Modulazione colinergica dipendente dal ligando dell'accoppiamento fosforilazionale ossidativo nelle cellule neuroblastoma BE(2)-C permeabilizzate dalla digitonina

Summary

Presentiamo un protocollo per permeabilizzare selettivamente la membrana plasmatica, consentendo la somministrazione mirata di substrati e inibitori per valutare la fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) nelle cellule coltivate, superando le barriere di trasporto della membrana plasmatica che tipicamente ostacolano tale analisi. Utilizzando questa tecnica, abbiamo dimostrato come la funzione di OXPHOS sia modulata da agonisti muscarinici e antagonisti.

Abstract

L'obiettivo di questo studio era valutare la funzione della fosforilazione ossidativa (OXPHOS) nelle cellule coltivate utilizzando combinazioni definite substrato–inibitore, mantenendo al contempo la struttura cellulare e il contesto citosolico persi nelle preparazioni mitocondriali isolate. Poiché le cellule intatte sono poco permeabili a diversi intermedi del ciclo di Krebs, la valutazione diretta della respirazione supportata dal substrato attraverso punti di ingresso specifici della catena di trasporto elettronico (ETC) è limitata. Per superare questo problema, abbiamo applicato la permeabilizzazione selettiva della membrana plasmatica mediata dalla digitonina e eseguito saggi di accoppiamento e flusso elettronico basati su analizzatori di flusso di flusso extracellulari nelle cellule neuroblastoma BE(2)-C. Per determinare la dipendenza da tipo cellulare, la digitonina è stata titolata empiricamente nelle cellule HEK293 e nei neuroni primari del ganglio della radice dorsale del ratto (DRG) utilizzando succinato + rotenone per isolare la respirazione guidata dal Complesso II–IV.

La respirazione supportata da succinato con inibizione del Complesso I ha mostrato un aumento del consumo di ossigeno (O₂) guidato dal Complesso II–IV nelle cellule permeabilizzate rispetto a quelle non permeabilizzate, coerente con un migliore accesso di un substrato impermeabile alla membrana ai mitocondri. Al contrario, la respirazione supportata da substrati che entrano attraverso vie di trasporto endogene (ad esempio, piruvato/malato) mostrava differenze minori tra le condizioni. Utilizzando questa piattaforma per testare i liganti muscarinici, abbiamo osservato differenze associate a agonisti rispetto ad antagonisti nel consumo di O₂ nel saggio di accoppiamento, mentre il saggio a flusso elettronico ha rivelato effetti minimi associati al ligando nelle condizioni testate. Questi risultati indicano che gli effetti rilevabili dei liganti erano più evidenti a livello di stati respiratori definiti da accoppiamento rispetto alla capacità massima di trasferimento elettronico. Nel complesso, la permeabilizzazione selettiva amplia l'accessibilità del substrato negli saggi bioenergetici a cellule coltivate e consente l'analisi della modulazione farmacologica della respirazione mitocondriale.

Introduction

Il malfunzionamento o la riprogrammazione del metabolismo energetico mitocondriale è centrale in un ampio spettro di disturbi, tra cui neurodegenerazione, cancro, malattie infiammatorie, condizioni cardiometaboliche e vari disturbi genetici. Per comprendere meglio il ruolo del metabolismo mitocondriale nella patogenesi delle malattie, sono state sviluppate diverse strategie analitiche. Queste includono misurazioni del tasso di consumo di_O2 (OCR), tasso di acidificazione extracellulare (ECAR), quantificazione dell'ATP, utilizzo del substrato, profilazione o analisi del metab....

Protocol

1. Scongelamento e placcatura iniziale

NOTA: Il mezzo base per le cellule BE(2)-C è una miscela 1:1 di Eagle's Minimum Essential Medium e F12 Medium formulati con ATCC, integrati con siero bovino fetale al 10% (FBS).

1. Scongelare le cellule BE(2)-C da un cryovial in un bagno d'acqua a 37 °C. Una volta scongelate, centrifugare le celle a 200 × g per 5 minuti per rimuovere il crioprotettivo.
2. Risospendere il pellet cellulare in un mezzo di crescita completo e placcare le cellule in un piatto di coltura cellulare da 10 cm. Incubare la coltura a 37 °C in un incubator....

Results

Ottimizzazione della concentrazione di digitonina per la permeabilizzazione delle cellule BE(2) C nel saggio di accoppiamento
All'inizio di questo protocollo, abbiamo standardizzato la concentrazione ottimale di digitonina necessaria per una permeabilizzazione cellulare efficace senza compromettere la respirazione mitocondriale. In questo protocollo, abbiamo testato 5 μM e 10 μM di digitonina come concentrazioni iniziali ed eseguito un saggio di accoppiamento. Questo .......

Discussion

Questo studio introduce un protocollo rapido ed economico per valutare la modulazione muscarinica mediata da ligando muscarinico di OXPHOS nelle cellule di neuroblastoma coltivate. Utilizzando la permeabilizzatrice selettiva della membrana plasmatica digitonina, in combinazione con coppie substrato-inibitore definite, abbiamo permesso la consegna mirata di substrati metabolici come la succinata direttamente ai mitocondri in situ. Questo approccio supera i limiti delle membrane c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloruro di acetilcolina	MilliporeSigma	A6625	Agonista muscarinico
ADP	MP Biomedicals, Inc	ICN19014901	Accettore di elettroni, substrato per la sintesi di ATP.
Antimicina A	AAJ63522MA	Thermo Scientific	Inibisce il complesso mitocondriale III
Atropina	MilliporeSigma	1044990	Antagonista muscarinico
Celle Be2C	Collezione della Cultura di Tipo Americano	CRL-2268	Una cellula neuroblastica isolata dal cervello di un paziente maschile con neuroblastoma, esprime recettori muscarinici
Digitonina	MilliporeSigma	D141	Detersivo delicato, permeabilizzante a membrana.
D-Mannitol	Chimici Termoscientifici	AA3334236	Un alcol zuccherino non metabolizzabile, usato per la stabilizzazione osmotica e la protezione delle membrane
EGTA	MilliporeSigma	E0396	Chelazione del calcio: Previene l'attivazione di proteasi dipendenti dal calcio e di altri enzimi che potrebbero degradare le proteine mitocondriali.
BSA senza acidi grassi	MilliporeSigma	126575	Previene effetti incontrollati degli acidi grassi, stabilisce i mitocondri
FCCP	Cayman Chemical	NC0904863	Un protonoforo e disaccoppiatore della fosforilazione ossidativa nei mitocondri
HEPES	MilliporeSigma	391340	Tamponamento del pH, compatibilità con la funzione mitocondriale
L-Ascorbate	TCI America	A053925G	Ciclo intermedio TCA, substrato di OXPHOS
Cloruro di magnesio	MilliporeSigma	M8266	Per l'equilibrio ionico, supporto all'attività enzimatica
N1,N1,N1,N1-tetrametil-1,4-fenilene diamine (TMPD)			Donatore di elettroni al citocromo c, valutazione della funzione IV complessa bypassando i Complessi I e II, TMPD/ascorbato consente la misurazione diretta del consumo di ossigeno dipendente dal complesso IV
Oligomicina	MilliporeSigma	1404-19-9	Inibisce la sintesi mitocondriale di ATP, Complesso V
Pirenzepina diidrocloruro	MilliporeSigma	P7412	Agonista muscarinico con pregiudizi
Acido piruvico	Chimici Termoscientifici	AC132155000	Substrato del ciclo TCA
Rotenone	MilliporeSigma	557368	Inibisce il complesso mitocondriale I
Micropiastre di coltura cellulare Seahorse XF24 V7 PS	Agilent	102340-100	Micropiastre per coltura cellulare
Analizzatore Seahorse XFe24	Agilent	S7801BR	Gli Agilent Seahorse XFe24 Analyzer misurano il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) delle cellule vive in un formato a 24 pozzi a piastre.
Acido succenico	Fisher Chemical	AC158742500	Ciclo intermedio TCA, substrato di OXPHOS
Buffer di calibrazione della cartuccia sensore XFe24	Agilent	102340100	PBS buffer pH 7,2
Cartucce sensori XFe24	Agilent	102340-100	sensore per la misurazione OCR ed ECAR