Articolo metodologico

Profilazione dell'accessibilità della cromatina in larve intere di Caenorhabditis elegans L4

DOI:

10.3791/69791

⸱

17 aprile 2026

 ,  , 
1Departamento de Biología Celular y Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular (IFC), Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un protocollo ATAC-seq rapido e semplice da implementare nel verme intero Caenorhabditis elegans a stadio L4 utilizzando solo 30 μL di pellet di verme.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'accessibilità alla cromatina svolge ruoli essenziali nella trascrizione, nella riparazione del DNA e nella segregazione cromosomica. Le regioni iper-accessibili solitamente sono correlate con promotori e potenziatori attivi, facilitando il legame dei fattori di trascrizione e l'attività regolatoria. Il test per la cromatina accessibile alla trasposasi tramite sequenziamento (ATAC-seq) consente una profilazione genomica dell'accessibilità alla cromatina con pochissime cellule. Tuttavia, la sua applicazione in Caenorhabditis elegans è limitata dalla ricca cuticola di collagene del nematode, che complica la dissociazione cellulare. Qui presentiamo un protocollo ottimizzato per eseguire ATAC-seq in interi worm allo stadio L4. La procedura inizia con colture sincronizzate e coinvolge la disgregazione delle cuticole, la dissociazione enzimatica e la preparazione alla sospensione cellulare. I nuclei permeabilizzati vengono quindi sottoposti a trasposizione di Tn5, seguita da un'amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR) e dalla purificazione delle librerie pronte per il sequenziamento di nuova generazione (NGS). Questo protocollo richiede 30 μL di pellet di vermi, può essere completato in un giorno e genera 5.000–9.000 picchi di accessibilità nel ceppo di riferimento Bristol N2. Questo flusso di lavoro semplificato può essere adattato ad altre fasi dello sviluppo o a popolazioni cellulari purificate da FACS. Riducendo le barriere tecniche all'ATAC-seq in C. elegans, questo metodo amplia le opportunità di studiare l'accessibilità della cromatina a livello genomico in risposta a perturbazioni genetiche e ambientali in un contesto di organismo completo.

Introduzione

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I genomi eucariotici sono densamente impacchettati all'interno del nucleo cellulare. Per far fronte ai vincoli spaziali, il DNA è strettamente avvolto attorno ai nucleosomi, complessi multiproteici composti da otto istone altamente conservate tra diversiphyla 1. I modelli di accessibilità della cromatina variano a seconda dello stato cellulare di un tessuto, e i modelli specifici del gene 2,3,4. L'accessibilità ai nucleosomi è fortemente correlata con la trascrizione attiva, in particolare ai promotori e alle regioni regolatorie distali come gli esaltatori, che sono accessibili ai fattori di trascrizione5. Le regioni della cromatina aperta svolgono anche ruoli importanti nella riparazione, replicazione e segregazionecromosomica 3. Al confronto, la ridotta accessibilità è solitamente correlata a eterocromatina silenziata e sequenzeripetitive 6,7.

Mappare l'accessibilità della cromatina è stato un approccio potente per comprendere la regolazione genica. Sono state impiegate diverse tecniche per esaminare l'accessibilità della cromatina. Tra i primi metodi, la nucleasi micrococcica (MNasi) e la digestione DNase I sono state utilizzate per mappare il posizionamento e l'accessibilità dei nucleosomi in locispecifici 8,9. Queste tecniche sono state successivamente implementate per studi a livello genomico quando abbinate al sequenziamento di nuova generazione (NGS)10,11. Tuttavia, queste tecniche richiedono un'attenta calibrazione della concentrazione enzimatica e del tempo di reazione, insieme a un numero consistente di cellule, per un'implementazione efficace.

Nel 2013, il laboratorio Greenleaf ha stabilito il saggio per la cromatina accessibile alla trasposasi tramite sequenziamento (ATAC-seq) per mappare in modo fluido l'accessibilità della cromatina a livello genomico utilizzando un basso numero dicellule 12. ATAC-seq sfrutta la trasposasi Tn5 disponibile commercialmente per inserire preferenzialmente brevi sequenze di DNA (cioè codici a barre) in regioni di cromatina aperta, tipicamente prive di nucleosomi, e si correla con promotori e potenziatori attivi. Il protocollo richiede permeabilizzazione cellulare e isolamento dei nuclei, seguiti da una digestione limitata con Tn5 per la tagmentazione della cromatina iperaccessibile. Successivamente, durante la PCR vengono incorporati indici complementari, facilitando il multiplexing del campione prima dellaNGS 13. ATAC-seq si è dimostrato un protocollo robusto che consente anche l'impronta in silico del fattore di trascrizione ed è stato implementato per la risoluzione a singolacellula 14,15,16,17. Oltre ai campioni di topi e umani, ATAC-seq è stato implementato in vari sistemi, inclusi pesci zebra e invertebrati come Drosophila e il nematode Caenorhabditis elegans 18,19,20.

Per decenni, C. elegans è stato un potente sistema modello in campi come lo sviluppo, la biologia cellulare e le neuroscienze, portando a scoperte fondamentali tra cui l'identificazione di micro RNA e l'interferenza RNA (RNAi)21,22. Ha un genoma compatto da 100 MB con ~20.000 geni codificanti perproteine 23. La regolazione genica avviene attraverso l'attività dei promotori così come tramite potenziatori distali, che sono stati mappati tramite ATAC-seq attraverso diversi tessuti, fasi di sviluppo e punti temporali diinvecchiamento 24,18. Il profiling dell'accessibilità della cromatina è quindi diventato uno strumento prezioso per comprendere la regolazione genica in C. elegans. Di conseguenza, ATAC-seq offre un potenziale particolare per lo studio di paesaggi epigenetici attraverso diverse condizioni ambientali o isolati selvatici, al fine di scoprire risposte trascrizionali diverse. Inoltre, potrebbe fornire informazioni sull'architettura della cromatina di altri nematodi patogeni e non patogeni.

Una delle principali sfide metodologiche in C. elegans è la presenza di una cuticola ricca di collagene che deve essere dissociata per ottenere una sospensione cellulare omogenea da vermiinteri 25. Per affrontare questa sfida, abbiamo compilato e ottimizzato diversi protocolli per disintegrare i nematodi e poi eseguire ATAC-seq in C. elegans18,26. Si preferisce utilizzare lo stadio larvale L4, poiché gli animali in questo punto di sviluppo possiedono una linea germinale trascrizionalmente attiva, che si traduce in cromatina aperta, fornendo una fonte costante e informativa di accessibilità alla cromatina nelle cellule somatiche. Qui presentiamo un protocollo rapido ed efficiente per la dissociazione dei vermi e la generazione di sospensioni cellulari, abilitando ATAC-seq in C. elegans. Il nostro metodo è ottimizzato per vermi in stadio L4 e richiede anche solo 30 μL di pellet per vermi, con il potenziale di adattamento ad altre fasi dello sviluppo o a campioni più piccoli, come le cellule purificate con FACS. Questo protocollo può essere eseguito in diversi ceppi e condizioni di C. elegans, consentendo l'identificazione di picchi di accessibilità da 5.000 a 9.000 cromatine nel ceppo di riferimento Bristol-N2, gettando le basi per successive analisi di accessibilità della cromatina.

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Protocollo

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Si consiglia di indossare sempre i guanti.

NOTA: Giorno 1: Preparazione della popolazione sincronizzata di vermi. Tutti i vermi sono stati coltivati su piastre NGM seminate con E. coli OP50. Cose necessarie prima di iniziare: (per campione o ceppo), Una piastra vermiforme adulte da 90 mm o due da 60 mm, una piastra da 90 mm o due da 60 mm con cibo, Tampone sterile M927 (3 gKH 2PO4, 6 gNa 2HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O a 1 L. Sterilizzare tramite autoclaving)

1. Raccolta di vermi

  1. Prendi una piastra da 90 mm (o due da 30 mm) con la popolazione adulta del verme.
  2. Recuperare i vermi con il tampone M9 e trasferirli in un tubo centrifuga da 15 mL.
  3. Ripeti il passaggio precedente per recuperare tutti i vermi dalla placca/e.
  4. Lascia che i vermi si depositino nel tubo da 15 mL per un minuto e rimuovi con cura il buffer M9.
  5. Assicurati di avere ~1 mL di vermi.

2. Sbiancamento

  1. Aggiungere 5 mL di tampone M9 + 650 μL di NaOH 5M + 1.300 μL di candeggina domestica (soluzione al 5% di NaClO).
  2. Vortice alla velocità massima per 1–2 minuti (non più di 2,5 minuti).
  3. Centrifugare a 1.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente (RT).
  4. Rimuovi il sovrantato e aggiungi 9 mL di buffer M9.
  5. Ripeti le sezioni 2.3 e 2.4 altre cinque volte.
  6. Risospezione degli embrioni in 7 mL di tampone M9.
    NOTA: Il protocollo di sbiancamento può variare in efficienza a seconda della temperatura, del tipo di candegginacommerciale 28.

3. M9 (liquido) schiusa notturna delle uova

  1. Assicurati che il tubo di raccolta con le uova sbiancate sia chiuso correttamente.
  2. Metti il tubo in movimento lento a 20 °C (ad esempio, in uno shaker all'interno di una stanza a 20 °C).
  3. I vermi si schiuderanno durante la notte e si arresteranno in L1.
    NOTA: Non lasciare il tubo per più di 12 ore.

4. Giorno 2: crescita dei vermi: recupero dei vermi L1 .

  1. Prendi il tubo dallo shaker e conferma al microscopio che ci sono vermi L1 .
  2. Lascia che il tubo si stabilizzi verticalmente per circa 1 ora a RT.
  3. Rimuovere il sovrantantante e trasferire ~300 vermi L1 su una piastra da 90 mm o due piastre da 30 mm con cibo.
  4. Mettili in un incubatore a 20 °C e lasciali crescere per 26 ore fino a raggiungere la fase L4.

5. Giorno 3: Preparazione delle soluzioni stock: Le soluzioni successive devono essere pronte per produrre soluzioni fresche al giorno 4

NOTA: Questo può essere fatto al giorno 2 o 3.

  1. 1 mL di SDS al 10%.
  2. 50 mL di 1M HEPES pH 8 (autoclave).
  3. 250 mL di saccarosio al 20% (autoclave).
  4. 100 mL di NaCl 2M: preparare (autoclave).
  5. 50 mL di 2M KCl (autoclave).
  6. 10 mL di 1MCaCl 2 (autoclave).
  7. 10 mL di 1MMgCl 2 (autoclave).
  8. 100 mL di 1M Tris, pH 7,4.
  9. 5 mL di NaCl 5M (autoclave).
  10. 500 μL di 10% Tween-20.
  11. 500 μL di Nonidet P40/IGEPAL al 10%.
  12. 100 μL di Digitonina al 5% (deve essere riscaldata a 65 °C per sciogliersi).
  13. 500 μL di BSA al 10% (filtro con 0,22 μm) immagazzinato a 4 °C.
    Giorno 4: Vermi stadio L4 per ATAC
    NOTA: Prima di iniziare, assicurati di avere un incubatore a 25 °C, una centrifuga a 4 °C pronta, riscaldare la Digitonina a 65 °C (per la preparazione del tampone fresco), avere tampone M9 sterili, H2O sterile e filtri da 20 μm.

6. Preparazione della soluzione

  1. Preparare soluzioni fresche (vedi Tabella 1). Maneggia sempre L-15 al 10% di FBS e il buffer delle uova in condizioni sterili e mantienili freddi.

Tabella 1: Scorte per la preparazione della soluzione fresca. Ricette per la preparazione del stock per la dissociazione del nematode e il protocollo di sospensione cellulare (sezioni 6 e 7). Clicca qui per scaricare questa tabella.

7. Protocollo di dissociazione dei nematodi e sospensione cellulare

NOTA: Sarà necessario un piatto da 90 mm o due da 30 mm con una popolazione di vermi sincronizzati L4.

  1. Dopo 26 ore nell'incubatore a 20 °C, confermare al microscopio che la maggior parte dei vermi si trova nello stadio L4.
  2. Recupera tutti i vermi dalle piastre con il buffer M9 e mettili in un tubo centrifuga da 1,5 mL.
  3. Lava 5 volte con 1 mL di H2Osterile lasciando che i vermi si depositino per gravità.
  4. Trasferisci il tubo con i vermi in un incubatore a 25 °C per 30 minuti per eliminare i resti di cibo intestinale.
  5. Prendi 50 μL di pellet di vermi e mettilo in un nuovo tubo.
  6. Aggiungi 200 μL di buffer fresco SDS-DTT e mescola in un rotatore a tubo per esattamente 5 minuti (non di più).
  7. Aggiungi 1 mL di buffer freddo per uova e fai girare un picofuge per rimuovere il soprantantante. Ripeti 6 volte.
  8. Aggiungi 80 μL di pronasi fresca preparata (15 mg/mL).
  9. Con una pipetta da 200 μL (con punte filtrate), mescola 70 volte il mix di vermi pronasi e incuba per 15 minuti a RT.
  10. Aggiungi 800 μL di substrato L-15 al 10% FBS e centrifuga 5 minuti a 500 x g a 4 °C.
  11. Aggiungi 1 mL di substrato L-15 al 10% FBS e ripeti la centrifugazione.
  12. Ripeti il passaggio precedente altre due volte.
  13. Rimuovere il sovrantantante e risospendere in 900 μL di mezzo L-15 al 10% FBS.
  14. Filtra con un filtro da 20 μm.

8. Isolamento dei nuclei e marcatura della cromatina

NOTA: Usa punte filtrate con pipetta. Prima di iniziare: togli il tampone Tn5, lascialo scongelare, imposta un termoblocco a 37 °C, estrai il kit di purificazione del prodotto PCR (Tabella dei materiali), metti il tampone EB a 37 °C, la centrifugazione delle colonne deve essere eseguita a RT.

  1. Centrifuga la sospensione a cella filtrata per 5 minuti a 500 x g a 4 °C.
  2. Rimuovere il soprantantante, lasciando ~50 μL.
  3. Aggiungi 45 μL di tampone di lisi (appena preparato) e risospezioni con attenzione.
  4. Aggiungi con attenzione 50 μL di Wash Buffer (non mescolare).
  5. Centrifugare per 5 minuti al 500 x g a 4 °C. Rimuovi il soprantantante. Tienilo nel ghiaccio.
  6. Durante la rotazione, preparare per ogni reazione (Rx) la seguente miscela Tn5 per campione: 25 μL Tn5 Buffer29, 24,8 μL Nucleasi-free H2O, 0,2 μL enzima Tn5. Prepara un master mix per più campioni.
  7. Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprantantante. Tieni i nuclei sul ghiaccio. Aggiungi 50 μL di miscela di Tn5 al pellet dei nuclei e pipetta lentamente sette volte. Incubare a 37 °C per 30 minuti su un termoblocco. Assicurati di dare piccoli colpetti a ogni tubo ogni 10 minuti.
    NOTA: Rimuovere il kit di purificazione PCR e posizionare il buffer EB in un incubatore a 37 °C. I prossimi 5 passaggi utilizzeranno i buffer di questo kit.
  8. Dopo l'incubazione di Tn5, aggiungi 300 μL di buffer PB (Giallo) dal kit e mescola un vortice alla massima velocità per 25 secondi.
  9. Prendi tutto il volume dal tubo e trasferiscilo nella colonna di rotazione (viola, conservata a 4 °C) e centrifuga 1 minuto alla massima velocità in RT.
    NOTA: La colonna conterrà il DNA, quindi il soprannatante può essere scartato con fiducia.
  10. Aggiungi 750 μL di PE Buffer alla colonna di rotazione e centrifuga 1 minuto alla velocità massima a RT.
  11. Scarta il sovrantantante con il tubo di raccolta. Posizionare la colonna in un nuovo tubo da 1,5 mL e ripetere la centrifugazione; scartare il tubo da 1,5 mL.
  12. Posizionare la colonna in un nuovo tubo etichettato da 1,5 mL e aggiungere 10 μL di EB Buffer a 37 °C al centro della colonna. Assicurati di non toccare la colonna. Lascialo a RT per 1 minuto.
  13. Centrifugare per 1 minuto alla velocità massima a RT; mai a 4 °C.
  14. Ripeti gli ultimi 2 passaggi per un totale di eluzione di 20 μL nel buffer EB.
    NOTA: Pausa opzionale: Se si interrompe, i campioni possono essere conservati a -20 °C. Qui, la cromatina etichettata si trova in un volume di 20 μL.

9. Amplificazione della libreria

  1. Per l'amplificazione della libreria ATAC, è necessario eseguire una PCR in tempo reale per stimare il numero corretto di amplificazione del ciclo (vedi Tabella 2). Esegui questo su una piastra PCR.
  2. Per stimare i numeri di ciclo per l'amplificazione finale, si deve prendere il numero di ciclo corrispondente al primo terzo della curva di amplificazione. È ideale che il numero del ciclo non superi 15. Il numero del ciclo deve essere stimato per ogni campione.
    NOTA: Dopo la qPCR, il DNA marcato si trova in un volume di 18 μL. Pausa opzionale: Se si vuole fermarsi, i campioni possono essere conservati a -20 °C.
  3. Amplificazione finale della libreria ATAC:
    1. Ogni campione deve avere un primer diverso per RV (prendi appunti).
    2. Ogni campione deve essere amplificato per il numero di ciclo (N) stimato per ciascuno.
    3. Esegui questa PCR in tubi da 200 μL (vedi Tabella 3).
    4. Qui ci sono 8 μL di DNA taggato e 50 μL di librerie ATAC amplificate
    5. Pausa opzionale: Se si vuole fermarsi, i campioni possono essere conservati a -20 °C.

Tabella 2: Istruzioni per la prima amplificazione della libreria. Programma di ricetta e PCR per la prima amplificazione della libreria (sezione 9). Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Istruzioni per l'amplificazione finale della libreria ATAC. Programma di ricetta e PCR per l'amplificazione finale della libreria (sezione 9). Clicca qui per scaricare questa tabella.

10. Purificazione della biblioteca

NOTA: Prima di iniziare, tira fuori dalle perline di selezione della dimensione (AMPure, SPRIselect o perline calibrate fatte in casa) per farle adattare alla temperatura ambiente. Mescola vigorosamente le perline usando il vortice ogni volta prima di usarle.

  1. Prepara 1 mL di etanolo all'80% (grado molecolare).
  2. Aggiungere 25 μL (0,5 vol) di sfere al tubo campione (dove ce ne sono 50 μL) e mescolare con la pipetta.
  3. Incubare a RT per 10 minuti.
  4. Metti i tubi nel rack magnetico per 5 minuti.
  5. Trasferire il sovrantantante (70 μL) in un nuovo tubo pulito da 200 μL.
    NOTA: In questo passaggio, i frammenti di DNA di <200 bp vengono scartati.
  6. Aggiungi 65 μL (1,3 vol) di perline e mescola 10 volte.
  7. Incubare a RT per 10 minuti.
  8. Metti i tubi nel rack magnetico per 5 minuti.
  9. Scartare il sovrantantante (senza prendere il tubo dal rack magnetico).
    NOTA: A questo punto, le perle contengono frammenti di DNA a >200 pb e <1000 pb.
  10. Con il tubo ancora sul rack magnetico, aggiungi 200 μL di etanolo fresco preparato all'80% direttamente sopra le sfere e pipetta su e giù più volte per lavarle.
  11. Rimuovere l'etanolo e ripetere il lavaggio con 200 μL di etanolo.
  12. Elimina l'etanolo, poi lascia asciugare le perline con il coperchio aperto per ~2–5 minuti (non lasciarle asciugare troppo).
  13. Togli il/i campione/i dal rack magnetico. Risospeso 50 μL di H2Osterile. Assicurati di lavare tutte le perline dalle pareti del tubo.
  14. Infine, incuba il/i tubo/i nel rack magnetico per 5 minuti.
  15. Trasferisci il sovrantantante in un nuovo tubo pulito. Qui sono conservate le librerie ATAC amplificate e purificate.
    NOTA: Le biblioteche possono essere conservate a -20 °C per un breve periodo (fino a quattro settimane) o per periodi più lunghi a -80 °C.

11. Distribuzione delle dimensioni dei frammenti

  1. Una volta completata l'amplificazione finale, è consigliabile far passare una parte del campione attraverso un'elettroforesi capillare per poter osservare il modello di distribuzione della dimensione dei frammenti.

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Risultati

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Il controllo qualità dopo la tagmentazione garantisce una preparazione accurata della libreria
Durante il protocollo, è importante prestare particolare attenzione alla qPCR eseguita dopo la marcatura della cromatina (sezione 9), poiché rappresenta un passaggio fondamentale per valutare la qualità del DNA e le prestazioni dell'esperimento. La Figura 1A mostra due curve di amplificazione; Quella sinistra (sotto i 15 cicli) rappresenta materiale di buona qualità che dimostra...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui descriviamo un protocollo ottimizzato per il profilo dell'accessibilità della cromatina a livello genomico tramite ATAC-seq in vermi interi Caenorhabditis elegans a stadio L4. L'accessibilità alla cromatina influenza direttamente l'espressione genica, la riparazione del DNA, la replicazione e la ricombinazione, e sebbene ATAC-seq sia diventato un approccio standard per campioni cellulari e tissutali, la sua applicazione a organismi intatti pone sfide tecniche uniche, in part...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi. Non è stata utilizzata alcuna IA generativa nella scrittura, analisi o preparazione di questo manoscritto.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J Hersch-González ha ricevuto una borsa di studio di dottorato dal Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías, CONAHCYT (oggi Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación, SECIHTI) (#CVU 846476). J Hersch-González fu sostenuto da una borsa di studio CONAHCYT (ora SECIHTI) (788519). Questo progetto è stato supportato dalla sovvenzione PAPIIT-UNAM IN217824 e dalla sovvenzione SECIHTI CBF-2025-I-2275 a VJV. All'IFC ringraziamo l'UBM: Laura Ongay-Larios, Guadalupe Códiz Huerta e Minerva Mora Cabrera; l'UBMI: Augusto César Poot-Hernández e Carlos Peralta Alvarez; e Unidad de Cómputo, Imagenología, Taller e Biblioteca. Ringraziamo con gratitudine il Caenorhabditis Genetics Center (CGC) per aver fornito i ceppi utilizzati in questo lavoro. Il CGC è finanziato dall'Ufficio per i Programmi di Infrastrutture di Ricerca del NIH (P40 OD010440).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
250 mL, 0.22 µm PESUltra Curzsc-200253
AgarBD214010
Agencourt AMPURE XPNalgeneA63886
Bovine Serum AlbuminMaplica200100
Calcium ChlorideSigmaC5670-100G
CellTrics 20 µmSysmex04-0042-2315
CholesterolSigmaC8503-25G
DigitoninSigmaD141-500 mg
Disposable glovesMicroflex94-243
DL-DithiothreitolsigmaD0632-10GNocivo
Ethyl alcohol, pureSigma1003661421
Fetal Bovine SerumbiowestS181S-500
HEPESSigmaH3375-250 G
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer (large Kit)Illumina20034211
Kapa Syber 50 mLSigmaKK4618
L-15 Medium (Leivobitz)sigmaL4386-10L
Magnesium Chloride anhydrousSigmaM8266-100G
Magnesium Sulfate HeptahydrateSigmaM1880-500G
Magnesium Sulfate HeptahydrateSigmaM1880-500G
MinElute PCR Purification Kit (50 preps)Qiagen28004
NEBNext® High-Fidelity 2X PCR Master MixNEBM0541S
Nonidet P40 SubstituteSigma74835-1L
Pen StrepGibco15140-122
PeptoneBD211677
Petri dish 60 mmTritechT3308
Petri dish 90 mmInterluxC9015-2C
Pipet tips 10 µL, filterCellpro800108
Pipet tips 20 µL, filterCellpro800708
Pipet tips 200 µL, filterCellpro800608
Potassium ChlorideSigmaP9541 -500G
Potassium Phosphate Dibasic PowderJ.T. Baker3252-01
Potassium Phosphate Monobasic, CrystalJ.T. Baker3246-01 500G
Sodium ChlorideJT Baker3624-01
Sodium dodecyl sulfatesigmaL4509-100G
Sodium HydroxideMacron7708-10
Sodium HypochloriteCloralex544394479
Sodium Phosphate Dibasic 7-Hydrated CrystalJ.T. Baker3824-01
SPRIselectBeckmanB23318
SucroseSigmaS0389-500G
Syringe Filter PVDF 0.22 µmUltra CurzSc-358812
Trizma baseSigmaT1503 1KG
Tween 20SigmaP9416-50ML

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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