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Articolo metodologico

Voltammetria ciclica a scansione rapida per la registrazione ex vivo del rilascio di dopamina

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DOI:

10.3791/69790

⸱

17 marzo 2026

 ,  , 
1Department of Clinical and Biomedical Sciences, University of Exeter Medical School, Hatherly Laboratories

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La voltametria ciclica a scansione rapida (FCV) misura la dinamica rapida della dopamina con risoluzione in meno di un secondo utilizzando microelettrodi in fibra di carbonio. Questo protocollo descrive la FCV nelle fette cerebrali acute del topo, inclusa la fabbricazione di elettrodi, la preparazione delle fette, la calibrazione e i saggi basati sulla stimolazione per esaminare come gli interneuroni colinergici regolano il rilascio striatali di dopamina in condizioni fisiologiche.

Abstract

La Voltametria Ciclica a Scansione Rapida (FCV) è una tecnica elettrochimica che consente la rilevazione in tempo reale di neurotrasmettitori ossidabili, tra cui dopamina (DA), noradrenalina e serotonina, con risoluzione temporale inferiore al secondo. Applicando una forma d'onda di tensione triangolare a scansione rapida a un microelettrodo in fibra di carbonio, la FCV consente una misurazione altamente sensibile di cambiamenti rapidi e transitori nelle concentrazioni di neurotrasmettitori extracellulari con eccellente precisione temporale. Questo rende FCV particolarmente adatto per registrare eventi di segnalazione neuromodulatoria rapida. Questo articolo descrive l'applicazione della FCV per misurare il rilascio di DA evocato nelle fette cerebrali di topo ex vivo . Il protocollo delinea i passaggi essenziali per la fabbricazione di microelettrodi in fibra di carbonio, la preparazione di una fetta cerebrale acuta, il condizionamento degli elettrodi, l'acquisizione dati e la calibrazione post-hoc per convertire i segnali di corrente in concentrazioni assolute di DA. Utilizzando l'antagonista selettivo contenente β2 del recettore nicotinico dell'acetilcolina (nAChR) diidro-β-eritroidina (DHβE), dimostriamo che l'attività di nAChR ha una potente influenza modulatrice sul rilascio di DA striatale. Insieme, questo lavoro mette in evidenza la FCV come un approccio potente per indagare la trasmissione delle monoammine attraverso le regioni cerebrali.

Introduzione

La voltametria ciclica a scansione rapida (FCV) è una tecnica elettrochimica sviluppata per monitorare le fluttuazioni rapide nei neurotrasmettitori elettroattivi1. A differenza della voltametria ciclica tradizionale, che utilizza velocità di scansionelente 1, la FCV applica una forma d'onda potenziale triangolare a una velocità di scansione molto più elevata (tipicamente 400 V/s) tramite un microelettrodo in fibra di carbonio su scala micrometrica, consentendo misurazioni subsecondedella concentrazione 2 del neurotrasmettitore. Queste elevate velocità di scansione generano una corrente di carica di fondo grande ma stabile che può essere sottratta digitalmente per isolare le correnti faradaiche prodotte dalle reazioni di ossidazione e riduzione deineurotrasmettitori 2,3.

FCV consente la misurazione in tempo reale delle concentrazioni di neurotrasmettitori extracellulari in specifiche regioni cerebrali, fornendo alta risoluzione temporale e selettività chimicamoderata 4. Queste caratteristiche rendono il FCV particolarmente adatto allo studio della segnalazione neurochimica rapida sia in preparazioni in vivo che ex vivo, inclusi animali in movimento libero o anestetizzati e fette cerebraliacute 5,6,7. Questa tecnica offre diversi vantaggi: (1) protocolli di stimolazione controllata possono essere utilizzati per evocare risposte dopaminergiche definite; (2) il piccolo diametro dei microelettrodi in fibra di carbonio minimizza i danni ai tessuti e consente registrazioni spaziali precise; (3) FCV è altamente compatibile con manipolazioni farmacologiche, consentendo un'indagine efficiente sulla cinetica di rilascio e assorbimento di monoammine; e (4) la combinazione di selettività chimica e alta risoluzione temporale fornisce una rilevazione migliorata rispetto ad altri metodi elettrochimici, come l'amperometria, e ad approcci di campionamento come la microdialisi, che spesso non hanno la velocità necessaria per catturare eventi rapidi e transitori di neurotrasmettitori o affrontano difficoltà nell'identificare e quantificare molecolespecifiche 5.

La dopamina (DA) è un neuromodulatore chiave coinvolto nella ricompensa, nella motivazione, nel controllo motorio e in molteplici aspetti dell'apprendimento e della memoria, ed è caratterizzata da dinamiche di rilascio rapido etransitorio 8. Nella FCV, una forma d'onda di tensione triangolare, tipicamente da -0,4 V a +1,2 V, viene applicata ripetutamente a un microelettrodo in fibra di carbonio. Durante la scorrimento anodico (verso l'alto), la DA vicino alla superficie dell'elettrodo viene ossidata a circa +0,6 V, rilasciando due elettroni e formando dopamina-o-quinone. Durante la scansione catodica (verso il basso), questo composto viene ridotto nuovamente a DA a circa -0,2 V, assorbendo dueelettroni 9. La firma corrente-tensione risultante consente una rilevazione e quantificazione precisa del rilascio e dello schianco rapido del DA con alta risoluzione spaziale e temporale, rivelando fluttuazioni secondi per secondi nei livelli di DA extracellulari. Nei nostri esperimenti, le registrazioni FCV sono state raccolte a 10 Hz per 15-30 secondi, sufficiente a catturare il rilascio DA evocato dalla stimolazione elettrica.

All'interno dello striato, il rilascio di DA è strettamente regolato dagli interneuroni colinergici locali (ChIs). Sebbene i ChI costituiscano solo l'~1%-2% dei neuroni striatali, si arborizzano ampiamente e hanno un forte controllo sugli assoni dopaminergici tramite interazioni assoassoniche10,11. Questa regolamentazione probabilmente giocherà un ruolo fondamentale nell'apprendimento striatale. Durante l'apprendimento, i neuroni DA del mesencefalo mostrano un fuoco fasico in risposta alle ricompense o ai segnali predittividi ricompensa 12, mentre le ChI mostrano uno schema di attivazione eccitazione-pausa-rimbalzo altamentesincronizzato e multifasico 13. La coincidenza temporale tra la pausa ChI e l'attività DA fasica sottolinea ulteriormente l'importanza della regolazione mediata da ChI del rilascio di DA tramite recettori nicotinici dell'acetilcolina (nAChRs)14,15. Oltre a regolare il rilascio di DA, questa coincidenza temporale si è dimostrata necessaria per l'induzione della plasticità sinaptica correlata all'apprendimento nellostriato 16, indicando l'importanza di chiarire le interazioni tra ChI e segnalazione DA all'interno di questo circuito.

I ChI influenzano il rilascio dei DA attraverso almeno due meccanismi distinti. Innanzitutto, l'attivazione sincrona delle ChI può evocare un rilascio rapido e a breve latenza di DA che avviene indipendentemente dall'attivazione somatica dopaminergica tramite l'attivazione di nAChR sugli assoniDA 17, 18 e 19. Questa forma di rilascio assonale di DA è probabilmente mediata dalla generazione di potenziali d'azione ectopici all'interno degli assoniDA 17. In secondo luogo, l'attivazione di ChI può sopprimere profondamente il successivo rilascio di DA impedendo la depolarizzazione degli assoniDA 20. In particolare, questa soppressione avviene con una latenza molto breve e può essere indotta da livelli relativamente bassi di attività ChI che non provocano a loro volta il rilascio rilevabile di DA, suggerendo che l'attivazione dei nAChR sia più efficace nel sopprimere il rilascio di DA in corso che nel provocare il rilascio di DA. Pertanto, questi fattori suggeriscono che le ChI possano esercitare un'influenza complessiva soppressiva sul rilascio di DA in condizioni fisiologiche. Tuttavia, a una scala spaziale più fine, i ChI possono localmente facilitare il rilascio assonale DA.

Collettivamente, questi risultati evidenziano un ruolo regolatorio finemente calibrato per le ChI nel controllo della segnalazione DAstriatale 20. FCV fornisce un approccio potente per analizzare queste interazioni Chl-DA, poiché la sua alta risoluzione temporale consente una misurazione precisa sia degli effetti facilitatori che soppressivi dell'attività ChI sul rilascio di DA.

Questo articolo illustra le procedure essenziali per la fabbricazione di microelettrodi in fibra di carbonio e per la misurazione delle concentrazioni extracellulari di DA evocate utilizzando FCV in preparazioni ex vivo .

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Consiglio di Revisione Etica e per il Benessere Animale dell'Università di Exeter e condotte sotto licenza del Ministero dell'Interno [PP262252]. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione di microelettrodi in fibra di carbonio

  1. Riempi un contenitore di vetro pulito con acetone. Immergi completamente i capillari di vetro nell'acetone, assicurandoti che ogni capillare sia riempito.
  2. Con una pinzetta, inserisci una singola fibra di carbonio in un capillare pieno di acetone. Rimuovi i capillari dall'acetone e lasciali asciugare completamente all'aria.
  3. Carica il tubo capillare secco in un estrattore verticale per microelettrodi, posizionando il punto medio del tubo in linea con il filamento riscaldante.
  4. Attiva il puller e imposta il livello del riscaldatore a 58.1 per produrre due elettrodi in fibra di carbonio da un singolo tubo capillare. Raccogli gli elettrodi tirati per il taglio.
    NOTA: Non esistono impostazioni universali per la temperatura di riscaldamento o la forza di trazione. Questi parametri variano tra gli strumenti e devono essere ottimizzati tramite tentativi ed errori per ogni configurazione di laboratorio.
  5. Metti l'elettrodo tirato sotto un microscopio dotato di un reticolo al 10×. Con un bisturi, taglia la punta della fibra a una lunghezza di ~100 μm (Figura 1A).
  6. Rimuovere circa 1 cm di isolamento da ciascuna estremità di un filo conduttivo. Applica uno strato sottile di inchiostro d'argento conduttivo su un'estremità esposta.
  7. Inserisci l'estremità del filo rivestita d'argento nell'estremità posteriore dell'elettrodo in fibra di carbonio, assicurando un contatto saldo tra il filo e la fibra. Sigilla la connessione con la colla super e lascia asciugare completamente.

2. Preparazione delle soluzioni

  1. Prepara la soluzione di taglio a base di saccarosio.
    1. Per preparare 1 L di soluzione di taglio a base di saccarosio (pH 7,4, ~300 mOsm/L), sciogliere i seguenti componenti (in mM): 85 NaCl, 25NaHCO 3, 2,5 KCl, 1,25NaH 2PO4, 7 MgCl2, 10 glucosio e 65 saccarosio.
    2. Trasferire 200 mL della soluzione da taglio a base di saccarosio in una bottiglia pulita. Aggiungere 200 μL di 1 M CaCl2· H2Oper raggiungere una concentrazione finale diCaCl 2 di 1 mM. Fai bollire la soluzione con una miscela gassa al 95%O 2 / 5% CO2 per almeno 30 minuti prima dell'uso.
  2. Preparare liquido cerebrospinale artificiale (aCSF, pH 7,4, 300 mOsm/L) per la registrazione.
    1. Prepara una soluzione di stock 10× aCSF sciogliendo quanto segue in 1 L di acqua distillata: 1300 mM NaCl, 250 mMNaHCO 3, 25 mM KCl e 12,5 mM NaH2PO4. Conserva la soluzione di base a 4 °C.
    2. Per preparare 1× aCSF, combinare 100 mL della soluzione stock 10× aCSF con 52 mL di 0,5 MNaHCO 3. Diluire la miscela a 1 L con acqua distillata. Aggiungi 2 mL di 1 M CaCl2· H2O per ottenere una concentrazione finale di 2 mMCaCl 2. Fai una bolla nella soluzione con 95%O 2/5% CO2 per almeno 30 minuti prima dell'uso.
  3. Prepara la soluzione standard DA da 2,5 mM per la calibrazione
    1. Prepara 0,1 mM di acido perclorico diluendo 20 μL di 0,1 M di acido perclorico in 20 mL di acqua distillata. Mescola accuratamente per assicurare una completa diluizione.
    2. Pesare 9,48 mg di polvere di cloridrato DA e scioglierlo nell'acido cloridrico da 0,1 mM preparato sopra per ottenere una concentrazione finale di 2,5 mM. Conserva la soluzione a 4 °C e proteggila dalla luce per prevenire l'ossidazione.

3. Preparazione della fetta di cervello

  1. Eutanasia gli animali, poi estrarre rapidamente il cervello e trasferirlo immediatamente in una soluzione di taglio a base di saccarosio ghiacciata.
  2. Montare il cervello sulla piattaforma del vibratomo e tagliare fette coronali da 300 μm tra +1,5 mm e +0,5 mm rispetto al bregma a una velocità di taglio di 0,34 mm/s.
  3. Trasferire le fette in una camera di recupero contenente aCSF mantenuta a 32 °C. Incubare le fette per 30-40 minuti.
  4. Dopo il recupero, mantenere le fette a temperatura ambiente in un aCSF ossigenato continuamente fino a un ulteriore utilizzo.

4. Installazione del sistema e condizionamento degli elettrodi

  1. Accendi il sistema di perfusione. Perfondi l'intera attrezzatura con acqua distillata per almeno 10 minuti. Accendi il sistema di riscaldamento e imposta la temperatura a 32 °C.
    NOTA: Assicurati che il sensore di temperatura sia completamente immerso nella soluzione prima di attivare il riscaldatore.
  2. Attiva il software generatore di stimoli, la telecamera, il micromanipolatore e l'illuminazione di fondo del microscopio.
  3. Apri il software HDCV per l'acquisizione dati FCV. Imposta i parametri di tensione su una forma d'onda triangolare che spazza da -0,4 V a +1,2 V a una velocità di scansione di 400 V/s, applicata a 10 Hz.
  4. Posiziona la fetta cerebrale al centro della camera della fetta e fissala usando un'arpa.
  5. Utilizzando il micromanipolatore, porta la punta dell'elettrodo nel campo visivo del microscopio.
  6. Controlla la punta dell'elettrodo sotto il microscopio per confermare che sia intatta e non rotta.
  7. Inizia la raccolta dati e controlla il grafico corrente-tensione.
  8. Condiziona il nuovo elettrodo posizionandolo nel tessuto corticale e facendo ciclare una forma d'onda triangolare per almeno 30 minuti prima di registrare.
    NOTA: Un voltammogramma ciclico adeguato dovrebbe mostrare una curva di carica caratteristica (Figura 1B). Sostituire l'elettrodo se il voltammogramma è distorto (Figura 1C-E) o se la corrente di fondo è instabile. Se persiste l'instabilità, controlla la connessione di messa a terra.

5. Misurazione della concentrazione extracellulare di DA

  1. Utilizzando il micromanipolatore, sposta l'elettrodo di registrazione dal suo sito di condizionamento al punto di registrazione bersaglio all'interno della sezione cerebrale.
  2. Posizionare un elettrodo stimolante bipolare concentrico nel sito di registrazione desiderato. Posizionare l'elettrodo di registrazione a circa 50 μm dall'elettrodo di stimolazione (Figura 2A,B).
  3. Fornire una stimolazione elettrica a impulso singolo a 0,65 mA con una larghezza dell'impulso di 200 μs e un intervallo inter-stimolo di 150 s. Verifica che i picchi di ossidazione e riduzione si verifichino alle tensioni attese (Figura 2C) e che il transiente DA mostri la tipica cinetica di rilascio e clearance (Figura 2D).
  4. Registra 10 segnali DA di base e ripassa le ultime tre tracce di baseline. Confermare che la variazione tra questi segnali è inferiore al 5%.
    NOTA: Se l'ampiezza del segnale è bassa o continua a diminuire, controllare l'apporto di carbogeni, la stabilità termica e l'osmolarità e il pH dell'aCSF.
  5. Fornire impulsi di stimolazione utilizzando una sequenza pseudorandomizzata che include sia paradigmi a singolo impulso (1p) che a quattro impulsi (4p, 100 Hz).
    NOTA: La stimolazione a 4p 100 Hz imita il naturale scarico ad alta frequenza dei neuroniDA 11 ed è comunemente utilizzata per valutare la massima intensità della depressione dipendente da ChI, che si verifica circa 7-8 ms dopo l'attivazione20 di ChI. Alternare i modelli di stimolazione durante tutta la registrazione per minimizzare il bias di sequenza.
  6. Sciogliere l'agente farmacologico desiderato nell'aCSF e far bollire la soluzione con 95%O 2/5% CO2 per almeno 10 minuti.
  7. Applicare il farmaco nella camera da bagno e incubare fino a raggiungere l'effetto farmacologico completo (ad esempio, 10-15 minuti per DHβE). Ripetere le procedure di stimolazione e registrazione in condizioni trattate con farmaci.

6. Calibrazione

  1. Preparare una soluzione di calibrazione DA da 2 μM diluendo 20 μL dello stock DA da 2,5 mM in 25 mL di aCSF ossigenato.
  2. Posiziona l'elettrodo vicino all'ingresso. Regola la messa a fuoco del microscopio per visualizzare chiaramente i bordi superiore e inferiore dell'ingresso. Rifocalizza il centro del tubo di ingresso e regola il micromanipolatore (su o più in basso) finché la punta dell'elettrodo non è chiaramente visibile.
  3. Perfondere l'elettrodo con aCSF ossigenato a portata elevata per circa 10 secondi per lavare la superficie dell'elettrodo. Osservando l'interruttore al microscopio, cambia la linea di perfusione da aCSF a soluzione di calibrazione DA.
  4. Mantieni la perfusione con la soluzione DA per 30-60 secondi. Riporta il tubo all'aCSF e continua la perfusione per lavare via la DA. Ripeti l'intera procedura di calibrazione tre volte.
  5. Calcola il fattore di calibrazione (nA/μM) usando la risposta media alla corrente (ΔI) delle tre applicazioni DA (Figura 2E). Per ogni applicazione, calcola ΔI usando: ΔI = IDApeak− IDAbase. Fai la media dei valori di ΔI e dividi per la concentrazione nota di DA (2 μM) per ottenere il fattore di calibrazione dell'elettrodo.
  6. Etichetta l'elettrodo con la data dell'esperimento e salva tutti i file di dati di calibrazione per riferimento futuro.
    NOTA: Ogni elettrodo di registrazione viene calibrato alla fine della giornata sperimentale e non viene riutilizzato per registrazioni successive per garantire sensibilità e accuratezza ottimale.

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Risultati

Le ampiezze di rilascio DA sono state quantificate da registrazioni FCV sottratte in background. Per ogni prova, il segnale di fondo è stato generato tramite la media di cinque voltamogrammi stabili pre-stimolazione, permettendo un isolamento chiaro del picco di ossidazione. Il rilascio di DA è stato misurato come la corrente di ossidazione di picco a circa +0,6 V. Al termine di ogni esperimento, gli elettrodi venivano calibrati e le correnti di ossidazione di picco convertite in concent...

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Discussione

Questo protocollo descrive le procedure fondamentali per misurare il rilascio di DA evocato utilizzando FCV in fette cerebrali acute di topo e fornisce una guida completa al flusso di lavoro essenziale. Oltre alle applicazioni specifiche per DA, la FCV può essere utilizzata anche per rilevare altri neurotrasmettitori, come noradrenalina e serotonina, sia in preparazioni ex vivo che in vivo 21,22,23.

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Dichiarazioni

Yan-Feng Zhang è il fondatore di Oxbio.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione (SBF009\1125) del premio Springboard dell'Academy of Medical Sciences sostenuta dalla British Heart Foundation, Diabetes UK, dal Dipartimento Governativo per la Scienza, l'Innovazione e la Tecnologia (DSIT) e Wellcome to Y. -F. Z.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AcetoneSigma-Aldrich534064-500ml
Cloruro di calcioSigma-Aldrich21115-100mlSoluzione 1M
Fibra di carbonioGoodfellow Cambridge LimitedLS596012 APB
Elettrodo bipolare concentricoFHC300197Elettrodo di stimolo
Dihydro-β-eritroidina idrobromuroTocris Biosciences12A/295293
Dopamina HClapexbtB1482
Sistema di potenziostato a scansione rapida a voltammetria ciclicaWaveNeuroAF01FSCV1
Capillari in vetro  Apparecchiatura HarvardGC200F-10
GlucosioSigma-AldrichSLCQ7550
Alimentazione AlogenaOlympus TH4
Stimolatore di corrente isolatoDigitimerDS3
Cloruro di magnesio esadiratoSigma-AldrichM2670
Cavo Multicore & nbsp;Multicomp Pro3372784
Acido percloricoScienza dei pescatoriUN29200,1 M in acido acetico glaciale
Pompe peristalticheGilson MINIPLUS 3
Cloruro di potassioSigma-AldrichP9541
Prime BSI ExpressTeledyne01-PRIME-BSI-EXP
Vernice conduttiva d'argentoComponenti RSRS 186-3600
Riferimento sull'argento/cloruro d'argentoStrumenti di Precisione Mondiale0226EElettrodo di riferimento
SliceScopeScientificaPro 2000
Bicarbonato di sodioSigma-AldrichS5761
Cloruro di sodioScienza dei pescatori2402665
Monobasico fosfato di sodioSigma-AldrichS5011
Generatore di stimoliSistemi multicanaleSTG5 
SucrosioMillipore84100
Estrattore verticale per microelettrodi  NarishigePC-100

Riferimenti

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Microelettrodo a fibra di carbonioPreparazione di fette cerebraliRilevamento di neurotrasmettitoriCondizionamento dell'elettrodoAcquisizione datiTrasmissione monoaminergicaRecettore nicotinico dell'acetilcolina

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