Modulazione colinergica dipendente dal ligando dell'accoppiamento fosforilazionale ossidativo nelle cellule neuroblastoma BE(2)-C permeabilizzate dalla digitonina

Summary

Presentiamo un protocollo per permeabilizzare selettivamente la membrana plasmatica, consentendo la somministrazione mirata di substrati e inibitori per valutare la fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) nelle cellule coltivate, superando le barriere di trasporto della membrana plasmatica che tipicamente ostacolano tale analisi. Utilizzando questa tecnica, abbiamo dimostrato come la funzione di OXPHOS sia modulata da agonisti muscarinici e antagonisti.

Abstract

L'obiettivo di questo studio era valutare la funzione della fosforilazione ossidativa (OXPHOS) nelle cellule coltivate utilizzando combinazioni definite substrato–inibitore, mantenendo al contempo la struttura cellulare e il contesto citosolico persi nelle preparazioni mitocondriali isolate. Poiché le cellule intatte sono poco permeabili a diversi intermedi del ciclo di Krebs, la valutazione diretta della respirazione supportata dal substrato attraverso punti di ingresso specifici della catena di trasporto elettronico (ETC) è limitata. Per superare questo problema, abbiamo applicato la permeabilizzazione selettiva della membrana plasmatica mediata dalla digitonina e eseguito saggi di accoppiamento e flusso elettronico basati su analizzatori di flusso di flusso extracellulari nelle cellule neuroblastoma BE(2)-C. Per determinare la dipendenza da tipo cellulare, la digitonina è stata titolata empiricamente nelle cellule HEK293 e nei neuroni primari del ganglio della radice dorsale del ratto (DRG) utilizzando succinato + rotenone per isolare la respirazione guidata dal Complesso II–IV.

La respirazione supportata da succinato con inibizione del Complesso I ha mostrato un aumento del consumo di ossigeno (O₂) guidato dal Complesso II–IV nelle cellule permeabilizzate rispetto a quelle non permeabilizzate, coerente con un migliore accesso di un substrato impermeabile alla membrana ai mitocondri. Al contrario, la respirazione supportata da substrati che entrano attraverso vie di trasporto endogene (ad esempio, piruvato/malato) mostrava differenze minori tra le condizioni. Utilizzando questa piattaforma per testare i liganti muscarinici, abbiamo osservato differenze associate a agonisti rispetto ad antagonisti nel consumo di O₂ nel saggio di accoppiamento, mentre il saggio a flusso elettronico ha rivelato effetti minimi associati al ligando nelle condizioni testate. Questi risultati indicano che gli effetti rilevabili dei liganti erano più evidenti a livello di stati respiratori definiti da accoppiamento rispetto alla capacità massima di trasferimento elettronico. Nel complesso, la permeabilizzazione selettiva amplia l'accessibilità del substrato negli saggi bioenergetici a cellule coltivate e consente l'analisi della modulazione farmacologica della respirazione mitocondriale.

Introduction

Il malfunzionamento o la riprogrammazione del metabolismo energetico mitocondriale è centrale in un ampio spettro di disturbi, tra cui neurodegenerazione, cancro, malattie infiammatorie, condizioni cardiometaboliche e vari disturbi genetici. Per comprendere meglio il ruolo del metabolismo mitocondriale nella patogenesi delle malattie, sono state sviluppate diverse strategie analitiche. Queste includono misurazioni del tasso di consumo di_O2 (OCR), tasso di acidificazione extracellulare (ECAR), quantificazione dell'ATP, utilizzo del substrato, profilazione o analisi del metabolita del ciclo di Krebs, e tracciamento^{isotopico 1}. Tra queste tecniche, l'OCR rappresenta un indicatore chiave della respirazione mitocondriale e può essere valutata utilizzando strumenti come la Respirometria ad Alta Risoluzione (HRR; ad esempio, Oroboros_{O 2}k)², l'elettrodo tipo Clark o l'analizzatore di flusso extracellulare

Il sistema Oroboros_O2k misura la concentrazione di_O2 in una camera sigillata_{utilizzando un} sensore polarografico O 2 di tipo Clark (POS^)3,4,5 ed è adatto a campioni come mitocondri isolati, cellule permeabilizzate e omogeneati tissutali. Consiste in un catodo d'oro/platino, un anodo d'argento e un serbatoio di elettroliti KCl separati dal campione da una membrana di etilene propilene fluorurato (FEP) permeabile e chimicamente resistente a 25 μm_O2. L'elettrodo tipo^{Clark 3} opera anch'esso in una camera chiusa, rilevando variazioni della concentrazione di_O2 tramite un elettrodo sensibile all'O2, ed è comunemente utilizzato per mitocondri isolati o sospensioni cellulari. Al contrario, l'analizzatore di flusso extracellulare quantifica OCR ed ECAR in cellule aderenti vive o mitocondri isolati utilizzando sensori fluorescenti incorporati in microplacche, consentendo un profiling metabolico ad alta produttività. Un vantaggio pratico della piattaforma di analizzatore di flusso extracellulare è la valutazione automatizzata e multiparametrica su molteplici condizioni in parallelo, mentre i sistemi a camera chiusa (ad esempio, HRR o elettrodi di tipo Clark) tipicamente forniscono una capacità di flusso inferiore e richiedono una maggiore gestione manuale.

L'analizzatore di flusso extracellulare è particolarmente utile per valutare la funzione mitocondriale nelle cellule aderenti intatte o nelle cellule di sospensione che si depositano nella parte inferiore della microplacca. Nei saggi che utilizzano cellule aderenti intate, il metabolismo energetico mitocondriale può essere profilato utilizzando substrati come glucosio o^{piruvato 6}. In alternativa, i saghi che utilizzano piccole quantità di frazioni mitocondriali arricchite permettono misurazioni sequenziali della respirazione basale, della respirazione stimolata da ADP (Stato 3), della respirazione a riposo (Stato 4) e della respirazione non stimolata da accoppiatori utilizzando combinazioni di substrati e^{inibitori 7}. Tuttavia, nei sistemi cellulari intatti, i metaboliti del ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) non permeabili alle cellule non possono essere utilizzati per valutarne direttamente il metabolismo. Mentre i mitocondri isolati permettono l'uso di tali metaboliti grazie all'assenza di barriere plasmatiche. L'analisi dell'approccio bioenergetico mitocondriale arricchito isolato presenta limitazioni: la struttura mitocondriale può essere alterata durante l'isolamento, e i fattori citosolici che influenzano il metabolismo mitocondriale e il trasporto dei metaboliti sono ridotti o assenti. Di conseguenza, gli approcci di permeabilizzazione selettiva sono spesso utilizzati come compromesso che può mantenere aspetti dell'architettura cellulare consentendo al contempo un accesso controllato ai mitocondri. Per superare le limitazioni dell'uso di cellule intatte o mitocondri isolati per i saggi metabolici, questo protocollo descrive un metodo per permeabilizzare le cellule di neuroblastoma aderente (BE(2)-C) utilizzando la digitonina. Questo approccio facilita l'importazione di metaboliti altrimenti non permeabili cellulari attraverso la membrana plasmatica, mantenendo al contempo risposte mitocondriali funzionali a substrati e inibitori definiti.

La selettività della digitonina si basa sulle differenze nella composizione dei lipidi della membrana: la membrana plasmatica è ricca di colesterolo, mentre le membrane mitocondriali—in particolare quella mitocondriale interna—contengono pochissimo^{colesterolo 8}. A basse concentrazioni, la digitonina (o saponina) permeabilizza selettivamente e completamente la membrana plasmatica a causa dell'alto contenuto di colesterolo, mentre le membrane mitocondriali sono interessate solo a concentrazioni^{più elevate 9,10}. La digitonina si lega al colesterolo e forma pori nella membrana plasmatica, permettendo a piccole molecole come gli intermediari del ciclo TCA di entrare nel citosolo senza disturbare la struttura o la funzione mitocondriale quando ottimizzate correttamente. Questo approccio è più adatto a cellule coltivate che possono essere placcate riproducibilmente come monostrati aderenti in una micropiastra con analizzatore di flusso extracellulare e richiede una titolazione empirica della concentrazione di digitonina per ogni tipo cellulare e densità di semina. Gli indicatori operativi dell'integrità mitocondriale preservata includono risposte OCR robuste e sensibili agli inibitori (ad esempio, diminuzioni attese con rotenone/antimicina A e respirazione intatta guidata da flebo complesso con ascorbato/TMPD), insieme all'assenza di collasso OCR che indicherebbe una sovrapermeabilizzazione. Pertanto, l'ottimizzazione della digitonina dovrebbe essere effettuata prima dei confronti sperimentali e ripetere ogni volta che le condizioni di coltura o la densità cellulare cambiano. Inoltre, la concentrazione ottimale di digitonina varia a seconda del tipo cellulare e deve essere determinata empiricamente per stabilire una finestra di permeabilizzazione che consenta l'ingresso di substrati impermeabili (ad esempio, succinato) mantenendo al contempo la funzione mitocondriale sensibile agli inibitori. In questo studio, illustriamo questo principio ottimizzando la digitonina non solo nelle cellule BE(2)-C, ma anche nelle cellule HEK293 e nei neuroni primari del ganglio della radice dorsale (DRG) del ratto.

Questo protocollo è stato dimostrato utilizzando cellule neuroblastoma BE(2)-C, originariamente isolate dal cervello di un paziente maschile con neuroblastoma. Le cellule BE(2)-C esprimono vari recettori muscarinici, in particolare il recettore colinergico muscarinico di tipo 1 (CHRM1). Nei nostri studi precedenti, abbiamo dimostrato che CHRM1 è associato ai mitocondri sia nei corpi cellulari che nelle neuriti dei neuroni ganglionali dorsali di ratto coltivati, così come nelle cellule HEK293 trasfettate^{da CHRM1 11}. Inoltre, la delezione genetica di Chrm1 nei topi altera molteplici aspetti della struttura e della funzione^{mitocondriale 12,13}. Pertanto, ipotizziamo che le cellule BE(2)-C possano essere utilizzate per indagare gli effetti modulatori dei liganti muscarinici sulla funzione di OXPHOS. In questa dimostrazione, abbiamo esaminato gli effetti degli agenti muscarinici — tra cui l'agonista acetilcolina, l'antagonista distorto pirenzepina¹⁴ e l'antagonista atropina — sulla respirazione mitocondriale in presenza di sucinati o piruvato/malato come substrati e ne abbiamo confrontato l'impatto.

Protocol

1. Scongelamento e placcatura iniziale

NOTA: Il mezzo base per le cellule BE(2)-C è una miscela 1:1 di Eagle's Minimum Essential Medium e F12 Medium formulati con ATCC, integrati con siero bovino fetale al 10% (FBS).

1. Scongelare le cellule BE(2)-C da un cryovial in un bagno d'acqua a 37 °C. Una volta scongelate, centrifugare le celle a 200 × g per 5 minuti per rimuovere il crioprotettivo.
2. Risospendere il pellet cellulare in un mezzo di crescita completo e placcare le cellule in un piatto di coltura cellulare da 10 cm. Incubare la coltura a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂ nell'aria fino a quando le cellule non raggiungono la subconfluenza.

2. Subcultura

1. Sub-cultura delle cellule per 2–3 passaggi per assicurarsi che raggiungano una fase di crescita esponenziale stabile.

3. Tripsinizzazione e preparazione alla sospensione a singola

1. Quando la coltura raggiunge il 60–80% di confluenza, si tripsinizzano le cellule. Fai passare la sospensione a celle più volte attraverso pipette a trasferimento a punta fine con punte lucidate per dissociare i grumi e ottenere una sospensione a singola cella.
2. Aggiungi un substrato fresco contenente FBS per neutralizzare la tripsina. Centrifuga le celle a 200 × g per 5 minuti per pellettarle.

4. Protocollo di semina cellulare per micropiastre di coltura cellulare a 24 pozzi utilizzate nell'analizzatore di flusso extracellulare

1. Risospendere il pellet in un mezzo completo a una concentrazione finale di 10.000 celle per 100 μL per pozzo.
2. Semina le cellule a una densità ottimizzata per assicurarti che raggiungano la piena confluenza entro 1–2 giorni. Lasciare vuoti i quattro pozzi agli angoli o un singolo pozzo angolare, a seconda del progetto sperimentale. Questi pozzi fungeranno da controlli di sottofondo.
   NOTA: Questo potrebbe richiedere tentativi ed errori, inclusi aggiustamenti al volume e al tempismo del supporto.
3. Monitorare la coltura per variazioni nel colore del substrato: l'ingiallimento indica un calo del pH e richiede una sostituzione immediata con un mezzo fresco per mantenere la salute cellulare.

5. Preparazione per un saggio basato su analizzatore di flusso extracellulare

NOTA: I formati di accoppiamento e di saggio del flusso elettronico utilizzati qui seguono i flussi di lavoro consolidati della respirazione mitocondriale basati su^{microplacche 7}, con modifiche che includono la permeabilizzazione delle cellule BE(2)-C tramite titolazione della digitonina e condizioni di trattamento con ligando muscarinico.

1. Prepara soluzioni stock e 2 soluzioni per il saggio mitocondriale (MAS). Prepara in anticipo 2 miscele MAS e soluzioni di reagente funzionante (substrati e inibitori) (vedi Tabella 1, Tabella 2 e Tabella 3).
2. Conservare tutte le soluzioni stock e il MAS a -20 °C per un uso futuro, consentendo un sistema efficiente del saggio.
   SICUREZZA: Rotenone, antimicina A, oligomicina, FCCP, digitonina e TMPD sono pericolosi e devono essere gestiti secondo le linee guida istituzionali sulla sicurezza. Tutte le soluzioni inibitrici devono essere preparate e maneggiate in una cappa chimica certificata, indossando l'attrezzatura di protezione personale appropriata (camice da laboratorio, guanti in nitrilo e protezione per gli occhi). Le soluzioni contenenti questi reagenti, così come i rifiuti contenenti DMSO, dovrebbero essere raccolte e smaltite come rifiuti chimici pericolosi secondo le normative istituzionali e locali. Le superfici di lavoro devono essere decontaminate dopo l'uso.
3. Idratazione della cartuccia sensore
   1. La notte prima dell'esperimento, idratare la cartuccia sensore dell'analizzatore di flusso extracellulare aggiungendo 1 mL di tamponamento di calibrazione della cartuccia del sensore o soluzione salina tamponata fosfato (PBS, pH 7,4) a ciascun pozzo. Lasciare che la cartuccia sensore riposi tutta la notte (12–18 ore) a temperatura ambiente (20–25 °C).
      NOTA: L'incubazione in un incubatore senza CO₂ a 37 °C non è necessaria, poiché la cartuccia si equilibrerà alla temperatura ambiente durante il caricamento. Una volta inserita nell'analizzatore di flusso extracellulare per la calibrazione, la cartuccia raggiungerà i 37 °C in circa 15 minuti.

6. Giorno dell'esperimento

NOTA: Prepara tutte le soluzioni fresche, regola il pH se necessario e lascia sul ghiaccio fino all'uso.

1. Scongelare le scorte di substrato congelato e 2 MAS a temperatura ambiente (20–25 °C) per 15–30 minuti o in un bagno d'acqua a 37 °C per 5–10 minuti.
2. Preparare tutte le soluzioni di substrato e iniezione (vedi Tabella 4, Tabella 5, Tabella 6 e Tabella 7) e verifica che il pH sia a 7,4. Aggiusta se necessario e tieni le soluzioni sul ghiaccio fino all'uso. Usa la Tabella 4 e la Tabella 5 per il saggio di accoppiamento. Per il saggio sul flusso di elettroni, usa la Tabella 6 e la Tabella 7.
3. Carica inibitori e substrati nelle porte appropriate delle cartucce sensori e preparati a eseguire il test. A seconda del tipo di saggio — saggio di accoppiamento o saggio di flusso ^{elettronico 7} — si rifera rispettivamente alla Tabella 4 e alla Tabella 5 o alla Tabella 6 e alla Tabella 7, secondo necessità.
4. Preparare tutte le soluzioni di lavoro su substrato e inibitori a volumi finali definiti (miscele sfuse: 15 mL; miscele di iniezione a cartuccia: 2 mL per porta). Calcolare le concentrazioni per ottenere le concentrazioni finali desiderate nel pozzo dopo l'iniezione (volume finale del pozzo: 700 μL dopo la porta D).
5. Aggiungere 450 μL della soluzione preparata per il test in ciascun pozzo della piastra analizzatrice di flusso extracellulare a 24 pozzi contenente liganti muscarinici (concentrazione finale di liganti: 1 μM; volume totale del pozzo: 500 μL). Assicurarsi che ogni pozzo contenga già 50 μL di 1x MAS buffer e celle sommerse.
   NOTA: Esegui questo passaggio immediatamente prima di caricare la piastra nell'analizzatore.
6. Carica 50 μL di ciascun reagente preparato nella corrispondente porta di iniezione della cartuccia sensore.

7. Programmazione degli strumenti ed esecuzione del test

1. Accendi l'analizzatore di flusso extracellulare almeno 1–2 ore prima dell'esperimento per permettere all'incubatore interno di stabilizzarsi a 37 °C. Mantieni la camera a 37 °C durante la calibrazione e durante il saggio.
2. Programmare l'analizzatore per eseguire i cicli di miscela, attesa e misurazione appropriati secondo la Tabella 8.
3. Etichettare i pozzi e i gruppi sperimentali nel software secondo il disegno sperimentale.
4. Inizia la prova di analisi. Lascia che lo strumento calibri la cartuccia del sensore (~15 min).
5. Preparare la piastra del test per il caricamento durante la calibrazione della cartuccia. Ritardare il caricamento se necessario; la cartuccia sensore rimarrà stabile a 37 °C all'interno dello strumento.
6. Completare il test quando il ciclo di misurazione finale dopo l'iniezione Port D si conclude. Procedere immediatamente alla normalizzazione post-analisi e all'analisi dei dati.

8. Preparazione della placca cellulare per il saggio con analizzatore di flusso extracellulare

1. Inizia a preparare la piastra cellulare immediatamente dopo aver inserito la cartuccia del sensore nell'analizzatore per la calibrazione. Aggiungere 700 μL di 1x MAS buffer a ciascun pozzo contenente celle aderenti. Incubare a temperatura ambiente (20–25 °C) per 1 minuto.
2. Aspirare con cura il buffer senza disturbare le cellule attaccate. Ripeti il passaggio di lavaggio per almeno 3 x 1 minuto per rimuovere il residuo del materiale colturale e completare tutti i lavaggi entro 10 minuti.
3. Aggiungi 50 μL di buffer 1x MAS a un pozzo di fondo designato (senza celle) per stabilire un riferimento visivo del volume.
4. Aspirare il tampone da pozzi sperimentali, lasciando circa 50 μL di tampone residuo in ciascun pozzo.
5. Incubare la piastra a 37 °C in un bagno d'acqua, mantenendo la piastra sopra la superficie dell'acqua per evitare l'evaporazione. Mantieni a 37 °C per 10 minuti (massimo 20 minuti) prima di caricare.
6. Immediatamente prima di caricare la piastra si aggiungono 450 μL di 1x MAS buffer contenente i substrati appropriati a ciascun pozzo per raggiungere un volume finale di 500 μL.
7. Inserire la piastra nell'analizzatore di flusso extracellulare.

9. Fine del test e analisi dei dati

1. Rimuovere la piastra cellulare e la cartuccia sensore dall'analizzatore dopo aver completato l'esecuzione.
2. Normalizzare i valori OCR per pozzo utilizzando la quantificazione totale delle proteine o il conteggio totale delle cellule. Lisare le cellule con il tampone RIPA e quantificare la proteina totale usando il saggio di Bradford o un altro saggio spettrofotometrico proteico.
3. Normalizzare i valori OCR utilizzando il software di analisi ed esportare i dati secondo necessità.
4. Applicare i seguenti criteri di accettazione: confermare la stabilità base dell'OCR (≤deriva del 15% su due cicli di misura consecutivi) e confermare una riduzione dell'OCR del ≥60% dopo iniezione di rotenone, oligomicina o antimicina A.
5. Escludere le corse che non rispettano questi criteri e riottimizzare la concentrazione di permeabilizzatori o la densità di semina cellulare secondo necessità.

10. Esportazione dei risultati

1. Inserisci una chiavetta USB nello strumento.
2. Esporta i dati del saggio.

11. Elaborazione dei dati

1. Analizza i dati utilizzando il software dello strumento.
2. Esportare i dati processati in formati compatibili con il software di analisi preferito per ulteriori analisi e visualizzazioni.

Results

Ottimizzazione della concentrazione di digitonina per la permeabilizzazione delle cellule BE(2) C nel saggio di accoppiamento
All'inizio di questo protocollo, abbiamo standardizzato la concentrazione ottimale di digitonina necessaria per una permeabilizzazione cellulare efficace senza compromettere la respirazione mitocondriale. In questo protocollo, abbiamo testato 5 μM e 10 μM di digitonina come concentrazioni iniziali ed eseguito un saggio di accoppiamento. Questo ...

Discussion

Questo studio introduce un protocollo rapido ed economico per valutare la modulazione muscarinica mediata da ligando muscarinico di OXPHOS nelle cellule di neuroblastoma coltivate. Utilizzando la permeabilizzatrice selettiva della membrana plasmatica digitonina, in combinazione con coppie substrato-inibitore definite, abbiamo permesso la consegna mirata di substrati metabolici come la succinata direttamente ai mitocondri in situ. Questo approccio supera i limiti delle membrane c...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloruro di acetilcolina	MilliporeSigma	A6625	Agonista muscarinico
ADP	MP Biomedicals, Inc	ICN19014901	Accettore di elettroni, substrato per la sintesi di ATP.
Antimicina A	AAJ63522MA	Thermo Scientific	Inibisce il complesso mitocondriale III
Atropina	MilliporeSigma	1044990	Antagonista muscarinico
Celle Be2C	Collezione della Cultura di Tipo Americano	CRL-2268	Una cellula neuroblastica isolata dal cervello di un paziente maschile con neuroblastoma, esprime recettori muscarinici
Digitonina	MilliporeSigma	D141	Detersivo delicato, permeabilizzante a membrana.
D-Mannitol	Chimici Termoscientifici	AA3334236	Un alcol zuccherino non metabolizzabile, usato per la stabilizzazione osmotica e la protezione delle membrane
EGTA	MilliporeSigma	E0396	Chelazione del calcio: Previene l'attivazione di proteasi dipendenti dal calcio e di altri enzimi che potrebbero degradare le proteine mitocondriali.
BSA senza acidi grassi	MilliporeSigma	126575	Previene effetti incontrollati degli acidi grassi, stabilisce i mitocondri
FCCP	Cayman Chemical	NC0904863	Un protonoforo e disaccoppiatore della fosforilazione ossidativa nei mitocondri
HEPES	MilliporeSigma	391340	Tamponamento del pH, compatibilità con la funzione mitocondriale
L-Ascorbate	TCI America	A053925G	Ciclo intermedio TCA, substrato di OXPHOS
Cloruro di magnesio	MilliporeSigma	M8266	Per l'equilibrio ionico, supporto all'attività enzimatica
N1,N1,N1,N1-tetrametil-1,4-fenilene diamine (TMPD)			Donatore di elettroni al citocromo c, valutazione della funzione IV complessa bypassando i Complessi I e II, TMPD/ascorbato consente la misurazione diretta del consumo di ossigeno dipendente dal complesso IV
Oligomicina	MilliporeSigma	1404-19-9	Inibisce la sintesi mitocondriale di ATP, Complesso V
Pirenzepina diidrocloruro	MilliporeSigma	P7412	Agonista muscarinico con pregiudizi
Acido piruvico	Chimici Termoscientifici	AC132155000	Substrato del ciclo TCA
Rotenone	MilliporeSigma	557368	Inibisce il complesso mitocondriale I
Micropiastre di coltura cellulare Seahorse XF24 V7 PS	Agilent	102340-100	Micropiastre per coltura cellulare
Analizzatore Seahorse XFe24	Agilent	S7801BR	Gli Agilent Seahorse XFe24 Analyzer misurano il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) delle cellule vive in un formato a 24 pozzi a piastre.
Acido succenico	Fisher Chemical	AC158742500	Ciclo intermedio TCA, substrato di OXPHOS
Buffer di calibrazione della cartuccia sensore XFe24	Agilent	102340100	PBS buffer pH 7,2
Cartucce sensori XFe24	Agilent	102340-100	sensore per la misurazione OCR ed ECAR