parte che deve essere fatta passare attraverso la piastra di copertura. Segna e pratica un foro nella piastra di copertura della scatola di giunzione dell'interruttore, che deve adattarsi perfettamente e montare l'interruttore sulla piastra di copertura. Usa le istruzioni di montaggio degli interruttori.
   2. Nella scatola principale di derivazione, posizionare il terminale PE/GND sulla rotaia DIN. Poi, posiziona il piccolo interruttore automatico (MCB) sulla rotaia DIN.
      NOTA: I terminali PE/GND sono utilizzati come estremità. L'MCB è un interruttore automatico in miniatura ed è il principale interruttore di sicurezza in caso di guasto o carenza. Quando l'MCB è acceso, applica alimentazione all'alimentatore AC/DC.
   3. Posizionare due terminali tripli di alimentazione sulla rotaia DIN. Utilizzando due terminali doppi ponti per unirli in cima e in fondo ai terminali di alimentazione.
      NOTA: Utilizzare i terminali di alimentazione per collegare più di due fili e utilizzare ponti per collegare tra loro più terminali di alimentazione. Assicurati una connessione sicura e affidabile utilizzando i connettori a ghiera.
   4. Posiziona l'alimentatore DC sulla rotaia DIN come mostrato nella foto.
      NOTA: Questo studio ha utilizzato un alimentatore AC/DC da 24 V, 2,5 A. Che utilizza l'alimentazione AC e la converte in 24 VDC per i requisiti di potenza in ingresso degli altri componenti.
   5. Posiziona il termostato sulla guida DIN come mostrato nella foto. Assicurati di non perdere il modulo di connessione del cavo (Verde nella Figura 7).
      NOTA: Un termostato veniva utilizzato per controllare e monitorare la temperatura. Si tratta di un sistema software basato su browser web che richiede l'indirizzo IP dell'unità per effettuare il login, impostare la temperatura delle barre riscaldanti e registrare i dati. Questo era collegato alla rete locale (LAN) per poter connettersi all'unità da qualsiasi computer nel campus.
   6. Posiziona sette terminali tripli di alimentazione sulla rotaia DIN come mostrato nella foto. Utilizzando tre ponti quintuple, unire insieme i primi cinque feed-thru ai terminali superiore, centrale e inferiore.
   7. Usa due ponti quintuplici per unire gli ultimi due feed-thru tra i feed-thru in alto e in basso.
   8. Posiziona un portafusibili sulla rotaia DIN come mostrato nella foto.
      NOTA: Un fusibile da 630 mA è stato utilizzato per proteggere i componenti dell'unità da danni in caso di cortocircuiti e sovratensioni.
   9. Posizionare due unità di collegamento a singolo terminale sulla rotaia DIN come mostrato nella foto.
   10. Posiziona il relè a stato solido sulla rotaia DIN come mostrato nella foto.
       NOTA: Il relè a stato solido viene utilizzato per accendere e spegnere le barre di riscaldamento.
   11. Metti un terminale PE/GND come stop finale.
4. Per la procedura di collegamento del filo elettrico, si veda la Figura Supplementare 1.
5. Per una panoramica dell'unità elettronica, si veda la Figura 7.

Figura 6: Diagramma per l'unità elettronica. I colori dei fili sono i seguenti: marrone = linea Tensione Corrente Alternata (VAC), blu = neutro VAC, verde e giallo = GND (Massa/Terra), rosso = Tensione Corrente Continua (VDC) positiva, nero = VDC negativo. I fili dati sono bianchi, ma per facilitarne l'identificazione, in questa figura sono mostrati in colore verde. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Scatola principale di giunzione dell'unità elettronica collegata al blocco gradiente di temperatura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Assemblaggio del blocco del gradiente di temperatura

1. Usa un sigillante adesivo per incollare il materiale isolante alla carcassa in acciaio inox. Lascialo asciugare tutta la notte.
2. Inserisci i sensori e le aste riscaldanti all'interno del blocco di alluminio.
3. Posiziona il blocco di alluminio all'interno della carcassa in acciaio inox, guidando i cavi attraverso i rispettivi fori per il collegamento all'unità elettronica.
4. Usa le cerniere per fissare il coperchio isolante in acciaio inoxabile al blocco.
5. Collega il sistema di raffreddamento al blocco di alluminio.
6. Posizionare il blocco del gradiente di temperatura nel laboratorio, assicurandosi che tutte le connessioni siano sicure e funzionali (Figura 8A). Assicurati che il laboratorio disponga di un tavolo robusto lungo almeno 2 m. Conferma che ci sia accesso a Ethernet e connessioni elettriche. Si desidera una temperatura ambiente controllata per un funzionamento ottimale.

5. Costruzione del sistema di scarico

NOTA: La linea di lavaggio è stata progettata per standardizzare le concentrazioni di_CO2 in ogni fiala all'inizio dell'incubazione. Consulta la Figura 8B per visualizzare il sistema di lavaggio con il blocco del gradiente di temperatura.

1. Taglia il tubo flessibile di diametro più piccolo in 10 pezzi, ciascuno di 15 cm di lunghezza. Attacca un ago a un'estremità di ciascuno dei 10 tubi più piccoli.
2. Taglia il tubo di diametro maggiore in un unico pezzo lungo 1 m. Posiziona un tappo a un'estremità di questo tubo e collega l'altra estremità al conduttore dell'aria ambiente in laboratorio.
3. Misura e segna il tubo più grande a intervalli di 5 cm lungo la sua lunghezza. Ad ogni intervallo segnato, inserisci un ago collegato a uno dei tubi più piccoli.

Figura 8: Blocco del gradiente di temperatura. (A) Blocco del gradiente di temperatura installato in laboratorio con il coperchio chiuso e (B) aperto con il sistema di scarico visualizzato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Descrizione dell'unità di iniezione dell'analizzatore di gas

NOTA: L'analizzatore di gas di questo sistema consente di misurare direttamente la concentrazione di_CO2 nelle fiale di vetro da 60 mL. L'intervallo di questo analizzatore di gas varia tra 0 ppm e 10000 ppm con una precisione di 0,04 ppm a 400 ppm. L'analizzatore di gas è dotato di un kit di riduzione del flusso che misura a una velocità di 1,17 mL/s.

1. Modificare il tubo di iniezione dell'analizzatore di gas aggiungendo un filtro esterno da 0,45 μm e un ago di iniezione (Figura 9).
   NOTA: Il filtro da 0,45 μm è stato aggiunto come precauzione aggiuntiva per evitare che l'acqua entri nell'analizzatore di gas. L'ago ha una dimensione di 18 G e dimensioni di 1,2 mm x 25 mm. L'ago è stato scelto in base al diametro per minimizzare i danni ai setti in gomma delle fiale di vetro da 60 mL.
2. Collega il tubo di iniezione dell'analizzatore di gas all'ingresso di collegamento dello strumento.
3. All'estremità del tubo di iniezione, collegare un connettore maschio Luer lock. Utilizzando un tubo flessibile con diametro interno di 1/4, fissa il blocco Luer al tubo di iniezione. Poi, collega il filtro da 0,45 μm usando un tubo flessibile per tenere tutto ermetico insieme.
4. All'estremità a vite del filtro da 0,45 μm, si usano un connettore maschio e uno femmina per fissare saldamente l'ago.

Figura 9: Unità di iniezione dell'analizzatore di gas. (A) Il tubo di iniezione dell'analizzatore di gas. (B) Un filtro esterno da 0,45 μm e un ago di iniezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Progettazione di trattamenti per l'incubazione

1. Seleziona campioni di terreno.
   NOTA: I campioni di suolo scelti per questo manoscritto dimostrano la funzionalità del protocollo e mostrano il tipo di dati che possono essere raccolti utilizzando questa configurazione.
2. Seleziona un intervallo di temperatura per l'incubazione a blocchi, che è definito dall'utente da 0 °C a 90 °C.
   NOTA: L'intervallo di temperatura per questo manoscritto era da 4 °C a 60 °C. Se il sistema viene utilizzato oltre questo intervallo, si seguono i protocolli di sicurezza del laboratorio quando si gestiscono temperature alte o sotto zero.
3. Pianifica la randomizzazione dei campioni.
   NOTA: Per questo manoscritto, i campioni sono stati randomizzati all'interno del blocco di temperatura (posizioni A-D). Sebbene questo studio abbia inizialmente testato la randomizzazione della lettura del campione dopo l'incubazione, ciò ha introdotto errori di etichettatura durante il processo di lettura. Pertanto, si dava priorità a un ordine di misurazione coerente (cioè dalle temperature alte alle basse).

8. Preparazione dei campioni per la pre-incubazione

NOTA: Per limitare i cambiamenti nelle comunità microbiche del suolo, i campioni di suolo dovrebbero preferibilmente essere incubati freschi il prima possibile dopo il campionamento. Tuttavia, a seconda dei vincoli sperimentali e della logistica, i campioni di suolo potrebbero dover essere essiccati all'aria per il trasporto e lo stoccaggio prima dell'incubazione. In questo manoscritto, è stata standardizzata una procedura di asciugatura all'aria per la lavorazione dei campioni prima dell'incubazione.

1. Setaccia il terreno fresco con un setaccio da 2 mm. Lascia asciugare il terreno setacciato a 40 °C per 24 ore. Questo terreno essiccato all'aria può essere conservato fino a ulteriori lavorazioni.
2. Metti il campione di terra in una scatola di metallo e mescolalo accuratamente. Distribuire il terreno miscelato in 22 fiale di vetro preetichettate da 60 mL. Con carta da pesata, aggiungi 3 ± 0,03 g di terra in ogni fiala da 60 mL.
3. Utilizzando una pipetta, regola il terreno alla capacità di ritenzione d'acqua desiderata (WHC) in base al metodo a imbuto. Dopo aver regolato il contenuto d'acqua al % di WHC target, annota il peso esatto di ogni fiala.
   NOTA: I campioni di suolo selezionati per questo manoscritto sono stati adattati al 60% di WHC.
4. Tappa le fiale con cotone per permettere lo scambio d'aria ambientale.
5. Pre-incubare i campioni per 10 giorni in un laboratorio a temperatura controllata a 20 °C.

9. Regolazione del WHC durante la pre-incubazione

1. Dopo 7 giorni di pre-incubazione, registra il peso delle fiale e aggiusta il WHC target. Usa una pipetta per essere preciso e aggiungi acqua quando necessario. Calcola l'acqua da aggiungere a ogni fiala usando l'Equazione 1.
   Acqua da aggiungere = peso_T0 (g) - peso_T7 (g) (1)
   dove il peso_T0 rappresenta il peso della fiala al tempo zero e il peso_T7 rappresenta il peso della fiala dopo 7 giorni.

10. Inizializzazione del blocco gradiente di temperatura

NOTA: Il sistema di raffreddamento è controllato tramite il pannello frontale dello strumento. Il sistema di riscaldamento è controllato tramite l'interruttore dietro lo strumento e un'interfaccia online.

1. Segui le istruzioni del produttore per ACCENDERE il sistema di raffreddamento. Premi il pulsante di accensione una volta (Oggetto A, Figura Supplementare 2). Assicurati che i valori per la temperatura °C e i giri lampeggino con il messaggio OFF. Questo indica che il sistema è ACCESO ma attualmente inattivo.
2. Attiva la pompa premendo il pulsante OK/Pompa (Voce E, Figura Supplementare 2) e premendo il pulsante + o - (Voce G e F, Figura Supplementare 2) per impostare i giri a 3500. Prima di attivare il sistema di raffreddamento, verifica che il livello del fluido abbia le luci verdi (Item L, Figura Supplementare 2). Se il livello del fluido è rosso, significa che non c'è abbastanza agente refrigerante. Contatta il responsabile del laboratorio o consulta il manuale del produttore.
3. Attiva il sistema di raffreddamento premendo Temperatura (Item B, Figura S2) e premendo i pulsanti + o - (Item D e C, Figura Supplementare 2) per impostare la Temperatura a -1,6 °C. Il punto di impostazione (Item O, Figura Supplementare 2) dovrebbe lampeggiare. Questo indica che il sistema di raffreddamento non è ancora al punto di regolazione.
   NOTA: La temperatura impostata nel sistema di raffreddamento non è la stessa di quella all'interno del blocco.
4. Accendi l'interruttore dietro il blocco (Figura supplementare 3). Assicurati che una luce verde si accenda Questo indica che il sistema di riscaldamento è ACCESO, ma il controllo della temperatura non è attivo.
5. Per attivare il controllo della temperatura del sistema di riscaldamento, apri l'interfaccia online del blocco gradiente di temperatura inserendo l'indirizzo IP 10.75.117.227 in un browser. Accedi con il nome utente e la password forniti per visualizzare la temperatura di ciascun sensore (Figura Supplementare 4). Questa interfaccia mostra i valori dei sensori, che vengono aggiornati ogni 3 secondi.
6. Regola la temperatura di riscaldamento impostata a 60,00 °C premendo le frecce su/giù . Premi il pulsante ON per attivare il sistema di riscaldamento.
   NOTA: Ci vuole circa un'ora perché il blocco raggiunga un gradiente di temperatura lineare stabile.
7. Dieci minuti dopo che il blocco è stato ACCESO, controlla il controllo del riscaldatore per assicurarti che funzioni. Lo strumento funziona quando la temperatura è diversa per ogni sensore.

11. Installazione dell'analizzatore di gas

1. Seguendo il manuale di istruzioni del produttore , accendi l'analizzatore dei gas premendo una volta il pulsante di accensione . Aspetta 45 minuti che lo strumento si scaldi.
2. Collega il PC alla rete Wi-Fi dell'analizzatore di gas, identificata dal nome host unico (TG15-XXXXX) e usa la password per connetterti.
3. Scrivi il nome host o l'indirizzo IP in un browser web e premi invio per connetterti. Poi, apri la sezione impostazioni e seleziona riduci portata (riduzione del flusso di portata). Se l'opzione è già selezionata, non modificare nulla nel software.

12. Preparazione per caricare campioni

1. Regolare il WHC seguendo la sezione 6 del protocollo 1 ora prima di iniziare l'incubazione.
2. Controlla il controllo del riscaldatore per assicurarsi che abbia raggiunto la temperatura desiderata 10 minuti prima di mettere i campioni nel blocco.
3. Accendi il conduttore ambientale situato nel laboratorio.
4. Collega il sistema di scarico e collega l'analizzatore dei gas al computer.

13. Collezionare cartucce a salve

1. Registra i blank seguendo queste due procedure:
2. Collega la linea di scarico al sistema di iniezione dell'analizzatore di gas e registra direttamente il CO₂ (in ppm) della linea di scarico.
3. Metti cinque fiale di vetro da 60 mL in un porta-labbra vuoto. Per ogni fiala, posiziona una linea di scarica. Dopo 1 minuto, togli la linea di scarico e chiudi la fiala. Aspetta quattro ore prima di misurare il_CO2 all'interno delle fiale.

14. Caricamento dei campioni nel blocco gradiente di temperatura

NOTA: Nel blocco avrai le posizioni a, b, c, d. Posiziona lo stesso campione nella posizione del blocco nella stessa posizione del blocco (Figura 10). Ad esempio, il campione numero 175 va nella posizione del blocco A da 1 a 22, il campione numero 45 va nella posizione B da 1 a 22, ecc.

Figura 10: Posizioni delle fiale all'interno del blocco. La lettera "S" indica sensore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Apri il blocco, posiziona il computer e il sistema di scarico sopra il coperchio del blocco (Figura 11). Su un tavolo mobile, posiziona le scatole contenenti i campioni.
   NOTA: Indossare una maschera KN95 per minimizzare la variabilità del_CO2 nei campioni. Questo impedisce al_CO2 della respirazione di contaminare le fiale.
2. Prepara un foglio di calcolo per registrare l'ora di chiusura (ora: minuto) di ogni singola fiala e, in parallelo, visualizza l'ora dell'analizzatore di gas.
   NOTA: Il tempo di chiusura di ogni fiala viene utilizzato per la normalizzazione del tasso durante l'elaborazione dei dati.
3. Inizia a caricare i campioni nel blocco del gradiente di temperatura. Lavora in lotti di otto campioni. Metti i campioni non tappati all'interno del blocco, partendo dalla parte più fredda. Questo significa che i primi otto campioni sono A1, B1, C1, D1, A2, B2, C2, D2.
4. Metti la linea di scarico in otto fiale e aspetta 1 minuto. Togli la linea di scarico e chiudi immediatamente le fiale. In un foglio di calcolo, annota l'ora esatta in cui ogni fiala è stata tappata.
   NOTA: Inserire con attenzione la linea di scarico in ogni fiala, assicurandosi che non entri in contatto con il terreno. Questo previene la contaminazione incrociata e aiuta a mantenere l'integrità del campione.
5. Mentre le prime otto fiale vengono scaricate, carica il lotto successivo di campioni nel blocco gradiente di temperatura. Ad esempio, i campioni di lavaggio sono: A1, B1, C1, D1, A2, B2, C2, D2. Il lotto successivo di campioni da aggiungere sono: A3, B3, C3, D3, A4, B4, C4, D4.
6. Metti la linea di sciacquaggio nel lotto successivo di campioni.
7. Ripeti questi passaggi finché il blocco non è completamente caricato.
8. Chiudi il blocco e aspetta 3,5 ore dal momento in cui l'ultimo campione è stato chiuso.
9. Imposta l'analizzatore di gas in modalità sospensione, premendo il pulsante di accensione due volte entro 3 secondi.
10. Spegni il sistema di scarico usando la valvola rossa posizionata nel muro.

Figura 11: Configurazione del blocco del gradiente di temperatura di caricamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

15. Iniziare con le misurazioni di_CO2

1. Porta l'analizzatore di gas fuori dalla modalità sospensione premendo il pulsante di accensione una volta all'ora prima di iniziare con le misurazioni di_CO2 . Controlla le impostazioni dell'analizzatore come indicato nella sezione 8.
2. Accendi il sistema di scarico e posiziona l'analizzatore di gas sul tavolo mobile (Figura 12).
   NOTA: Il tavolo mobile deve essere abbastanza alto perché il sistema di iniezione dell'analizzatore di gas raggiunga tutti i campioni.
3. Controlla la sezione diagnostica dell'analizzatore di gas (Figura supplementare 5). Assicurati che lo stato dello strumento sia verde per tutti i componenti. Qui ci sono due possibilità:
   1. Se tutto è verde, inizia l'analisi.
   2. Se ci sono componenti rossi o gialli, consulta il manuale dell'analizzatore di gas e, se necessario, chiedi assistenza tecnica. Se l'errore viene risolto, procedere con le misurazioni di_CO2 . Se l'errore non viene risolto, ferma l'esperimento.
4. Apri la sezione grafica dell'analizzatore di gas per visualizzare le misurazioni in tempo reale. Tieni presente che lo strumento misura costantemente il_CO2 dall'aria.
   NOTA: Il display delle misure è ritardato di ~3-5 secondi.
5. Dopo 3,5 ore di incubazione, inizia a misurare i campioni. A cominciare dalle temperature più alte. Ad esempio, i primi campioni da leggere sono: A22, B22, C22 e D22.
   NOTA: Indossa la mascherina KN95 quando misura i campioni a temperature <15 °C. Questo ridurrà il rumore nei dati.
6. Collega l'ago di iniezione dell'analizzatore a una linea di lavaggio tra i campioni. Questo renderà più facile la pulizia dei dati.
7. Sopra lo schermo, c'è una funzione REMARK nel software dell'analizzatore di gas. Ogni volta che si misura un campione, crea una osservazione UNICA e SEMPLICE . Non dimenticare di premere COMMENTO prima di eseguire ogni campione.
   NOTA: Usa numeri unici o l'ID univoco del campione come OSSERVAZIONE. Se viene commesso un errore nella REMARK, annota il tempo in cui il campione è stato misurato. Ad esempio, prendi nota delle iniezioni tardive, se la COMMENTAZIONE è stata terminata prima o tardi, ecc.
8. Inserire l'ago nella fiala da 60 mL per 20 secondi. Dopo questi secondi, estrai l'ago dalla fiala.
   NOTA: L'analizzatore di gas avrà problemi di pressione se l'ago rimane all'interno della fiala da 60 mL per più di 38 secondi. Evita questo perché l'analizzatore di gas smetterà di funzionare per qualche minuto, finché la pressione non si stabilizzerà di nuovo.
9. Segui questi passaggi per leggere i campioni e i cinque blank con l'analizzatore di gas:
   NOTA: Premi il pulsante OSSERVAZIONE nel software online dell'analizzatore di gas per iniziare e concludere una osservazione.
   1. Inizia la COMMENTAZIONE a hh:mm:00.
   2. Inserisci l'ago nella fiala a hh:mm:10.
   3. Togli l'ago dalla fiala a hh:mm:30.
   4. Ferma la OSSERVAZIONE a: hh:mm:45.
10. Cambia il filtro da 0,45 μm collegato all'ago di iniezione dell'analizzatore ogni 16 campioni. Questo filtro è pensato per catturare l'umidità e prevenire l'ostruzione dei filtri all'interno dell'analizzatore.
11. Ripeti questi passaggi per tutti i campioni.

Figura 12: Posiziona l'analizzatore di gas sul tavolo mobile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

16. Scarica dei campioni dal blocco gradiente di temperatura

1. Uno alla fine, prendi i campioni dal blocco e mettili in una scatola. Segui una di queste opzioni:
   1. Scarico mentre si misura il_CO2.
   2. Scarico dopo aver misurato l'ultimo campione di CO₂ .
      NOTA: Seleziona una delle due opzioni in base ai requisiti per l'analisi futura del campione dopo l'incubazione a blocchi o al programma di laboratorio. Ad esempio, lo step 16.1.1 potrebbe modificare la durata dell'incubazione per alcuni campioni, il che potrebbe influenzare i risultati delle analisi successive. Anche l'orario di laboratorio (ad esempio, orari di apertura e chiusura) potrebbe essere un fattore limitante.
2. Processare e conservare i campioni per analisi future.
   NOTA: In questo caso, tutti gli 88 campioni sono stati conservati dopo l'incubazione a blocchi. Utilizzando una spatola, l'intero campione è stato trasferito dalla fiala di vetro da 60 mL in sacchetti di plastica pre-etichettati.

17. Scaricare i dati

1. Per estrarre i dati raccolti con l'analizzatore di gas, accedi al software online dell'analizzatore di gas. Clicca su Impostazioni e poi clicca sull'icona Download .
2. Seleziona l'orario specifico in cui sono stati misurati il primo e l'ultimo campione. Clicca su Download.
3. Apri un nuovo foglio di calcolo, seleziona Apri file. Cambia la ricerca file in Tutti i file (*.*) e cerca il documento salvato nel passaggio precedente. Si aprirà una nuova finestra, poi selezionerà Termina.

18. Spegnimento degli strumenti

1. Spegni l'analizzatore di gas con il pulsante di accensione o tramite l'interfaccia software. Per spegnere lo strumento con il pulsante, premi il pulsante di spegnimento tre volte entro 5 secondi.
2. Spegni il sistema di raffreddamento. Premi lock (Item I, Figura Supplementare 2) e il pulsante OK/Pump (Item E, Figura Supplementare 2). Il rumore bianco dovrebbe smettere. Dopo che il rumore bianco è completamente sparito, premi il OFF in fondo.
3. Spegni il sistema di riscaldamento. Disattiva il sistema di controllo del blocco gradiente di temperatura usando l'interruttore dietro lo strumento. Assicurati che la luce verde si SPENGA (Figura supplementare 3).

19. Conversione di_CO2 ppm in frequenze respiratorie in μg C per kg di suolo all'ora

1. Importare i dati dell'analizzatore di gas nel software di post-elaborazione (abbiamo usato R) ed estrarre le seguenti variabili: REMARK, TIME,_{CO 2} e H₂O.
2. Crea una nuova colonna per estrarre i secondi di interesse, specificamente da >30 secondi a <35 secondi.
3. Rimuovere qualsiasi osservazione che abbia problemi legati alla caduta di pressione. Durante l'esperimento, le caliche di pressione potrebbero aver causato letture di_CO2 leggermente inferiori rispetto alle aspettative. Questi lievi cali (tra il 3% e il 5% inferiori rispetto al valore precedente o successivo) non sono reali variazioni di CO₂, ma piuttosto artefatti (errori) causati dalla caduta di pressione. Pertanto, rimuovere i valori di_CO2 che sono leggermente diminuiti (~3-5%) rispetto al valore precedente o successivo di_CO2 .
4. Calcola la concentrazione media di_CO2 (ppm) per i restanti punti dati. Per ogni campione, si sottrae la media dei cinque blank misurati.
5. Importare i dati di laboratorio nel software di post-elaborazione (ad esempio, R) ed estrarre le seguenti variabili: REMARK, peso del terreno asciutto e tempo di chiusura.
6. Per convertire il_CO2 ppm misurato dall'analizzatore in μg C per g di terreno, applichi l'Equazione 2:
   
   dove la concentrazione di_CO2 misurata dall'analizzatore di gas è espressa in ppm; Il peso molecolare del_CO2 è uguale a 44,01 g·^mol-1; P è la pressione barometrica, uguale a 1 ed espressa in atm; R è la costante universale del gas uguale a 0,082058 espressa in atm·^mol-1· ^K-1; lo spazio di testa è calcolato in base allo spazio di testa delle fiale di vetro da 60 mL espresse in mL; T è la temperatura interna assunta dello strumento, pari a 293,15 ed espressa in K; e il peso del suolo secco è espresso in g.
7. Poi, si divide per il tempo di incubazione espresso in ore e si moltiplica per 1000 per convertire i grammi in chilogrammi di suolo.
8. Infine, converti il μg di_CO2 in μg di carbonio usando i pesi molecolari di_CO2 e C. Questo comporterà velocità respiratorie espresse in μg C per chilogrammo di terreno all'ora.
9. Salva o esporta i dati processati per ulteriori analisi.

Risultati

Stabilità e distribuzione della temperatura del blocco
Durante lo sviluppo di questo protocollo, abbiamo testato la linearità e la stabilità temporale della temperatura all'interno del blocco. Dopo aver attivato il sistema di raffreddamento e il riscaldatore, il tempo di inizializzazione del blocco è di circa un'ora, durante la quale la maggior parte degli otto sensori di temperatura distribuiti equamente raggiunge la temperatura obiettivo e poi rimane costante dopo un overshoot (Figura 13A). Dopo questo periodo, le temperature registrate dagli otto sensori confermano una distribuzione lineare perfetta della temperatura lungo il blocco di alluminio (Figura 13B).

Figura 13: Linearità e stabilità temporale all'interno del blocco gradiente di temperatura. (A) Stabilità temporale delle temperature all'interno del blocco durante il periodo di incubazione, e (B) temperatura registrata dai sensori al momento di inizio dell'incubazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Temperatura del blocco e temperatura del suolo
Abbiamo testato il tempo necessario affinché il campione di suolo all'interno del blocco raggiunga la temperatura registrata dagli otto sensori (Figura 14). In questo studio, abbiamo misurato la temperatura dei campioni di suolo in otto diverse posizioni all'interno del blocco, situate vicino ai sensori. I sensori, posizionati all'interno del blocco, erano pre-stabilizzati alla temperatura bersaglio. Seguendo il protocollo sopra descritto, una volta che le temperature del blocco erano stabili, i campioni di terreno venivano inseriti all'interno del blocco. Per questo test, abbiamo utilizzato sensori aggiuntivi separati dal blocco. Abbiamo usato 15 g di terreno, assicurandoci che la sonda sensore fosse a pieno contatto con il terreno. I campioni di suolo sono stati lasciati senza tappo e la temperatura è stata registrata ogni minuto per un totale di 30 minuti. Durante questo test, il blocco fu leggermente chiuso per minimizzare la variazione di temperatura e riprodurre il più possibile le condizioni reali di utilizzo (completamente chiuso). Abbiamo scoperto che ci vogliono circa 12 minuti perché i campioni di suolo si stabilizzino alla temperatura desiderata. Abbiamo ritenuto accettabile questo tempo di stabilizzazione, dato che le incubazioni durano almeno 3,5 ore. Inoltre, abbiamo valutato la linearità della temperatura del suolo dopo 12 minuti di incubazione a blocchi. I risultati indicano che le temperature del suolo mostrano una relazione lineare, strettamente allineata con la linearità osservata negli otto sensori (Figura 15).

Figura 14: Temperatura del suolo registrata incubata a diverse temperature. I campioni A, B, C e D sono stati incubati in fiale posizionate vicino ai sensori corrispondenti (vedi Figura 10 per riferimento). La temperatura del suolo veniva registrata tramite una termocoppia inserita direttamente nei campioni di suolo. Le temperature specifiche monitorate da ciascun sensore sono le seguenti: (A) Sensore 1 (S1) a 4,1 °C, (B) Sensore 2 (S2) a 12,5 °C, (C) Sensore 3 (S3) a 20,1 °C, (D) Sensore 4 (S4) a 28,1 °C, (E) Sensore 5 (S5) a 36,1 °C, (F) Sensore 6 (S6) a 43,8 °C, (G) Sensore 7 (S7) a 51,9 °C, e (H) Sensore 8 (S8) a 60 °C. Dopo aver inserito i campioni di terreno nel blocco, ci vogliono circa 12 minuti per raggiungere la temperatura obiettivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 15: Forte correlazione lineare tra temperatura del suolo e temperatura del sensore. Quattro fiale con terra sono state posizionate vicino agli otto sensori nelle posizioni di blocco A, B, C e D. La temperatura del suolo veniva registrata tramite una termocoppia inserita direttamente nei campioni di suolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Interazione temperatura-umidità
C'è un'inevitabile interazione tra temperatura e umidità che deve essere valutata durante il periodo di incubazione. Ad esempio, le alte temperature possono accelerare l'evaporazione, mentre le basse temperature possono causare la condensazione dell'acqua. Per questo test, abbiamo utilizzato quattro campioni di suolo selezionati casualmente con diverse texture (Tabella Supplementare 2). Secondo il protocollo, ogni campione di suolo è stato posizionato nella stessa posizione del blocco su tutte e 22 le temperature. I risultati mostrano che dopo un tempo medio di incubazione di 3,5 ore, temperature più elevate comportano una maggiore perdita di umidità rispetto a temperature più basse, indipendentemente dalla consistenza del suolo (Figura 16). I suoli incubati a 60 °C hanno perso in media il 12% dell'acqua totale aggiunta, mentre i suoli incubati a 4,1 °C hanno perso in media solo l'1,88% dell'acqua totale aggiunta. Ciò significa che durante le 3,5 ore di incubazione a blocchi, i suoli sono stati mantenuti in condizioni ottimali di umidità, tra il 50% e il 60% di capacità di ritenzione d'acqua, indipendentemente dalla temperatura di^{incubazione 44,45} (Figura supplementare 6).

Figura 16: Perdita relativa di umidità del suolo durante l'incubazione a blocchi in quattro diversi campioni. La perdita di umidità è stata calcolata in relazione alla quantità totale di acqua aggiunta per aggiustare il WHC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Misurazioni della concentrazione di_CO2
Per testare l'accuratezza e la precisione dell'analizzatore di gas, abbiamo effettuato quattro misurazioni di un gas di riferimento certificato (413 ± 5 ppm CO₂), per le quali l'analizzatore ha registrato 413,71 ± 0,60 (ppm CO₂, media ± SD). Ciò confermò l'elevata accuratezza e precisione delle misurazioni di_CO2 registrate dall'analizzatore di gas. Inoltre, per rispettare le specifiche del produttore, dovrebbe essere effettuato un test annuale con un gas di riferimento certificato.

In considerazione del tempo di ritardo causato dalla linea di iniezione e dal kit di riduzione del flusso verso l'analizzatore di gas, sono stati effettuati molteplici test per determinare il tempo ottimale di misurazione. I risultati mostrano che la linea di iniezione causa un ritardo di circa cinque secondi. In questa configurazione, il tempo di misurazione ideale è di 20 s, consentendo un tempo sufficiente per riempire l'unità di rilevamento CO₂ e raggiungere un equilibrio per 5 s (Figura 17). Dato che il kit di riduzione del flusso misura a una velocità di 1,17 mL/s, questo tempo di misurazione corrisponde al campionamento del 39% del contenuto d'aria nelle fiale da 60 mL. Inoltre, abbiamo osservato che quando l'analizzatore di gas viene utilizzato come sistema chiuso, si verifica una caduta di pressione. Questa diminuzione si verifica durante l'intervallo di un secondo in cui non c'è iniezione d'aria mentre l'ago viene estratto dalla fiala. Per tenere conto di questa diminuzione di pressione durante l'elaborazione dei dati, abbiamo escluso i valori di_CO2 leggermente inferiori (tra il 3% e il 5%) rispetto al valore precedente o successivo.

Figura 17: Tempo ottimale di misurazione per un singolo campione di suolo incubato a tre diverse temperature. Questo grafico mostra il tempo di iniezione ed estrazione dell'ago, l'equilibrio di_CO2 per 5 s e la caduta di pressione associata al periodo di tempo selezionato. Incubation_ID mostra la posizione del blocco (C) e le posizioni delle fiale (5, 10 e 15). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Test del protocollo completo
Per valutare la funzionalità e la riproducibilità del protocollo, abbiamo incubato due campioni diversi, ciascuno con quattro repliche tecniche, su 22 temperature discrete che variavano da 4 °C a 60 °C. Questi campioni di suolo sono stati scelti per dimostrare il tipo di dati generati con questa configurazione e le sue prestazioni. Le caratteristiche specifiche del campione si trovano nella Tabella Supplementare 2. Il blocco gradiente di temperatura cattura in modo affidabile le velocità di respirazione del suolo dei diversi campioni di terreno in ogni punto di temperatura, permettendoci di visualizzare la curva di risposta alla temperatura. Inoltre, le curve di risposta alla temperatura risultanti per tutte le repliche erano quasi identiche, come riflesso dalla piccola deviazione standard attorno alle velocità medie di respirazione su tutte le temperature (Figura 18). Questi risultati dimostrano un'elevata riproducibilità e confermano la precisione del protocollo.

Figura 18: Tassi rappresentativi di decomposizione SOM (Rs) per due suoli, ciascuno misurato con quattro repliche tecniche incubate lungo l'intero gradiente di temperatura. I punti rappresentano la media delle frequenze respiratorie a ciascuna temperatura, e le barre di errore indicano la deviazione standard tra repliche tecniche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fu eseguito un secondo test per dimostrare l'applicabilità scientifica del protocollo. Abbiamo misurato i tassi di respirazione del suolo lungo l'intero gradiente di temperatura e adattato i dati utilizzando il modello di Arrhenius o MMRT (Figura 19). Questi campioni di suolo sono stati scelti per dimostrare le prestazioni del sistema a confronto con curve di risposta alla temperatura (le caratteristiche del campione sono fornite nella Tabella Supplementare 2). I risultati mostrano che i dati raccolti con il blocco del gradiente di temperatura possono essere ulteriormente analizzati testando diverse teorie sulla sensibilità alla temperatura dei tassi di decomposizione SOM. Tuttavia, emergono sfide quando si lavora con terreno fresco in qualsiasi esperimento. Durante i 10 giorni di periodo pre-incubazione, abbiamo osservato comunità fungine crescere all'interno di alcune fiale nei campioni di suolo oltre il set di campioni rappresentativi. Nonostante i nostri sforzi per rimuovere con cura le comunità fungine senza disturbare il suolo, questa crescita ha influenzato i risultati di alcuni campioni (Figura 20). Di conseguenza, abbiamo deciso di scartare i campioni interessati rimuovendo l'intero campione, non solo le singole fiale colpite dalla crescita fungina.

Figura 19: Risultati rappresentativi e velocità di respirazione (R) di quattro diversi campioni di suolo incubati nel blocco del gradiente di temperatura. La linea rossa rappresenta l'adattamento di Arrhenius (A,B), e la linea blu rappresenta l'adattamento MMRT (C,D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 20: Modelli di frequenza respiratoria per alcuni campioni colpiti dalla crescita fungina. Questi risultati sono esempi di (A,B) due campioni contaminati che sono stati esclusi da ulteriori analisi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Circuito base NO/NC. "C" può anche essere etichettato come "COM" per Comune. Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare 2: Pannello di controllo del sistema di raffreddamento. Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare 3: Interruttore del sistema e indicatore luminoso. (A) Interruttore del sistema di controllo del blocco a gradiente di temperatura; e (B) luce verde che indica che i sensori e il sistema di riscaldamento sono ACCESI. Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare 4: Controllo del blocco del riscaldatore a gradiente di temperatura nell'interfaccia online. Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare 5: Sezione diagnostica dell'analizzatore di gas. Tutto è verde significa che lo strumento è pronto per le misurazioni. Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare 6: Capacità di ritenzione d'acqua dei suoli incubati a diverse temperature, misurazioni registrate dopo 3,5 ore di incubazione a blocchi. Clicca qui per scaricare questo File.

Fascicolo supplementare 1: Istruzioni dettagliate per il cablaggio. Clicca qui per scaricare questo File.

Tabella supplementare 1: Elenco dei materiali con la quantità richiesta. Clicca qui per scaricare questo File.

Tabella supplementare 2: Caratteristiche dei campioni di suolo utilizzati per il test di perdita di umidità e protocollo completo. Questi campioni sono stati scelti per dimostrare la funzionalità del protocollo. La classificazione delle texture segue il sistema USDA, con grossolane, argilla, limo e sabbia espressi in percentuali. OC si riferisce al contenuto di carbonio organico (g C·^kg-1 suolo), il pH è stato misurato in acqua, e CaCO₃ rappresenta il contenuto di carbonato di calcio (g·^kg-1 suolo). Clicca qui per scaricare questo File.

Discussione

L'utilizzo di un blocco a gradiente di temperatura per misurare la risposta a breve termine dei tassi di decomposizione SOM presenta delle sfide, specialmente nel rilevare i tassi di respirazione a basse temperature. Le basse temperature possono inibire direttamente le attività catalitiche degli enzimi intracellulari ed extracellulari ^46,47. Pertanto, il tempo di incubazione deve essere sufficientemente lungo da garantire che le basse frequenze respiratorie all'estremità inferiore dell'intervallo di temperatura permettano un accumulo sufficiente di_CO2 nelle fiale di vetro da rientrare nel raggio di rilevamento dell'analizzatore di gas. In questa configurazione sperimentale, la temperatura minima era di 4,1 °C; questi campioni furono i primi caricati nel blocco e gli ultimi ad essere analizzati, offrendo un tempo di incubazione extra. I ~3,5 ore di tempo di incubazione a blocchi si sono rivelati sufficienti a rilevare variazioni rilevabili nella concentrazione di_CO2 nei campioni. Questa durata di incubazione probabilmente dipende dal tipo di suolo e in particolare dal contenuto di materia organica. Ad esempio, potrebbe essere che i suoli sabbiosi con basso contenuto di materia organica richiedano tempi di incubazione più lunghi rispetto ai terreni ricchi di carbonio. Tuttavia, nei test qui, il tempo di incubazione di 3,5 ore è risultato generalmente sufficiente per la maggior parte dei tipi di suolo e dei livelli di contenuto organico.

Oltre a ottimizzare il tempo di incubazione per il rilevamento del CO₂ a basse temperature, è altrettanto importante minimizzare la perdita di umidità all'estremità superiore del gradiente di temperatura. L'umidità del suolo svolge un ruolo cruciale nel trasporto, diffusione e dissoluzione dei substrati verso le comunità^{microbiche 48}. Ad esempio, l'umidità del suolo può limitare la frequenza respiratoria limitando la diffusione del substrato a bassi livelli di umidità e riducendo la disponibilità di ossigeno a livelli elevati^45,49. Pertanto, minimizzare la perdita di umidità ad alte temperature è rilevante per evitare che l'umidità limiti l'accesso microbico ai substrati. Sebbene le fiale di questo protocollo fossero completamente sigillate, l'acqua si condensava sui tappi e sulle pareti interne delle fiale. Questa condensa era considerata umidità persa dal suolo. Così, abbiamo ridotto il tempo di incubazione da 4 ore, come in Robinson et al. 2017⁴¹, a 3,5 ore. Sebbene non fosse possibile mantenere livelli di umidità completamente costanti in tutti i trattamenti termici, i suoli sono stati mantenuti a livelli ottimali di umidità durante il periodo di incubazione di 3,5 ore. Anche ad alte temperature, il WHC del suolo rimaneva sopra il 50%, garantendo che la disponibilità d'acqua non limitasse l'accesso microbico ai^{substrati 44,45}.

Un'altra considerazione importante è l'intervallo di temperatura dell'incubazione. Sebbene il sistema di raffreddamento possa raggiungere temperature fino a -30 °C e il sistema di riscaldamento fino a 320 °C, il materiale isolante ha una tolleranza di temperatura da -183 °C a 148 °C. Le fiale di vetro utilizzate in questo sistema possono resistere a 500 °C. Sebbene questi intervalli siano ampi, incubare campioni sopra i 100 °C rappresenta una preoccupazione per la sicurezza dell'operatore. Per evitare il surriscaldamento, è stato aggiunto un resistore termico, assicurando che il sistema di riscaldamento si spenga automaticamente se il blocco di alluminio raggiunge i 90 °C. L'inclusione di questa resistenza termica è cruciale a causa del sovrappeso di inizializzazione osservato (Figura 13A). Se la temperatura durante l'inizializzazione supera i 90 °C, il sistema verrà disabilitato. Date queste limitazioni, raccomandiamo di utilizzare questa configurazione a una temperatura massima di 60 °C per prestazioni sicure e affidabili. Sono necessari ulteriori test per l'incubazione dei campioni di suolo sotto 0 °C per garantire una rilevazione affidabile del_CO2 , poiché la condensazione e la relativa variabilità dell'umidità possono influenzare le misurazioni a temperature sotto zero. Per questo protocollo, abbiamo scelto un limite di temperatura inferiore di 4 °C, al quale non si è osservata condensa. Se il sistema viene utilizzato a intervalli di temperatura più ampi, raccomandiamo di implementare ulteriori linee guida di sicurezza termica.

Un altro potenziale vincolo di questo metodo è che il periodo di incubazione relativamente breve non permette alle comunità microbiche di adattarsi ai cambiamenti di temperatura. La risposta alla temperatura dei suoli esposti a un riscaldamento sostenuto è stata oggetto di molti studi, in particolare con l'obiettivo di testare le teorie di adattamento^microbico 27,43,47,50,51. L'adattamento microbico è stato proposto per spiegare l'effetto decrescente nel tempo del riscaldamento sperimentale sui tassi di respirazione^{del suolo 47}. Tuttavia, la metodologia qui presentata è stata sviluppata per misurare la risposta termica a breve termine dei tassi di decomposizione SOM. Sebbene l'adattamento microbico sia improbabile che avvenga in brevi periodi^{di tempo 47}, uno studio recente ha utilizzato una metodologia simile per quantificare il tasso di adattamento microbico incubando suoli da un gradiente geotermico. In questo studio, l'MMRT è stata adattata per stimare parametri chiave, inclusi gli ottimi di temperatura e i punti di flessione. Confrontando questi parametri tra i suoli del gradiente geotermico, i risultati mostrano che il tasso di adattamento microbico è significativamente inferiore al tasso di^{riscaldamento 52}. Questo studio sottolinea l'importanza di comprendere l'intera curva di risposta termica, in particolare catturando l'ottimale della temperatura e i punti di svolta dei processi biologici del suolo (Figura 19C,D). Alla luce di questi risultati, raccomandiamo di campionare comunità microbiche in più punti di temperatura durante l'incubazione a blocchi per valutare come la composizione e le funzioni delle comunità microbiche si corrispondano ai tassi respiratori e ai parametri di sensibilità alla temperatura.

Il blocco gradiente di temperatura descritto in questo articolo offre vantaggi significativi rispetto alle metodologie tradizionali. Un vantaggio importante è che consente ai ricercatori di misurare in modo efficiente e accurato i tassi di decomposizione della SOM a 22 temperature discrete con piccole quantità di suolo. Questo rappresenta un miglioramento metodologico rispetto all'incubazione di campioni di suolo a poche temperature discrete, che costringe i ricercatori ad applicare il coefficiente di temperatura Q₁₀ - un metodo che molti studi hanno messo in^{discussione 12, 13 e 15}. Un altro vantaggio significativo è che questa configurazione raccoglie dati che catturano chiaramente la forma e la ripida della curva di risposta termica. Il numero di trattamenti a temperatura discreta lungo un ampio gradiente di temperatura ci permette di identificare la temperatura del punto di flessione e l'ottimale dei processi biologici, permettendo confronti tra i trattamenti. Gli esempi presentati in questo manoscritto mostrano due schemi distinti (Figura 19A,B vs. Figura 19C,D), che i ricercatori possono analizzare ulteriormente utilizzando diverse teorie di sensibilità alla temperatura. Alcuni esempi supportano la teoria di Arrhenius, in cui le velocità di reazione aumentano esponenzialmente con la temperatura (Figura 19A,B). Al contrario, altri esempi si allineano con la teoria MMRT, mostrando una risposta unimodale con un chiaro ottimale di temperatura (Figura 19C,D). Questi due diversi modelli indicano che il protocollo di incubazione a blocchi di temperatura presentato è in grado di riprodurre entrambi i tipi di curve di risposta, che possono essere utilizzate per testare teorie sulla sensibilità alla temperatura dei tassi di decomposizione SOM, approfondiendo così la nostra comprensione della termodinamica, della biologia e della chimica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fusibile di vetro da 630 mA	RS	563-637	https://uk.rs-online.com/web /p/fusibili-cartuccia/0563637?gb=s
Sigillante adesivo	Innotec	01.2451.0000	https://www.innotec.nl /producten/adheseal
Blocco di alluminio	Metaalketen	96082150.1	https://www.metaalketen .com/alluminio/
Nastro di alluminio	Manutan	A159435	https://www.manutan.nl/nl/mnl/aluminiumtape -met-schutlaag-50565-50-m-x-50-mm-tesa -a159435?shoppingab=true& gad_source= 1& gclid=CjwKCAjw74e1Bh BnEiwAbqOAjE5Tw3-r3xiW 9FWALDZMlVUWpqJpQQ R_zwwXR8_R6Sb1Ce_8v x96jxoCtx4QAvD_BwE
Filo nero	RS	361-787	https://nl.rs-online.com/web /p/filo-collegamento/0361787
Filo blu	RS	724-4392	https://nl.rs-online.com/web /p/filo-collegamento/7244392
Filo marrone	RS	724-4395	https://nl.rs-online.com/web /p/filo-collegamento/7244395
Pressa a cavia	RS	807-9786	https://nl.rs-online.com/web/p /ghiandole a cavi/8079786?cm_ mmc=NL-PLA-DS3A-_-goog le-_-CSS_NL_EN_Cables_% 26_Wires_Whoop-_-(NL:Who op!)+Cavo+Ghiandole-_-807978 6& matchtype=&; AUD-8271861 83926:pla-339598489905&; gcli d=Cj0KCQiAw8OeBhCeARIsA GxWtUyscrqjF3FwA6j2jqUyeg_ s70tOXBRuYRF90pwubv3Po8v sbZSJhV4aAq84EALw_wcB& gc lsrc=aw.ds
Sega circolare	Ryobitools	RWSL1801M	https://nl.ryobitools.eu/elektrisch-g Ereedschap/Zaagmachines/Cirkelz Agen/RWSL1801/RWSL1801M/?gad_so urce=1& gclid=Cj0KCQjw2ou2BhCC ARIsANAwM2Easx4PAZzvVYvFFUD ZKemTdqNDXsde_NDPSB8FAlGu7 8Hzy2j3TuoaAhTjEALw_wcB
Chiusure	Kramp	HS491976	https://www.kramp.com/shop-nl/nl/p /verstelbare-haakvergrendeling-118- 128-typ.3--HS491976
Agente refrigerante più fresco e naturale	Dijkstra Vereenigde	L035004186	https://www.laboratorium-apparatuur .nl/ika-rc2-green-basic-koelthermo staat-30-c-bad-volume-4-litre-l035004186
DIN Rail	RS	648-5722	https://nl.rs-online.com/web/p/din-ra ils/6485722?cm_mmc=NL-PLA-DS 3A-_-google-_-CSS_NL_NL_Pmax _Test-_--_-6485722& matchtype=&; & g ad_source=1& gclid=CjwKCAjw8f u1BhBsEiwAwDrsjOqGDs92gjrJHkp SsYmOiS0OK6tC9U_fMHEhlmvu7r SbNp8VnmuDERoCC0UQAvD_ BwE& gclsrc=aw.ds
Doppi ponti	RS	803-7530	https://nl.rs-online.com/web/p/din-rail -terminal-accessories/8037530?sear chId=11c9702f-3312-4bb0-a826-e9d 50bd91ee1& gb=s
Cavo Ethernet	RS	657-2090	https://nl.rs-online.com/web/p/ cavo ethernet/6572090
Maschera facciale	KN95	NA	https://www.bol.com/nl/nl/p/kn95- maschera-faccia usa e getta-ffp2-x-1-maschera s-kn95-wegwerp-gezichtsmasker-ffp 2-x-1mondkapjes/930000000131403 0/? Referrer=NLGOOFS&; utm_source =google& utm_medium=free_shopping
Connettore femmina	qosina	17642	https://www.qosina.com/female- connettore-a-luer-femmina-17642
Filtro 0,45 & micro; m	Whatman	10462650	https://us.vwr.com/store/product/1394 3097/whatmantm-puradisc-aqua-30-m m-syringe-filter-0-45-m-whatman- products-cytiva
Isolamento flessibile (tubo)	Celsis	4600000198	https://www.celsisbv.nl/k-flex-plaati solatie-op-rol-st-10e-1x10mtr-10mm .-bl-s3-d0/4600000198?gad_source =1& gclid=Cj0KCQjw8MG1BhCoARI sAHxSiQknvLK3RcqgqXwR1Ma7V PznSz8IasKUGvLo0SySzLiff2o_kK Vjip0aAtATEALw_wcB
Tubo flessibile	Avantor	MFLX06491-14	https://www.avantorsciences.com /de/en/product/38670173/bev-a- linea-v-trasferimento-pompa-tubo
Kit di riduzione del flusso	LICOR	7800-113	https://www.licor.com/support /Analizzatori di Tracce di Gas/argomenti/re duced-flow-rate-kit-7800-113.html
Terminale portafusibili	Elektramat	401144228	https://nl.mouser.com/ProductD etail/Phoenix-Contact/3270200? qs=zdVlZaK%252BC241RFTPi Xj4mA%3D%3D& mgh=1&; utm_i d=20328035028& gad_source=1 & gclid=CjwKCAjw8fu1BhBsEiwA wDrsjBg9elAMYS9bWJ1Bd086J 7fGBWvcRWZ51okdr2qJgOlOTd BdrUZ_rBoCvuUQAvD_BwE
Analizzatore di gas	LICOR	LI-7815	https://www.licor.com/env/ prodotti/gas in tracce/LI-7815
Fiale di vetro con tappi 60 mL	Cole-Parmer	GZ-99535-25	https://www.coleparmer.com/i/ Cole-Parmer-Precleaned-EPA- Fiale-Vetro Trasparente-60-ML-72-CS/9953525
Filo verde/giallo	RS	721-0636	https://nl.rs-online.com/web /p/filo-collegamento/7210636
Manici	RS	456-539	https://nl.rs-online.com/web/p/ maniglie di cassetto-armadietto-han dles/0456539
Barres riscaldanti	RS	860-6984	https://www.reichelt.com/nl/nl/shop /prodotto/verwarmingspatroon_hotr od_20_0x250_mm_1250_w_230_ v_-317248? PROVID=2809&; gad_s ource=1& gad_campaignid=22415 164764& gbraid=0AAAAADwnxtY mY6n2NPja4HF_ftn_kJY-U& gcli d=CjwKCAjwiNXFBhBKEiwAPSa PCaYMjfVMKQazvkQk_deE2koc XA9SZ_ltbPIefniuRsmzBwN_oQ rfQhoCegUQAvD_BwE
Cerniere	RS	448-1497	https://benl.rs-online.com/ Tela/p/cerniere/4481497
Tubo	Wildkamp	750568	https://www.slangenboer.nl/wat erslang-cristal-al-961?channabl e=41cdee736b7500534230313 0353131333924& bg_source=ga & bg_campaign=21584331548& bg_kw=pla-293946777986-mi-1 09646330-pi-SB01051139-ppi- 293946777986& bg_source_id= 709628610149& gad_source=1 & gad_campaignid=215843315 48& gbraid=0AAAAADegGXwz 91MJFzGxBRxjCSRew10eG& gclid=CjwKCAjwiNXFBhBKEiw APSaPCZNCdBEfvnV2pYYPeV SQaiG_UKP0q_eknv0lC_N_0Y WIIZQvze8TEhoCzPUQAvD_BwE
Spina a tubo	Wildkamp	11000357	https://www.wildkamp.nl/pro Duct/Slangtule-RVs-316L-Lost-W Ax-Buitendraad-X-Slangtule-BS P-X-10-0-mm/11000357
Ago per iniezione	Merkala	303262	https://www.merkala.nl/bd-mic rolance-injectienaalden-18g-ro ze-1-2x40mm-100-stuks.html? gclid=CjwKCAjw_Na1BhAlEiw AM-dm7DrC9mGkmpNN8krYe CmkvpEeSv4CuH3I2Px71KJxY YSm-vjVu2LclRoCwuwQAvD_BwE
Analizzatore di gas a tubo di iniezione 1/4"	VWR	MFLX06491-12	https://us.vwr.com/store/pr Oduct/39537334/Bev-A-Line- V-Transfer-pump-tubing
Materiale isolante	Technische Unie	3603842	https://www.technischeunie. nl/product/prd1899911190
Accoppiamenti al ginocchio	Kramp	MMI9006K	https://www.kramp.com/shop-nl/ NL/P/Haakse-Koppeling-instelbaa r-bu-bu-3-8-bsp--MMI9006K
Tubo di grande diametro 3/8"	Avantor	39213360	https://www.avantorsciences.co m/us/en/product/39213360/mast erflex-transfer-tubing-flexible- vinyl-avantor
Viti M6, esagono	RS	281-120	https://nl.rs-online.com/web/p/so cket-screws/0281120?srsltid=Afm BOorVGq-ZyA2yrJG1kU7SHGiZ EblaRz0nDmX7MwhzIRjcc6P4YIYE
Scatola principale di giunzione	RS	Controlla Dia.	https://nl.rs-online.com/w eb/p/general-purpose-enclo sures/2896320?gb=s
Connettore maschio	qosina	12090	https://www.qosina.com/male- connettore to-male-luer-lock-12090
Luer maschio	Walternedical	BPC04M	https://www.waltersmedical.co. uk/product/nibp-connector-male-luer-slip/
MCB - Siemens SENTRON	RS	3RF2320-1AA02	https://nl.rs-online.com/we b/p/mcbs/2383188?gb=s
Alimentazione PE/DND	RS	687-9411	https://uk.rs-online.com/we b/p/din-rail-terminal-blocks/ 6879411?searchId=c9a9c1 b1-3def-40d0-8b14-b792f8269615& gb=s
LED di indicazione di potenza	RS	909-2437	https://uk.rs-online.com/ web/p/piloti/9092437?gb=s
Alimentazione elettrica	Antratek	X-2902992	https://nl.rs-online.com/web/ p/din-rail-power-alimentator/054 0731?srsltid=AfmBOoqMPIO Av7bZd1Qu_Acy3KMFR0-x OD_Hkw3NeQCYyzKJLzEGXzxQ
Ponti per il quinnopoli del direttore	RS	803-6713	https://uk.rs-online.com/web /p/din-rail-terminal-blocks/80 36713?searchId=7de6627a- 3634-42ed-a600-2e3ce8974fe7&; gb=s
Filo rosso	RS	361-822	https://nl.rs-online.com/web /p/filo-collegamento/0361822
Terminale ad anello 2,5 mm²	RS	534-569	https://uk.rs-online.com/ web/p/terminali ad anello/0534569
Sensori	Antratek	X-DTS-S3C	https://www.antratek.nl/dig sensore-temperatura ital-cavo 1m
Septa Red Butyl	HomeGreen	A255	https://www.homegreen.nl/la b-benodigdheden/septa-rood -butyl-20-mm?srsltid=AfmBO ooStonU5v9Q9j7i_RgQMJ9F m6ZVbPbIRU0cD1_47-BEVmb1r5I5
Passaggio a conduttore singolo	Elektramat	401167865	https://www.elektramat.nl/ catalogsearch/result/?q=401167865
Cavo di alimentazione monofase	RS	626-6694	https://nl.rs-online.com/w eb/p/cavi di alimentazione/6266694?gb=s
Filo monofase	RS	775-6123	https://uk.rs-online.com/web /p/cable-power/7756123?gb=s
Piccola scatola di giunzione	RS	498-5387	https://nl.rs-online.com/web/p /recinti a uso generale/4985387
Relè a Stato Solido	RS	467-4762	https://nl.rs-online.com/web/p /relè a stato solido/4674762
Trapano a spirale	Ericks	10471300	https://shop.eriks.nl/nl/gereed schappen-verspanende-geree dschappen-boren-hss-en-hsse -boren-cilindrische-schacht/spir aalboor-din340-hsse-geslepen- type-ti-5-80mm-12592599/?srslt id=AfmBOoopMLgX1mtyuUxkU KU7jW4fYY1bY5wSTvSGQUkO zTc6E2wdxUZQ
Involucro e coperchio in acciaio inox	247 Tailore steel		https://247tailorsteel.com/nl/?ut m_term=24%207%20steel& utm _campaign=B+-+NL+-+247tailo rsteel+-+NL+-+Doelvertonings percentuale+%3E+Conv.+Waa rde+met+Doel-ROAS& utm_so urce=adwords& utm_medium= ppc& hsa_acc=2007690635& h sa_cam=783787418& hsa_grp =118504886580& hsa_ad=67 1662182959& hsa_src=g& has _tgt=KWD-374862287021& hs a_kw=24%207%20steel& has _mt=p& hsa_net=adwords& has _ver=3& gad_source=1&; gclid= Cj0KCQjw8MG1BhCoARIsAHx SiQnhmktBk_3c_wobSJobrTVp4 _nqiW26Zt7XzSkHdK-htW8medy NCcQaAjbrEALw_wcB
Interruttore a 2 vie	RS	746-9336	https://nl.rs-online.com/web/p /maniglie dell'interruttore a camca/7469336
Ponte terminale	Elektramat	401043503	https://www.elektramat.nl/phoenix-c ontact-doorverbindingsbrug-voor-rijg klem-2-polig-5-2-mm-rood-fbs-2-5/?c hannable=0141ac6964003330383936 ec& utm_source=google-surfaces&; utm _medium=organic& bg_source=ga& bg_ campagna=19011971421& bg_kw=-mi-9 214030-pi-401043503-ppi-& bg_source _id=&; gad_source=1&; gclid=CjwKCAjw 8fu1BhBsEiwAwDrsjE2kRcDZUHPupfy haLoTzWLqM9v8HKaiI67st4UOmUXIN 9OaI25ALRoCvmUQAvD_BwE
DAQ del termostato	Antratek	X-300-I	Temperaturaü Berwachung & Termostato (+X-DTS-S3C) von ControlByWeb (antratek.nl)
Frenatura universale	Mach4Metal	MACH-ID 7580	https://mach4metal.com/en /fresatrici/cnc/FEHLM Ann-Picomax-P54-2
Passaggio conduttore Wago 3	RS	803-6713	https://nl.rs-online.com/web/ p/din-rail-terminal-blocks/80 36713?cm_mmc=NL-PLA-D S3A-_-google-_-CSS_NL_N L_Pmax_0525-_--803671 3& matchtype=&; & GCLSRC=aw.d S& gad_source=1&; gad_campa ignid=22555696009& gbraid=0 AAAAADkeWNNXeREaDmJ5n yYqYMqp-c7A6& gclid=CjwKCAj wtfvEBhAmEiwA-DsKjilXxL8uO 4Jo6XyDesHGaQkoz6Ggi4ATI6 FUInWV9TxmIX519DGIZBoCh9 YQAvD_BwE
Connettore Wago	RS	883-7557	https://uk.rs-online.com/ web/p/standard-terminal-b locks/8837557?gb=s
Bustine di estremità fili (100 pezzi)	Elektramat	401173609	https://www.elektramat.nl/solar -adereindhuls-geisoleerd-2-5mm 2-hulslengte-8mm-blauw-per-100 -stuks-1505145/?channable=014 1ac6964003430344a4& utm_source =google-surfaces& utm_medium =organic& bg_source=ga& bg_c ampaign=17673967332& bg_kw= -mi-9214030-pi-401173609-ppi-&; bg _source_id=&; gad_source=1&; gclid= CjwKCAjw8fu1BhBsEiwAwDrsjNms VYTNZ5TuXEHtsF34hcY-T5kLFnhi zir1fUsR3UYcG9bxmugqJRoCp_Y QAvD_BwE