Articolo metodologico

Iniezione intratecale lombare di SOD1-ASO per il targeting preciso del sistema nervoso centrale e l'efficacia predittiva nei topi umani SOD1-G93A ALS

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DOI:

10.3791/69788

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24 febbraio 2026

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1Biogen

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive i metodi di somministrazione intratecale per terapie mirate al SNC nei topi adulti, concentrandosi sulla precisione del protocollo e sulla possibilità di iniezioni ripetute. Include i risultati di uno studio di validazione in cui gli oligonucleotidi antisens hanno ridotto l'espressione mutante di SOD1 nei topi modello SOD1-ALS, supportando l'utilità di questo approccio nella ricerca preclinica sulle malattie neurodegenerative.

Abstract

La somministrazione intratecale (IT) di terapie mirate al sistema nervoso centrale (SNC) offre una via minimamente invasiva per la somministrazione diretta del farmaco nel liquido cerebrospinale (LCR), facilitando una maggiore specificità e coinvolgimento del bersaglio. Sebbene la cateterizzazione IT sia standard per un parto prolungato nei ratti, la sua applicazione nei topi è limitata da vincoli anatomici e da un rischio aumentato di complicazioni legate alla procedura, inclusi lesioni spinali e infezioni. Per superare queste limitazioni, abbiamo utilizzato una tecnica acuta di puntura a ago per la somministrazione di farmaci IT nei topi adulti, fornendo un'alternativa riproducibile e meno invasiva compatibile con regimi di dosaggio singolo o ripetuto. In un modello murino transgenico di sclerosi laterale amiotrofica (SLA) che presenta la mutazione SOD1-G93A, abbiamo ottenuto una somministrazione efficiente di oligonucleotidi antisens (ASO) che mirano al gene SOD1. Questo approccio ha efficacemente ridotto l'espressione di SOD1 mutante e ha migliorato significativamente il fenotipo della malattia, come dimostrato dalle valutazioni elettrofisiologiche e dei biomarcatori. Questi risultati validano sia il metodo di somministrazione dell'IT sia l'efficacia terapeutica, con risultati paragonabili alla somministrazione intracerebroventricolare (ICV). Soprattutto, la tecnica rispecchia le procedure utilizzate negli studi clinici sull'uomo, offrendo una forte rilevanza e utilità traslazionale nella valutazione preclinica degli interventi diretti dal SNC. Sebbene sia necessaria competenza tecnica per garantire coerenza ed evitare effetti fuori bersaglio, questa strategia di erogazione IT rappresenta una metodologia robusta, riproducibile e clinicamente rilevante per promuovere lo sviluppo terapeutico nei modelli animali di piccole dimensioni.

Introduzione

In questo studio, descriviamo un protocollo di iniezione intratecale lombare (IT), lo confrontiamo con la somministrazione intracerebroventricolare (ICV) e valutiamo gli esiti farmacodinamici e la tollerabilità per guidare lo sviluppo di terapie mirate al sistema nervoso centrale (SNC). Le terapie mirate all'RNA, in particolare gli oligonucleotidi antisens (ASO), rappresentano una modalità promettente per le malattie del SNC grazie alla modulazione post-trascrizionale dell'espressione genica. Questi approcci sono particolarmente rilevanti per i disturbi neurodegenerativi, dove la perdita neuronale progressiva sottolinea la necessità di interventi precisi, localizzati e tempestivi per modificare potenzialmente la progressione della malattia. Qui confrontiamo direttamente l'efficacia del protocollo di iniezione IT con la somministrazione ICV per le terapie ASO.

Negli studi preclinici, iniezioni intratecali lombari in topi adulti (maschi o femmine, 30-70 giorni, peso 13-20 g) sono state utilizzate per somministrare agenti farmacologici o vettori biologici direttamente nel liquido cerebrospinale (LCR) per il sistema nervoso centrale (SNC) che miraa 1,2. Volumi di iniezione di 5-10 μL vengono tipicamente somministrati lentamente per limitare gli aumenti transitori della pressione del liquido cerebrospinale (LCR) e il reflusso, con accesso intratecale ottenuto tramite lo spazio intervertebrale L5-L6 1,2. Il successo procedurale dipende da una tecnica attenta per evitare lesioni neurologiche, con l'età e il peso corporeo che influenzano il volume e la gestione del liquido cerebrospinale. L'uso di aghi a spessore fine (ad esempio, un ago da 27-30 G accoppiato a una siringa Hamilton da 25 μL) consente una somministrazioneaffidabile 2. Le principali sfide tecniche includono la minimizzazione delle perdite di spazi morti, la prevenzione di iniezioni errate epidurali e perdite, e la riduzione della variabilità dipendente dall'operatore che può influire sull'accuratezza del dosaggio e sulla distribuzione del liquido cerebrospinale.

Sviluppare terapie efficaci per i disturbi del SNC rimane una sfida importante a causa della complessità strutturale e dell'eterogeneità cellulare del SNC. Queste caratteristiche ostacolano la somministrazione mirata del farmaco e limitano la biodistribuzione attraverso molteplici barriere anatomiche e fisiologiche, rendendo necessarie strategie specializzate di somministrazione. Un ostacolo chiave deriva dalle barriere fisiologiche e anatomiche in tutto il SNC che limitano la penetrazione dei farmaci. Il cervello e il midollo spinale sono racchiusi in tre strati meningei: la dura madre, la madre aracnoidea e la pia matre che, insieme alla barriera emato-encefalica (BBB), offrono una difesa formidabile contro i farmaci circolanti e altre molecole nel sangue. Sebbene siano fondamentali per mantenere la stabilità del SNC, queste barriere ostacolano significativamente la somministrazione di grandi molecole idrofile come ASO, anticorpi monoclonali e vettorivirali 1,2,3,4. L'amministrazione IT offre un modo per aggirare queste restrizioni introducendo terapie direttamente nel liquido cerebrospinale all'interno dello spazio subaracnoidea. Questa via di somministrazione facilita la distribuzione dei farmaci tra i compartimenti del SNC, favorendo una penetrazione più ampia dei tessuti e consentendo così un coinvolgimento efficace con i bersagli espressi in diversi tipi cellulari all'interno del SNC. Dal suo primo utilizzo da parte di Hylden e Wilcox nel 1980 per la somministrazione di morfina neitopi 1, le iniezioni di IT sono diventate un metodo più diffuso per somministrare una varietà di agenti terapeutici, inclusi piccole molecole, biologici, vettori di terapia genica e ASO 5,6,7,8,9,10.

Gli ASO sono oligonucleotidi a singolo filamento ingegnerizzati chimicamente progettati per legare sequenze di RNA complementari e modulare l'espressione genica attraverso meccanismi come la degradazione mediata da RNase H, la modulazione di splice e l'inibizione sterica dellatraduzione 11,12,13,14,15. Miglioramenti chimici come modifiche della colonna dorsale fosforotioati, sostituzioni di 2'-O-metossietil (2'-MOE) e residui etilici vincolati ne migliorano la stabilità, l'affinità di legame e la resistenza allenucleasi 6. Queste proprietà hanno supportato la loro applicazione nel mirare a geni patogeni implicati nei disturbi neurogenetici. I trattamenti basati su ASO somministrati intratecalmente hanno dimostrato un beneficio clinico in malattie come l'atrofia muscolare spinale (SMA) e la sclerosi laterale amiotrofica (ALS)12,13,14,15. Ad esempio, Nusinersen (Spinraza) aumenta l'inclusione dell'esone 7 nei trascrizioni SMN2 per compensare la perdita di SMN1 in SMA 7,14. Strategie simili mirate ai trascrizioni mutanti di huntingtina sono state esplorate anche nella malattiadi Huntington 12,13. Sebbene questi studi siano stati interrottiall'inizio del 16, sottolineano il continuo interesse per gli approcci ASO diretti dal CNS.

La SLA è un disturbo neurodegenerativo fatale caratterizzato da una progressiva degenerazione sia dei neuroni motori superiori che inferiori. La malattia, che colpisce tra 6 e 9 individui ogni 100.000 nel mondo e si verifica a un tasso di circa 2 casi ogni 100.000 anno-persona, presenta un peggioramento graduale di debolezza muscolare e spasticità, con la maggior parte dei pazienti che soccombe a insufficienza respiratoria neuromuscolare entro 2-3 anni dall'inizio deisintomi a 17. Sebbene la maggior parte dei casi sia sporadica (SLA), circa il 10% è familiare (fALS), offrendo spunti sui fattori genetici della malattia. Tra i geni più studiati vi è la dismutasi superossida di Cu/Zn 1 (SOD1), che rappresenta quasi il 15-20% della fALS, meno del 2% della sALS, ed è ereditata in modo autosomicodominante 18. SOD1 codifica un enzima antiossidante citoplasmatico che desintossizza le specie reattive dell'ossigeno convertendo i radicali superossidi in perossido di idrogeno. Le forme mutanti di SOD1, come G93A, A4V e H46R, mostrano instabilità conformazionale, portando all'aggregazione proteica e a un guadagno di funzione tossico che contribuisce allo stress ossidativo, alla disfunzione mitocondriale e all'eccitossicità 19,20,21,22,23,24,25 . Inoltre, la patologia della SLA è aggravata da meccanismi autonomi non cellulari che coinvolgono microglie e astrociti, che contribuiscono a un ambiente infiammatorio cronico e a una lesione neuronaleprogressiva 26,27,28,29. Silenziare l'espressione di SOD1 tramite ASO rappresenta quindi una promettente via terapeutica per mitigare la patogenesi della malattia.

Il modello murino transgenico SOD1-G93A (ceppo Jax #: 004435), che esprime la forma mutante umana G93A di SOD1 sotto il controllo del promotore endogeno umano di SOD1, ricapitola fedelmente le caratteristiche cliniche della SLA, inclusi deficit motori precoci, neurodegenerazione del midollo spinale e sopravvivenzaaccorciata 30. Studi preclinici precedenti hanno dimostrato che la somministrazione di ASO specifici per SOD1 tramite consegna intraventricolare sostenuta tramite pompe osmotiche nei ratti SOD1-G93A al giorno 65 postnatale a una dose giornaliera di 100 μg per 28 giorni consecutivi porta a una significativa soppressione dei livelli di SOD1, riduzione delle risposte neuroinfiammatorie, ritardo nell'emergere dei segni clinici e miglioramento delle prestazionimotorie 31. Inoltre, la riduzione mediata da ASO di SOD1 in persone che vivono con SOD1-ALS è stata associata a riduzioni dei livelli della catena leggera dei neurofilamenti (NfL), un biomarcatore ematico indicativo di dannoassonale 32. In questa indagine, abbiamo somministrato ASO mirati a SOD1 tramite iniezione IT in topi SOD1-G93A e abbiamo valutato il loro impatto attraverso letture molecolari, elettrofisiologiche e biomarcatori. L'analisi quantitativa del tessuto del midollo spinale ha rivelato riduzioni significative nei livelli di mRNA SOD1. Le valutazioni elettrofisiologiche dei potenziali d'azione muscolari composti (CMAP) hanno dimostrato la funzione neuromuscolare preservata. Contemporaneamente, i livelli di NfL sierici sono diminuiti, riflettendo una mitigazione del danno neuronale persistente.

Per valutare la distribuzione spaziale e l'efficacia relativa di metodi alternativi di somministrazione del SNC, abbiamo incluso un braccio comparativo che impiega iniezione intracerebroventricolare (ICV), in cui l'agente terapeutico viene introdotto nei ventricoli laterali per la diffusione tramite flusso di LCR lungo gli spazi ependimici eperivascolari 33. Confrontando le vie di somministrazione di IT e ICV, abbiamo mirato a distinguere differenze negli esiti farmacodinamici e nel targeting dei tessuti, affinando così le strategie di somministrazione delle terapie ASO dirette dal SNC. Inoltre, per valutare la fattibilità traslazionale, abbiamo condotto studi indipendenti di tollerabilità che hanno coinvolto fino a quattro iniezioni di IT per animale distanziate otto settimane di distanza. In tutti i regimi testati non sono stati osservati segni evidenti di disagio o morbilità, a supporto della tollerabilità del dosaggio di IT ASO nel contesto della sopravvivenza. Questi risultati sono coerenti con rapporti precedenti che dimostravano la tollerabilità delle iniezioni intratecali ripetute neitopi 34.

La rilevanza clinica della fornitura IT ASO è ulteriormente supportata dalle recenti approvazioni regolatorie del tofersen (QALSODY®) per l'ALS35 associato a SOD1. Studi clinici hanno dimostrato un robusto coinvolgimento del bersaglio, riflesso da riduzioni della proteina SOD1 del LCR, seguite da diminuzioni dei livelli della catena leggera dei neurofilamenti, un biomarcatore della lesione neuroassonale. Sebbene l'obiettivo primario non sia stato raggiunto nel primo studio VALOR di fase 3, analisi integrate, inclusa l'estensione open-label, hanno suggerito potenziali benefici di un inizio precoce del trattamento35.

Collettivamente, i dati qui presentati dimostrano che la fornitura IT degli ASO con mira SOD1 nel modello murino SOD1-G93A ALS ottiene un efficace knockdown molecolare, il miglioramento dei biomarcatori e la conservazione funzionale con tollerabilità favorevole. Questi risultati supportano l'erogazione dell'ASO IT come approccio razionale e clinicamente valido per i disturbi genetici del SNC e forniscono un solido quadro preclinico per lo sviluppo traslazionale continuo.

Protocollo

Tutte le procedure qui sono state approvate e condotte in conformità con i protocolli approvati dall'IACUC e le linee guida istituzionali per l'igiene chimica e la biosicurezza.
NOTA: Eseguire studi su topi transgenici C57BL/6J (JAX #000664) e SOD1-G93A (JAX #004435) ospitati in condizioni standard (ciclo chiaro/buio di 12 ore, 22-24 °C, accesso ad libitum a cibo e acqua).

1. Applicazione di ASO modificati chimicamente per colpire SOD1 umani

  1. Impiegare oligonucleotidi antisens validati (ASO) per colpire specificamente i nucleotidi 613-629 all'interno della regione non tradotta 3' (UTR) del gene SOD1 umano (RefSeq: NM_000454.5)36: A*GoToG*T*T*T*A*T*T*G*T*ToToA*T*C
  2. Includere modifiche chimiche validate per migliorare stabilità ed efficacia, incorporando MOE (2'-O-Metossietil) (indicato in carattere regolare), cEt (etil vincolato) (corsivo), DNA (grassetto), collegamenti fosfatici (o) e fosforotioiato (*), comeriportato in precedenza 36. Il Fascicolo Supplementare 1 presenta la chimica ASO con la corrispondente codifica a colori.
  3. Preparare un ASO di controllo non targeting, senza complementarità ai genomi umani o roditori, seguendo lo stesso schema di modifica per l'uso come controllo: C*CoToAoT*A*G*G*A*C*T*A*T*C*AoGoGoA*A

2. Preparazione e maneggiamento delle soluzioni ASO in condizioni sterili

  1. Ricostituire l'ASO in liquido cerebrospinale artificiale sterile (aCSF; Tabella 1) a una concentrazione di 10 mg/mL in condizioni sterili, con l'obiettivo di un volume finale di iniezione di 10 μL (100 μg) per animale.
  2. Mescola delicatamente la soluzione con una pipetta sterile per mantenere l'integrità molecolare, poi vortice leggermente per 5-10 secondi per assicurarti che sia ben miscelata.
  3. Filtrare la soluzione diluita attraverso un filtro sterile a siringa da 0,2 mm per rimuovere particelle e contaminanti.
  4. Asepticamente aliquota la soluzione finale in tubi microcentrifughe sterili e conservate a 4 °C in un'unità monitorata e a temperatura controllata fino a 1 settimana, evitando i cicli di gelo-disgelo per mantenere la stabilità.

3. Preparazione del topo prima dell'iniezione intratecale

  1. Pesare ogni topo fino ai 0,1 g più vicini usando una bilancia digitale, poi trasferirlo su un cono nasale e indurre l'anestesia con isoflurano a una concentrazione del 2-2,5% in ossigeno; Monitorare continuamente la profondità e confermare il piano chirurgico con la perdita del riflesso del pedale.
  2. Prepara una borsa termica termostatica e impostala a 37 °C per supportare i topi durante la preparazione e il recupero.
  3. Applicare un lubrificante oftalmico su entrambi gli occhi immediatamente dopo l'induzione dell'anestesia per prevenire la disidratazione corneale. Poi posiziona il topo in posizione ventralmente reclinata sul cuscinetto riscaldante per prevenire l'ipotermia, minimizzare lo stress fisiologico e supportare le normali funzioni cardiovascolari e respiratorie durante tutta la procedura.
  4. Somministrare buprenorfina sospensione iniettabile a rilascio prolungato (1,3 mg/mL) sottocutaneamente a 3,25 mg/kg utilizzando una siringa sterile con ago da 25 g e iniettare 0,05 mL per 20 g di peso corporeo prima della procedura.
  5. Radere la zona lombare dalla metà del fianco fino alla cintura pelvica, poi disinfettare l'area usando tamponi alternati di alcol isopropilico e povidone-iodio, ripeti tre volte e lascia asciugare completamente il sito all'aria.

4. Iniezione intratecale diretta

  1. Dopo l'anestesia e la preparazione del sito chirurgico, sposta il topo in un'area di iniezione pulita e posizionalo in posizione ventralmente sdraiato sulla borsa riscaldante.
  2. Posiziona il topo in una posizione che arcua la colonna vertebrale per facilitare la palpazione e l'iniezione.
    1. Inserire una spatola curva sotto l'addome dal livello toracico inferiore fino al lombare superiore per indurre una lieve flessione spinale e allargare gli spazi intervertebrali lombari tra la quinta e la sesta (L5-L6, preferibile) o la quarta e la quinta (L4-L5) lamine.
    2. Avanzare la smussatura dell'ago tra le lamine per entrare nella cisterna lombare e accedere allo spazio subaracnoideo evitando il contatto diretto con l'osso per migliorare la sicurezza e la precisione delle iniezioni.
  3. Stabilizza la cintura pelvica afferrando delicatamente la cintura pelvica tra pollice e indice di una mano e palpando la linea mediana dorsale con l'altra mano per localizzare lo spazio intervertebrale bersaglio tra L4-L5 o L5-L6.
  4. Allineare una siringa sterile di insulina da 0,3 mL dotata di un ago da 29-G, 1/2 pollice, perpendicolare alla superficie dorsale della pelle o con un angolo di 70-80°, con la smussatura orientata cranialmente. Avanza l'ago finché non incontri una leggera resistenza mentre penetra nella dura madre, poi prosegue nello spazio intratecale.
  5. Inserisci costantemente finché la punta non entra nello spazio intratecale, confermato da un riflesso di movimento della coda che indica un ingresso intratecale riuscito.
  6. Se si riscontra una resistenza significativa o non si osserva riflesso di coda a schiacciamento, si ritira l'ago, si riidentificano i punti di riferimento anatomici e si regola la posizione dell'ago prima di ritentare l'iniezione. Se il tentativo iniziale è stato effettuato nello spazio intervertebrale L5-L6, esegui il successivo tentativo nello spazio intervertebrale L4-L5.
  7. Iniettare lentamente 10 μL della soluzione ASO (per oltre 10 secondi) per minimizzare le variazioni di pressione ed evitare il reflusso di liquido cerebrospinale. L'ago può essere mantenuto in posizione per altri 10 secondi dopo l'iniezione.
  8. Ritira con attenzione l'ago verticalmente e in modo fluido per evitare danni ai tessuti e riflussi.
  9. Monitora il topo continuamente durante il periodo di recupero, osservando la respirazione, la funzione motoria, la postura e eventuali segni di dolore o disagio.
  10. Assicurati che il topo riacquisti la normale mobilità e il comportamento prima di riportarlo nella gabbia di casa.
  11. Documentare tutti i dettagli procedurali rilevanti, inclusi il sito di iniezione, la dose di ASO, il volume di iniezione e eventuali osservazioni comportamentali o fisiologiche durante e dopo la procedura, in conformità con i protocolli IACUC.

5. Monitoraggio dei topi e supporto al recupero dopo l'iniezione

  1. Posizionare ogni topo in un compartimento individuale o ben distanziato all'interno di una camera di recupero preriscaldata mantenuta a 37 °C.
  2. Mantieni la temperatura della camera sotto controllo durante il recupero dell'anestetico per prevenire l'ipotermia.
  3. Monitora continuamente la frequenza respiratoria e il pattern, la postura e la reattività agli stimoli tattili.
  4. Osserva il topo finché non riacquista il riflesso di raddrizzarsi e mostra movimenti coordinati.
  5. Evita il sovraffollamento per garantire una visibilità chiara e prevenire interferenze.

6. Determinazione dei criteri per il ritorno nella gabbia di casa

  1. Conferma che il topo sia stabile con un movimento spontaneo coordinato.
  2. Assicurati che non ci siano segni di disagio, inclusi respirazione affannosa o irregolare, vocalizzazioni e mancanza prolungata di non reattività.
  3. Fornisci un supporto nutrizionale morbido, come un integratore di gel nutriente completo, per aiutare a mantenere l'idratazione e l'apporto calorico con il minimo sforzo.

7. Condurre osservazioni post-recupero sui topi

  1. Verifica comportamenti normali come esplorazione, toelettatura e interazione sociale se i topi sono in una casa di gruppo.
  2. Monitorare costantemente la comparsa di eventuali segni di guarigione anomala, come postura insolita, debolezza o paralisi, respirazione irregolare o richiamata reattività, e rivalutare tempestivamente se questi sintomi si manifestano.
  3. Cerca un intervento veterinario se il recupero è ritardato o compromesso.

8. Iniezione intracerebroventricolare nel ventricolo laterale utilizzando chirurgia stereotassica e cure post-operatorie

NOTA: Includere un braccio comparativo che utilizzi iniezioni intracerebroventricolari (ICV) per valutare la distribuzione spaziale e l'efficacia relativa, l'erogazione degli ASO nei ventricoli laterali per la diffusione mediata dal LCR e il confronto con la consegna intratecale. Eseguire le iniezioni ICV secondo protocolli ben consolidati e standardizzati pertopi 37.

  1. Anestesiare il topo con isoflurano a una concentrazione del 2-2,5% di ossigeno per l'immobilità, posizionare il topo in posizione ventralmente recumbente sul cuscinetto riscaldante, quindi somministrare buprenorfina a rilascio prolungato della sospensione iniettabile (1,3 mg/mL buprenorfina cloridrato) sottocutaneamente a 3,25 mg/kg utilizzando una siringa sterile da 1 mL con ago da 25 g a 0,05 mL per 20 g di peso corporeo prima della procedura. Rasi il cuoio capelluto del topo con una tosa.
  2. Esegui tutte le procedure chirurgiche sotto anestesia. Mantieni un campo asettico sterile durante tutta la chirurgia ICV. Usa solo strumenti sterili e maneggiali con attenzione per evitare il contatto con superfici non sterili.
  3. Fissa il mouse in un fotogramma stereotassico con una console digitale in posizione prona standard. Inserire i denti anteriori nella barra del dentiere dell'adattatore del topo per immobilizzare la testa, poi fissare l'adattatore con i tubi respiratori di inalazione e scarico che erogono l'isoflurano. Inserisci le cuffie nelle orecchie e stringi le viti per stabilizzare saldamente la testa.
  4. Disinfettare l'area utilizzando tamponi alternati di alcol isopropilico e povidone-iodio, ripetuti tre volte, e eseguire un'incisione mediana con un bisturi sterile per esporre il cranio. Usa una punta di cotone sterile per rimuovere i tessuti molli e assicurati che il bregma sia chiaramente visibile.
  5. Segna il bregma sul teschio. Posiziona la siringa contenente ASO con l'ago (26-G, 26s/2"/2, a punta) appena sopra il bregma. Allinea l'ago alle coordinate del bersaglio: AP -0,3 mm, ML ±1,0 mm, DV -3 mm dalla superficie del cranio. Segna il teschio alle coordinate AP e ML.
  6. Crea un foro per la bava alle coordinate indicate e poi usa un telaio stereotassico per abbassare l'ago della siringa a una profondità di -3 mm dalla superficie del cranio. Iniettare la soluzione a una velocità di 10 μL/min fino a ottenere un volume totale di 10 μL. Dopo aver completato l'iniezione, tieni l'ago fermo per 4 minuti, poi ritiralo lentamente per minimizzare il reflusso.
  7. Sutura l'incisione del cuoio capelluto, colloca il topo in una camera di recupero preriscaldata a 37 °C fino a essere completamente sveglio, e riportalo nella gabbia di casa dopo aver confermato la stabilità. Fornire un integratore in gel nutriente completo e monitorare continuamente i segni di recupero anomalo, come postura insolita, debolezza o paralisi, respirazione irregolare o diminuzione della reattività; Rivaluta tempestivamente se si manifestano questi sintomi.

9. Valutazioni elettrofisiologiche dei potenziali d'azione muscolari composti (CMAP)

  1. Assicurarsi che gli sperimentatori siano ciechi sia sul genotipo che sul gruppo di trattamento di ciascun topo per eliminare i bias durante la raccolta e l'analisi dei dati.
  2. Anestetizzare il topo con isoflurano per immobilità e comfort, e mantenere la temperatura corporea a 37 °C.
  3. Conferma un'anestesia adeguata assicurandosi di perdere il riflesso pedalale.
  4. Usa elettrodi monoblocchi a ago monopolari da 28 G sia per la stimolazione che per la registrazione. Inserire l'elettrodo di registrazione di 1 mm nel muscolo tibiale anteriore.
  5. Stimolare il nervo sciatico vicino alla tacca sciatica utilizzando impulsi monofasici a onda quadrata di 0,1 ms ogni 2 secondi, partendo da 1,0 mA e aumentando in incrementi di 0,5 mA fino a raggiungere una risposta sopramassimale (tipicamente 1,5-3,5 mA).
  6. Una volta determinata la soglia supramassima, registra le risposte CMAP a 0,5 mA sopra quel livello. Misura l'ampiezza CMAP (picco a picco) a 0,8 ms dopo lo stimolo per escludere la latenza e media le ampiezze delle gambe sinistra e destra per ciascun topo.

10. Misurazione dei livelli di pNFH sierici

  1. Raccogliere 100 μL di sangue intero tramite puntura venosa facciale utilizzando tubi capillari contenenti attivatore di coaguli e gel di separazione sirica in momenti temporali designati.
  2. Centrifugare i campioni di sangue a 2000 g per 10 minuti a 4 °C per isolare il siero.
  3. Quantificare i livelli della catena pesante del neurofilamento fosforilato sierico (pNFH) utilizzando reagenti immunotest validati per la misurazione della pNFH in campioni biologici su un analizzatore immunofluidico microfluidico completamente automatizzato.

11. Isolare l'RNA ed eseguire la RT-qPCR

  1. Polverizzare i tessuti cervicali/toracici del topo utilizzando una perla d'acciaio da 6 mm in un mulino oscillatorio oscillatorio programmabile ad alta energia criogenico per la polverizzazione del campione a 1.000-1.200 colpi al minuto per 30-40 secondi.
  2. Omogeneizzare il tessuto polverizzato (15 mg) utilizzando perle ceramiche da 2,8 mm in lisi e reagente di estrazione RNA a base di fenolo-guanidinio a 700 μL utilizzando un omogeneizzatore meccanico programmabile ad alta velocità a 5,62 m/s per due cicli da 30 secondi.
  3. Estrarre l'RNA totale utilizzando il trattamento DNase su colonna, seguendo le istruzioni del produttore.
  4. Sintetizza cDNA utilizzando un sistema di reagenti di trascrizione inversa ad alta capacità per la sintesi del cDNA.
  5. Per la rilevazione qPCR, progetta set di primer/sonde personalizzati per rilevare il gene di interesse che prende di mira l'esone 4 del gene SOD1 umano:
    innesco frontale (5′-TGGTGTGGCCGATGTGTCTA-3′),
    Primer inverso (5′-ATGATGCAATGGTCTCCTGAGA-3′)
    sonda (5′-6FAM-TGAAGATTCTGTGATCTCA-MGB/NFQ-3′)
  6. Usa il GAPDH del topo (ID Saggio TaqMan: Mm99999915_g1) come gene di mantenimento domestico.
  7. Eseguire qPCR su uno strumento di PCR quantitativa in tempo reale ad alta produttività (qPCR) utilizzando 20 ng di cDNA per reazione, un mix master qPCR basato su sonde a ciclo rapido, primer specifici per geni e sonde di idrolisi marcate fluorescenti per la rilevazione di trascrizioni di mantenimento (VIC/MGB) e bersaglio (FAM/MGB).

12. Analisi statistica dei dati

  1. Presentare i dati delle misure in vita (CMAP), del pNFH sirico e dell'analisi dell'espressione genica come media ± deviazione standard (SD).
  2. Valutare la significatività statistica tra medie di gruppo utilizzando ANOVA unidirezionale, seguita dal test di confronto multiplo di Tukey, considerando p < 0,05 come statisticamente significativo.
  3. Utilizzare software di analisi statistica appropriato per generare grafici ed eseguire tutte le analisi, in linea con quelle condotte nello studio.

Risultati

Per caratterizzare rigorosamente la precisione e l'efficienza della somministrazione intratecale (IT) nei topi adulti, abbiamo condotto inizialmente esperimenti fondamentali di validazione utilizzando il colorante blu Evans (0,5%) come tracciatore visivo del flusso di liquido cerebrospinale e della permeazione tissutale. I topi adulti selvatici di tipo C57BL/6J (ceppo #000664; peso 25-30g) sono stati anestetizzati con isoflurano (2-2,5%) in ossigeno per eliminare artefatti di movimento, e la regione lombare è stata preparata in condizioni asettiche. Le iniezioni di IT sono state eseguite tramite puntura lombare nello spazio subaracnoideo a singole dosi crescenti di 20 μL, 30 μL e 50 μL per valutare dose/volume e la relazione intensità di colorazione. La corretta posizione dell'ago è stata confermata osservando un movimento della coda o una resistenza negativa durante l'iniezione.

Entro 5 minuti dalla somministrazione del colorante, i topi sono stati perfusi transcardialmente con soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS) per rimuovere il colorante residuo dal vascolo. I midolli spinali venivano quindi delicatamente estratti e fotografati sotto illuminazione standard su uno sfondo neutro. L'ispezione visiva ha rivelato una distribuzione costante e uniforme da dorsale a ventrale di Evans blue in tutti i topi che hanno ricevuto il colorante. Volumi di iniezione più elevati si correlavano con una saturazione intensificata del colorante lungo l'asse rostrocaudale, anche se anche il topo iniettato con il volume di 20 μL mostrava una colorazione robusta. Al contrario, i topi che non hanno ricevuto il colorante blu di Evans (gruppo di controllo iniettato con soluzione salina sterile) non hanno mostrato colorazione visibile né colorazione di fondo nel tessuto del midollo spinale (Figura 1). Questi risultati dimostrano che le iniezioni di IT nei topi permettono una rapida e riproducibile somministrazione di soluti lungo il midollo spinale. Le limitazioni di questi esperimenti includono la mancanza di una valutazione quantitativa della distribuzione dei coloranti e l'assenza di analisi della distribuzione dei coloranti al volume di iniezione di 10 μL utilizzato per l'amministrazione dell'ASO. Tuttavia, la quantificazione è stata effettuata nelle successive misurazioni di coinvolgimento del bersaglio a livello di espressione genica nei topi umani SOD1-G93A utilizzando analisi dell'espressione genica specifica per SOD1 umana. Il volume di iniezione di 10 μL utilizzato negli esperimenti successivi per l'amministrazione dell'ASO è stato selezionato per garantire una dosaggio sicura e ben tollerata nei topi e si prevede che fornisca un'adeguata esposizione al SNS basandosi su studiprecedenti 38.

Sulla base di questa validazione anatomica, abbiamo poi valutato la rilevanza funzionale della somministrazione IT utilizzando ASO che mirano a SOD1 mutante, una strategia terapeutica validata nei modelli SOD1-ALS. I topi transgenici emisigoti SOD1-G93A, che possiedono il gene mutante umano SOD1 , presentano una prevedibile degenerazione dei neuroni motori e un declino neuromuscolare, rendendoli un modello preclinico consolidato. A 5 settimane di età, prima dell'insorgenza sintomatica, i topi ricevevano un singolo bolus IT di un ASO specifico SOD1 a una concentrazione di 100 μg in 10 μL. Questa dose è stata selezionata sulla base di precedenti studi di ottimizzazione condotti con somministrazione ICV su topi, come riportato da McCampbell et al. (2018)36. Per confrontare l'efficacia tra la somministrazione IT e ICV, un gruppo separato ha ricevuto iniezioni ICV della stessa dose ASO utilizzando la somministrazione stereotattica. I controlli ricevevano l'ASO inattivo (controllo non targeting) tramite la via IT.

Cinque settimane dopo il trattamento (a 10 settimane di età), i topi sono stati sottoposti a test composto del potenziale di azione muscolare (CMAP) sotto anestesia leggera a isoflurano. Le registrazioni CMAP dalla muscolatura degli arti posteriori, stimolate da protocolli standardizzati di stimolazione del nervo sciatico, hanno rivelato una significativa conservazione dell'ampiezza sia nei gruppi trattati con TI che ICV rispetto ai controlli inattivi trattati con ASO (p < 0,0001 tramite ANOVA unidirezionale con il test post hoc di Tukey). È importante notare che la preservazione dell'ampiezza non differiva significativamente tra i metodi di somministrazione di IT e ICV (p > 0,05), indicando una protezione neuromuscolare comparabile (Figura 2A).

Per valutare i biomarcatori sistemici dell'integrità neuronale, sono stati misurati i livelli sierici della catena pesante di neurofilamenti fosforilati (pNFH) utilizzando un saggio elettrochemiluminescenze altamente sensibile. I campioni di sangue prelevati nel periodo di 5 settimane post-iniezione hanno mostrato una riduzione del >40% della concentrazione di pNFH nei topi trattati con ASO rispetto ai controlli trattati con veicolo (p < 0,0001), senza differenze significative osservate tra le modalità IT e ICV (Figura 2B). La risposta uniforme dei biomarcatori molecolari corrobora i dati elettrofisiologici, suggerendo che la somministrazione di IT mitiga efficacemente i processi neurodegenerativi in questo modello ALS.

Per valutare l'ingaggio del bersaglio di SOD1-ASO a livello molecolare, abbiamo eseguito la trascrizione inversa di PCR quantitativa (RT-qPCR) su tessuti spinali cervicali e toracici dissezionati. L'RNA totale è stato estratto utilizzando un protocollo basato su colonne, garantendo un'alta purezza (A260/A280>1,8), seguito dalla sintesi del cDNA con priming casuale degli esameri. L'amplificazione quantitativa per PCR che prende di mira i trascrizioni SOD1 umani, normalizzata in GAPDH, ha rivelato un calo medio del 60% dopo la consegna IT e del 35% dopo la consegna ICV, entrambi significativi rispetto ai controlli ASO inattivi (p < 0,0001 per entrambi). Il confronto diretto tra le vie di consegna ha mostrato un knockdown significativamente maggiore con la consegna IT (p < 0,0001), indicando un ingaggio più efficace del bersaglio nel midollo spinale tramite accesso spinale diretto (Figura 3). Sono necessari ulteriori studi per valutare l'impegno dei target in altre regioni del CNS.

Collettivamente, questi dati completi offrono una validazione convincente delle iniezioni IT come tecnica precisa, riproducibile e minimamente invasiva per la somministrazione di ASO al sistema nervoso centrale (SNC) in modelli murini. L'amministrazione IT ha dimostrato un'efficacia terapeutica pari alla somministrazione ICV su un ampio spettro di misure di esito, inclusa la conservazione sostenuta della funzione neurologica (CMAP), la normalizzazione dei biomarcatori rilevanti per la malattia (pNFH) e il robusto knockdown molecolare dei trascrizioni SOD1 umane all'interno delle regioni target del SNC. Questi risultati sottolineano la versatilità dell'erogazione IT come percorso clinicamente traducibile per le terapie ASO mirate al SNC, offrendo un'efficacia equivalente all'ICV mantenendo al contempo la semplicità procedurale e la riduzione dell'invasività. Pertanto, l'erogazione di IT e ICV sono approcci ugualmente validi per interventi mirati al SNC, offrendo flessibilità in contesti preclinici a seconda dell'accessibilità anatomica, della fattibilità procedurale e del contesto terapeutico. Questo posiziona l'erogazione IT come una promettente piattaforma di traduzione per future terapie mirate al sistema nervoso centrale. Per supportare gli sforzi traslazionali, suggeriamo di condurre ulteriori studi preclinici per valutare la distribuzione farmacocinetica all'interno del liquido cerebrospinale, in varie regioni del SNC e nell'assorbimento delle cellule bersaglio, utilizzando tecniche come l'ibridazione fluorescente in situ o l'immunofluorescenza.

Figura 1
Figura 1: Visualizzazione della distribuzione del colorante blu di Evans dopo iniezione intratecale in topi adulti. Il colorante blu di Evans (0,5%) è stato somministrato tramite iniezione intratecale diretta (IT) in topi adulti per valutare qualitativamente la distribuzione del midollo spinale. Tre diversi volumi di colorante 20 μL, 30 μL e 50 μL sono stati somministrati in gruppi sperimentali separati (n = 1 mouse per condizione di volume). Dopo l'iniezione, i midolli spinali sono stati prelevati e lavati per valutare la penetrazione del colorante in base all'intensità della colorazione lungo il tessuto. Le immagini del tessuto del midollo spinale mostrano l'estensione della dispersione del colorante associata a ogni volume di iniezione, dimostrando un aumento della copertura e dell'intensità della colorazione dipendente dalla dose in tutto il midollo spinale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2: La terapia con oligonucleotidi antisens che mira SOD1 ripristina la funzione motoria e riduce i livelli patologici di neurofilamenti nei topi. I topi transgenici SOD1-G93A adulti hanno ricevuto una singola dose di oligonucleotide antisens attivo (SOD1-ASO) tramite iniezione intratecale (IT) o intracerebroventricolare (ICV) a 5 settimane di età, oppure un ASO di controllo inattivo tramite iniezione IT. L'impatto terapeutico è stato valutato a 10 settimane di età, corrispondenti a 5 settimane dopo il trattamento. (A) Sono state ottenute registrazioni del potenziale d'azione muscolare composto (CMAP) per valutare la funzione neuromuscolare negli animali trattati. I gruppi trattati con SOD1-ASO (n = 5 - 6 per gruppo) hanno mostrato un'inversione del calo del CMAP rispetto al gruppo di controllo, indicando un recupero funzionale. (B) I livelli periferici della catena pesante del neurofilamento fosforilato (pNFH), biomarcatore della neurodegenerazione, sono stati quantificati dal siero raccolto alla settimana 10 (n = 5 - 8 per gruppo). Il trattamento con SOD1-ASO ha portato a una significativa riduzione dei livelli di pNFH circolante rispetto al controllo, suggerendo un'attenuazione del danno neuronale associato alla malattia. Tutti i dati sono presentati come media ± SD. La significatività statistica è stata determinata tramite analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita dal test di confronto multiplo di Tukey, con valori p ≤ 0,0001 che indicano differenze robuste tra i gruppi di trattamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: L'amministrazione di SOD1-ASO sopprime significativamente l'espressione dell'mRNA umano di SOD1 nel midollo spinale transgenico SOD1-G93A. Per valutare l'efficienza del targeting dell'oligonucleotide antisense (SOD1-ASO) con miramento SOD1 somministrato tramite iniezione intratecale (IT) o intracerebroventricolare (ICV), è stata analizzata la sezione cervicale/toracica del tessuto del midollo spinale da topi transgenici SOD1-G93A soppressi a 10 settimane di età (5 settimane dopo la somministrazione) per l'espressione umana di mRNA SOD1 utilizzando la reazione a catena della polimerasi quantitativa trascrizione inversa (RT-qPCR). I livelli di trascritti SOD1 umani sono stati quantificati e normalizzati rispetto all'espressione nel gruppo inattivo trattato con ASO. La figura mostra il cambiamento di piega nell'mRNA umano SOD1 (normalizzato in GAPDH) per ciascun gruppo di trattamento (n = 5-7 topi per gruppo), evidenziando una notevole regolazione al ribasso in risposta all'amministrazione di SOD1-ASO. I dati sono presentati come media ± SD. Le differenze statistiche tra i gruppi sono state determinate tramite analisi unidirezionale della varianza (ANOVA), seguite dal test di confronto multiplo di Tukey, con valori p ≤ 0,0001 che indicano differenze robuste tra i gruppi di trattamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

ComponenteFWQuantità di addizione (per L o kg)Unità
Diidrato monobasico di fosfato di sodio0.034g
Dibase fosfato di sodio anidro1420.111g
Cloruro di sodio58.448.766g
Cloruro di potassio74.560.224g
Diidrato di cloruro di calcio147.020.206g
Cloruro di magnesio esaidrato0.163g
Acqua (Milli-Q)993g
Poloxamer 1880.01g

Tabella 1: composizione aCSF.

Figura supplementare 1: Posizionamento del topo per l'iniezione intratecale lombare. Una spatola curva o scoopula posizionata sotto l'addome flette la colonna vertebrale, allargando lo spazio intervertebrale. L'iniezione mira al livello L4-L5 o L5-L6, con un corretto allineamento lungo l'asse mediale della colonna vertebrale come mostrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: sequenza ASO e chimica. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

La tecnica di iniezione intratecale diretta (IT) presentata qui rappresenta un metodo minimamente invasivo ma altamente efficace per somministrare agenti terapeutici nel sistema nervoso centrale (SNC), in particolare nei modelli di piccoli roditori come i topi. Questa procedura di stick cieco è tecnicamente complessa, ma si è dimostrata sia riproducibile che clinicamente rilevante quando eseguita da un iniettore addestrato. Questo metodo utilizza un'anatomia precisa e una tecnica efficiente per fornire un rapido accesso al sistema centrale centrale senza necessità di cateterizzazione, una semplificazione importante con notevoli benefici per l'espansione degli studi preclinici; tuttavia, la sua rilevanza traslazionale trarrà beneficio da ulteriori valutazioni quantitative e da una validazione metodologicastandardizzata 5,8,10.

Un'iniezione IT di successo dipende da diversi passaggi chiave. Una preparazione meticolosa degli animali è essenziale: l'anestesia viene innita prima tramite una camera e mantenuta con un cono nasale, seguita dalla rasatura della zona lombare e dall'somministrazione di analgesici per garantire il comfort dell'animale. La corretta posizione del topo si ottiene posizionando una spatola curva sotto l'addome, flettendo la colonna vertebrale per allargare lo spazio intervertebrale (Figura supplementare 1). L'obiettivo dell'iniezione intratecale descritta qui è posizionare la smussatura dell'ago all'interno della cisterna lombare facendola avanzare tra le lamine al livello vertebrale appropriato. Un targeting accurato dello spazio intervertebrale tra le lamine L4 e L5 o, preferibilmente, tra le lamine L5 e L6, è fondamentale per accedere allo spazio subaracnoideo 5,10. Lo spazio subaracnoideo, noto anche come spazio intratecale, si trova tra l'aracnoide e la pia mater39. Poiché il midollo spinale è più corto del canale vertebrale, i segmenti caudali del midollo spinale si trovano più rostralmente rispetto ai livelli vertebrali corrispondenti. Per evitare ambiguità, i siti di iniezione sono indicati in base allo spazio intervertebrale piuttosto che al livello del midollo spinale. È importante notare che nella segmentazione vertebrale lombare nei topi esiste una notevole variabilità sia all'interno che tra ceppi40. L'iniezione deve essere eseguita lungo la linea mediana della colonna vertebrale per evitare deviazioni laterali, che possono causare paresi dell'arto posteriore o, nei casi gravi, paralisi dovuta a lesioni del midollo spinale. Quando eseguito nella corretta posizione anatomica, il rischio di lesioni dirette del midollo spinale è minimo. Tuttavia, rimane un piccolo rischio di irritazione o danno alla radice nervosa, sottolineando l'importanza di una formazione adeguata dell'operatore e di una competenza procedurale per minimizzare gli esiti negativi. Il riflesso del movimento della coda funge da indicatore utile del posizionamento efficace dell'ago, permettendo all'iniettore di valutare la profondità ed evitare penetrazioni superficiali o eccessivamente profonde. Questa tecnica richiede pratica per essere padroneggiata, necessitando di un controllo costante della profondità, dell'angolo e del volume di iniezione per evitare riflussi e perdite nei tessuti circostanti. Sebbene raccomandiamo di mantenere il volume di iniezione ≤10 μL, abbiamo valutato fino a 20 μL senza effetti collaterali. Studi precedenti hanno identificato un volume di iniezione intratecale di 10 μL come ottimale per la somministrazione del farmaco38. Sebbene questo rappresenti il 25-30% del volume totale di liquido cerebrospinale neitopi 41,42, il volume massimo tollerabile di iniezione intratecale nei topi adulti è stato riportato essere di 30 μL10. Volumi di iniezione superiori ai limiti raccomandati possono alterare la dinamica del liquido cerebrospinale (LCR), portando a un aumento della pressione del liquido cerebrospinale (LCR), aumentando il rischio di effetti avversi. Il volume totale di liquido cerebrospinale nei topi è stimato tra 35 e 40 μL e si rimuove 12-13 volte algiorno 41,42, corrispondente a un rinnovamento completo circa ogni 1,8 ore42,43. Considerando il rapido ricambio del liquido cerebrospinale e le osservazioni empiriche, così come studi precedenti che dimostrano l'uso sicuro di volumi di iniezione intratecali fino a 20-30 μL senza complicazioni, un volume di iniezione di 10 μL non dovrebbe produrre effetti avversi10,44.

La scalabilità è un vantaggio significativo di questa tecnica. Una volta padroneggiati, gli iniettori addestrati possono trattare 10-12 animali all'ora, facilitando studi preclinici più ampi senza i carichi logistici dell'impianto di cateteri o di approcci chirurgici più invasivi. La procedura evita strumenti complessi, riduce lo stress animale e accorcia i tempi di recupero rispetto alla cateterizzazione cronica, rendendola adatta a studi longitudinali che richiedono dosaggi ripetuti. Per simulare i regimi di dosaggio clinico, abbiamo validato le somministrazioni IT seriali nei topi, somministrando fino a quattro dosi distanziate otto settimane di distanza. Queste iniezioni sono state ben tollerate, senza segni di disagio, cambiamenti comportamentali o sintomi di malattia, coerente con studi precedenti che non hanno riportato cambiamenti significativi nella dinamica del liquido cerebrospinale o nell'architettura del midollo spinale dopo molteplici trattamenti IT34,45. Pertanto, i nostri studi confermano che il dosaggio ripetuto di IT è fattibile con intervalli appropriati, in linea con i paradigmi di trattamento umano in cui è necessario un coinvolgimento sostenuto del bersaglio per il beneficio terapeutico. Secondo la nostra esperienza, queste ripetute iniezioni di IT sono state eseguite con successo in un'ampia fascia d'età dalle 5 alle 29 settimane. Sebbene l'aumento dell'età e della massa corporea possa alterare leggermente l'accessibilità del midollo spinale grazie a una maggiore presenza di tessuto sottocutaneo, una gestione efficace rimane possibile con un operatore esperto, esperto nella tecnica e familiare con la sensazione del posizionamento dell'ago. Notiamo, tuttavia, che diversi fattori oltre al sito di iniezione e al volume del bolo, in particolare la velocità di iniezione e le proprietà fisiche della soluzione iniettata, come la densità relativa al liquido cerebrospinale, possono influenzare sostanzialmente la distribuzione dei soluti all'interno del SNC. Sebbene questi parametri non siano stati misurati o manipolati direttamente nel presente studio, lavori recenti di Linninger et al. (2023) dimostrano attraverso un modello farmacocinetico meccanicistico che tali fattori influenzano significativamente la biodistribuzione intratecale degli oligonucleotidi antisense (ASO) e il targetingtissutale 46. Di conseguenza, riconosciamo che questo è un limite del nostro studio e evidenziiamo la velocità di iniezione e le proprietà della soluzione come variabili importanti per future indagini al fine di ottimizzare la consegna del SNC e la rilevanza traslazionale. Insieme, questi risultati evidenziano l'affidabilità e la fattibilità del dosaggio ripetuto di IT nei paradigmi preclinici multi-dosaggio, supportandone l'uso per un coinvolgimento prolungato dei bersagli e la modellizzazione traslazionale dei regimi terapeutici umani.

L'approccio IT offre anche flessibilità nei test terapeutici. Comprende un'ampia gamma di modalità, inclusi ASO, piccole molecole, peptidi e vettori virali, consentendo la valutazione diretta degli interventi mirati al SNC. La capacità di somministrare volumi precisi e controllati di terapie nella cisterna lombare garantisce un'efficace esposizione al midollo spinale e una più ampia esposizione al SNC, limitando al contempo il riflusso sistemico. Il riflesso tail-flick e altri indizi procedurali permettono la verifica in tempo reale della consegna intratecale riuscita, migliorando ulteriormente la riproducibilità e riducendo i tassi di fallimentosperimentale 5,6,8,47.

Studi precedenti su topi SOD1-G93A hanno mostrato che la patologia della malattia colpisce in modo prominente il midollo spinale, in particolare la regione lombare, rispetto allacorteccia 29,48. Pertanto, questa tecnica è particolarmente rilevante nel contesto della SOD1-ALS, una forma genetica di SLA causata da mutazioni nel gene superossido dismutasi 1 (SOD1). Queste mutazioni producono aggregati proteici SOD1 mal ripiegati che portano a un aumento tossico di funzione all'interno dei neuroni motori, portando a un progressivo declinoneuromuscolare 49,50. In questo studio, abbiamo impiegato ASO targettati SOD1 per dimostrare un coinvolgimento efficace con l'mRNA target e il recupero funzionale. L'analisi RT-qPCR ha rivelato una soppressione significativa dei trascrizioni SOD1 umane nel midollo spinale dopo l'amministrazione dell'IT, mentre le registrazioni CMAP hanno indicato l'inversione della disfunzione dei neuroni motori. Inoltre, l'analisi sirica ha mostrato una diminuzione dei livelli della catena pesante dei neurofilamenti fosforilati (pNFH), un biomarcatore della neurodegenerazione, rafforzando l'efficacia della strategia terapeutica.

La rilevanza clinica di questo modello è sottolineata dalla recente approvazione FDA del tofersen (QALSODY®), un ASO progettato per mirare all'mRNA di SOD1 per il trattamento di SOD1-ALS35. Il Toferren viene somministrato per via intratecnica in persone che vivono con SOD1-ALS e ha mostrato chiara attività farmacodinamica, inclusa riduzioni dei livelli totali di proteine SOD1 del LCR (marcatore indiretto dell'ingaggio del bersaglio) e del NfL plasmatico (marcatore di lesione assonale e neurodegenerazione). Nelle analisi integrate dello studio di fase 3 VALOR e del suo OLE, l'avvio precoce del trattamento con tofersen è stato associato a riduzioni del declino delle misure di funzione clinica, forza e qualità della vita, nonché a una riduzione del rischio di eventi equivalenti allamorte 35. Questi dati validano la via intratecale come una potente via per la terapia ASO mirata al SNC e conferiscono un forte peso traslazionale a studi preclinici che adottano strategie di somministrazione simili.

Oltre alla sua utilità nella SLA, la via IT ha dimostrato successo nell'atrofia muscolare spinale (SMA)14,51,52, dove l'ASO Nusinersen (Spinraza®) somministrato da TI è stata la prima terapia approvata 14,51,52. Le iniezioni di IT aggirano la barriera emato-encefalica e permettono una diffusa biodistribuzione delSNC 53, fondamentale per le malattie caratterizzate da patologie neuronali diffuse. Sebbene il dosaggio ripetuto comporti sfide logistiche e di tollerabilità, i progressi nelle tecniche di formulazione e somministrazione continuano a rendere l'amministrazione IT più sostenibile per il trattamento a lungo termine.

L'amministrazione IT offre una maggiore rilevanza traslazionale per la pratica clinica umana rispetto alle iniezioni ICV. Le iniezioni ICV e di IT nei topi adulti differiscono principalmente per la loro posizione target all'interno del SNC e per la distribuzione e gli effetti conseguenti della sostanza somministrata. Le iniezioni ICV eromano sostanze direttamente nel liquido cerebrospinale (LCR) all'interno dei ventricoli laterali del cervello, mirando principalmente ai siti supraspinali. Al contrario, le iniezioni di IT forniscono sostanze nel LCR all'interno dello spazio subaracnoideo spinale, mirando principalmente al midollo spinale. Sebbene entrambi i metodi bypassino la barriera emato-encefalica e permettano una consegna diretta del sistema nervoso centrale, l'amministrazione IT può portare a una durata di azione54 più lunga per alcuni composti e tipicamente porta a una trasduzione più forte nel midollo spinale, mentre l'ICV può raggiungere concentrazioni locali elevate nelle regioni cerebrali adiacenti al ventricololaterale 54. Tuttavia, è importante notare che i composti somministrati nel liquido cerebrospinale possono raggiungere il cervello, anche se la velocità di trasporto è moltolenta 1. Queste differenze si riflettono anche nei rischi procedurali. Le iniezioni ICV comportano un potenziale di contaminazione maggiore se la sterilità viene compromessa, mentre le iniezioni IT, pur non essendo prive di rischi, presentano meno vulnerabilità correlate al dispositivo. Dopo la procedura, le iniezioni di ITO possono indurre fastidio transitorio o reazioni legate agli arti posteriori, mentre le iniezioni ICV sono associate a un disagio immediato minore, anche se rimane possibile un'irritazione cranica locale.

Le applicazioni future di questa tecnica vanno oltre gli studi preclinici attuali. La consegna IT può essere sfruttata per valutare terapie di nuova generazione mirate al sistema nervoso centrale, inclusi strumenti di editing genico (ad esempio, sistemi CRISPR/Cas), modalità di interferenza con l'RNA e terapie geniche basate su vettori virali. L'approccio è adattabile per terapie combinate che mirano a più vie del SNC, consentendo una valutazione in tempo reale delle interazionifarmacodinamiche 55,56. Inoltre, l'amministrazione IT può essere integrata con modalità di imaging per monitorare la distribuzione e il coinvolgimento degli obiettivi in vivo, accelerando le pipeline traslazionali. La tecnica fornisce inoltre una piattaforma per studiare strategie di medicina di precisione su modelli murini geneticamente definiti di malattie neurologiche, facilitando la scoperta di biomarcatori, valutazioni funzionali longitudinali e valutazioni di sicurezza prima della traduzione clinica.

In conclusione, la tecnica di iniezione diretta di IT lombare utilizzando anestesia isoflurano rappresenta un metodo minimamente invasivo, rapido e clinicamente traducibile per somministrare terapie nel SNC murino. La sua applicazione di successo nei modelli SOD1-ALS e la compatibilità con il dosaggio seriale forniscono una solida base per un'ampia diffusione nella ricerca in neuroscienze traslazionali. Con l'avanzamento del settore con un'enfasi crescente sulla modulazione genica del SNC, terapie mirate all'RNA e medicina di precisione, la via IT rimarrà una strategia chiave di somministrazione dei farmaci, collegando i modelli preclinici al successo clinico.

Dichiarazioni

SM e S-C L sono attuali dipendenti di Biogen, Inc., mentre TC, DF, YL, JD e MZ sono ex dipendenti dell'azienda. Gli oligonucleotidi antisenso discussi in questo articolo sono stati forniti agli autori da Ionis Pharmaceuticals. Tofersen (QALSODY) è un prodotto sviluppato congiuntamente da Biogen e Ionis Pharmaceuticals.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Ionis Pharmaceuticals per aver fornito gli ASO descritti nell'articolo. Siamo grati a Ryan Gamble, Steve Garafalo, Adria Martig, Isabel Isaza, Taras Tuczkewycz e David Koske di Biogen per i loro contributi esperti, che hanno significativamente arricchito il manoscritto attraverso le revisioni sostanziali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,3 mL 29 G, 1/2 pollice di siringa per iniezione di insulinaSmiths Medical4429-3
Bava esterile di 0,5 mm di diametroFine Science Tools (FST), o equivalenti1900705
Sutura monofilamento Prolene 5-0Ethicon 8870H 
Tamponi alcoliciDynarex1203
Tamponi alcoliciDynarex1203
Analgesico - Buprenorfina a rilascio prolungatoPrescrizione richiesta
Clipper per animaliWahl08787-450A
Kit di trascrizione inversa cDNA ad alta capacità di Applied BiosystemsFisher Scientific43-688-14
Omogeneizzatore a Rottore a Sferone 24Omni International, Inc.19-070
Raccolta del sangue e tubi di separazione del sieroBeckton Dickinson (BD)365967
Diidrato di cloruro di calcioJT Baker1335
Pompa digitale per siringaApparato di Harvard70-4507
Sistema Immunosaggio Automatico EllaR& Sistemi D600-100
Pomata per gli occhi-PuralubeDecra17033-211-38
Geno/GrinderSPEX SamplePrep2010
Germinator 500 Sterilizzatore a seccoBraintree Scientific, o equivalenteGER 5287-120V
Siringa Hamilton con ago (26s/2"/2 (stile a punta)Hamilton8030026s/2"/2:                                                                                              26 secondi: 26 G;                                                                                                             2" di lunghezza;                                                                                                                             2: stile a punti
Miscela omogeneizzante di tessuto duro 2,8 mm ceramica (tubi rinforzati da 2 mL) (50/pk)Fisher Scientific50-280-9286Fornitore: Revvity Health Sciences Inc
Cuscina RiscaldanteK& H Manufacturing1060
Piattaforma ICVStoelting502063
Camera isoflurano con sistema di scavangingVetEquip901820
Cloruro di magnesio HeaidratoEMD Chemicals1.05832
Forbici MetzenbaumFine Science Tools (FST), o equivalenti14016-14
Mouse GAPDH TaqMan ID del test Mm99999915_g1ThermoFisher Scientific4331182
Elettrodi ad ago per CMAP, 28 gNatus Medical (marchio Teca)#902-DMF25-TP
NutraGel: Nutrizione completaBio ServNGB-2
Portaago per aghi Olsen-HegarFine Science Tools (FST), o equivalenti12502-12
Poloxamer 188Mutchler
Cloruro di potassioJT Baker3045
Preamplificatore (per CMAP)Strumenti di Precisione Mondiale (WPI)SYS-DAM50
Kit pNFH ProteinSimpleR& Sistemi DSPCKB-PS-000519
Tamponi di providone-iodioDynarex1201
QIAzol Lysis Reagent Qiagen79306
Sistema Quant Studio 12K FlexBiosistemi applicati4471087
ScoopulaFisherbrand01-257-567
Signal v6.04Cambridge Electronic DesignNumero di serie 061144CMAP Software 
Camera di recupero per piccoli animaliUnità portatili di terapia intensiva per animali Thermocare modello FW-1FW-1 
Telaio stereotaxi per piccoli animali con console digitaleKOPFModello 940 
Mouse SOD1 G93AIl Laboratorio JacksonStock # 004435
Cloruro di sodioEMD Chemicals1.16224
Dibase fosfato di sodio anidroSigma Aldrich55136
Diidrato monobasico di fosfato di sodioSigma Aldrich3819
Bisturi sterile usa e gettaMed Vet International, o equivalenteMIL4410
Drappeggiamento sterileDynarex4410
Cuscinetti di garza steriliDynarex, o equivalenteDRX-3354
Soluzione salina sterileThermoFisher Scientific14190094
Guanti chirurgici steriliAnsell, o equivalente20277290
Isolatore di stimolo (per CMAP)Strumenti di Precisione Mondiale (WPI)SYS-A365D
Stoelting Micro Drill Stoelting58610
Pinze curve chirurgiche (Pinze Graefe - Titanio)Fine Science Tools (FST), o equivalenti11652-10
Pinze chirurgiche per stright (Pinza Graefe - Titanio)Fine Science Tools (FST), o equivalenti11650-10
Nastro chirurgicoDynarex, o equivalente3572
Siringa per iniezione sottocutanea di analgesicoBD309582
TaqMan Fast Advanced Master MixThermoFisher Scientific4444556
Acqua (Milli-Q)
BilanciaMettler Toledo                                        Modello XSR2002S23-112795
Topi selvatici C57BL/6JIl Laboratorio JacksonAzione # 000664

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