Tracciamento sincrono multiarticolare basato su deep learning per la quantificazione oggettiva della cinematica locomotoria degli arti posteriori nei ratti

Summary

Questo protocollo stabilisce una pipeline di valutazione cinematica degli arti posteriori del ratto utilizzando un test su tapis roulant senza marker con auto-etichettatura multiarticolare guidata dal deep learning, che consente la quantificazione riproducibile del movimento.

Abstract

Una valutazione accurata e oggettiva dell'andatura dei ratti è essenziale nei campi di ricerca in neuroscienze e cinesiologia. I sistemi convenzionali spesso dipendono dall'imaging dell'impronta per l'inferenza indiretta dell'andatura, che non può catturare completamente la cinematica multi-articolare dell'arto posteriore. Questo studio stabilisce un sistema di analisi dell'andatura basato su tapis roulant senza marcatori per roditori, integrando algoritmi personalizzati di deep learning con un tapis roulant programmabile a supporto del peso per consentire il tracciamento in tempo reale di più articolazioni degli arti inferiori e la quantificazione cinematica multidimensionale. Il sistema estrae automaticamente parametri del ciclo dell'andatura, traiettorie articolari, schemi di distribuzione delle forze e fluidità del movimento sotto velocità modulata (0-300 mm/s), inclinazione (±gradiente di 30°) e supporto di peso graduato (0-500 g), fornendo uno strumento di valutazione oggettiva per la ricerca sul comportamento neuromuscolare. Utilizzando modelli di lesione del midollo spinale (SCI), i risultati dimostrano la sensibilità del sistema nel rilevare differenze multidimensionali nell'ampiezza di movimento articolare, nella continuità della traiettoria, nell'output della forza propulsiva e nella fluidità del movimento tra roditori sani e feriti, convalidando le sue capacità di discriminazione e gradazione delle malattie. Rispetto ai tradizionali punteggi soggettivi o ai metodi di footprint, questa piattaforma elimina i bias personali e le limitazioni dei dati a bassa dimensione, combinando al contempo un'architettura basata sul deep learning e i vantaggi della raccolta dati ad alto throughput. È applicabile alla ricerca che coinvolge lesioni dei nervi centrali o periferici, malattie neurodegenerative, disturbi muscoloscheletrici e processi di invecchiamento. Attraverso l'integrazione sincrona dei moduli di neuroelettrofisiologia, il sistema consente ulteriormente l'accoppiamento temporale dei segnali dell'andatura e neurali, stabilendo un quadro metodologico per analizzare i meccanismi di controllo centrale-periferico e sviluppare strategie neuromodulatorie.

Introduction

Nelle neuroscienze contemporanee e nella ricerca locomotoria, la quantificazione oggettiva dell'andatura è ora imperativa per analizzare le funzioni neuro-muscolari, chiarire i meccanismi delle malattie e valutare le strategie di^{riabilitazione.} La sua elevata risoluzione spaziotemporale consente di catturare sottili variazioni nelle sinergie tra comandi neurali, profili di attivazione muscolare e meccanica scheletrica, stabilendo così una base empirica per l'indagine della coordinazione delle vie supraspinali, del feedback periferico e dei contesti meccanici. Le metriche cinematiche riproducibili aumentano la sensibilità al rilevamento per lesioni, cambiamenti degenerativi ed effetti terapeutici, accelerando la pipeline di sviluppo di farmaci e dispositivi².

Piattaforme di valutazione convenzionali come CatWalk, DigiGait o analisi semplificate dell'impronta inferiscono indirettamente la cinematica articolare basandosi su schemi di contatto plantare. Questi approcci producono metriche a bassa risoluzione e incoerenti che non riescono a catturare la complessità cinematica multi-articolare dell'arto^{posteriore 3,4}. L'obiettivo generale del nostro metodo è stabilire un sistema di analisi dell'andatura ad alta precisione, senza marcatori e supportato dal peso, specificamente progettato per modelli di roditori. Pertanto, stabiliamo un quadro innovativo che: (i) mantiene i roditori in posizione eretta sotto carico assiale controllato (0-100% peso corporeo) durante l'imaging continuo multi-articolare, (ii) localizza direttamente i punti di riferimento anatomici del piano sagittale dall'analisi della vista laterale fino all'apprendimento profondo per generare traiettorie spaziali 2D, (iii) esporta angoli articolari risolti nel tempo e la cinematica segmentaria per la modellizzazione^{statistica 5}. Fondamentalmente, questo framework si basa sull'applicazione del deep learning a compiti di computer vision, che consente un'estrazione robusta di funzionalità congiunte dai dati video.

Rispetto ai sistemi esistenti, questa piattaforma offre quattro vantaggi chiave. Il suo funzionamento senza marcatori elimina i tag riflettenti o impiantati riducendo significativamente la complessità procedurale e gli artefatti^{di movimento 6}. Il sistema integrato di sospensione a force-feedback consente un supporto preciso e graduale del peso corporeo (0-100%), facilitando una valutazione completa dell'andatura lungo il continuum carico pieno a scarico, assente nei tapis roulant^{commerciali 7}. L'architettura del deep learning consente un rapido ritraining per ceppi, età o condizioni patologiche nuove, superando il tracciamento manuale in^{scalabilità 8}. E le coordinate spaziali multi-giuntura ad alta precisione permettono un'analisi dettagliata della cinematica interarticolare abbinata a una profilazione quantitativa di schemi di andatura aberranti.

Questo protocollo è ampiamente applicabile. Permette di studiare il controllo sopraspinale, i loop di feedback propriocettivo e le sinergie muscolari sotto richieste meccaniche^{modulate 9}. Dal punto di vista fisiopatologico, fornisce biomarcatori locomotori sensibili per lesioni del midollo spinale (LME), ictus, neurodegenerazione, neuropatie periferiche e disturbi^{neuromuscolari 8,10}. Dal punto di vista terapeutico, supporta la valutazione longitudinale di interventi farmacologici o basati su dispositivi con potenziamento statistico potenziato dalla cinematica ad alta^{risoluzione 11}. L'architettura modulare consente un'integrazione fluida con piattaforme complementari, ad esempio elettromiogramma (EMG) o segnali cerebrali, facilitando la decodifica meccanicistica dei correlati neurali nel movimento degli arti inferiori.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali dell'Istituto di Ricerca sul Cervello di Pechino e hanno rispettato le Linee Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio. Non sono stati osservati eventi avversi correlati alla procedura.

1. Preparazione dell'attrezzatura

1. Attiva l'alimentatore del sistema del tapis roulant e seleziona il pulsante Controllo della Velocità sul touchscreen.
2. Lascia girare la cinghia a bassa velocità per 30 secondi per osservare se la cintura del tapis roulant devia.
3. Seleziona il pulsante Controllo Inclinazione , poi imposta l'inclinazione a 0°, clicca su Zero e conferma che il valore visualizzato coincida con la bolla di livello.
4. Entra nell'interfaccia Sospensioni , impicca un peso da 10 g e controlla se la lettura della tensione è vicina a 0,10 N.
5. Accendi l'Industrial Personal Computer (IPC) e inserisci il software di acquisizione e analisi video.
6. Crea una directory per l'esperimento della giornata, includendo informazioni come nome dell'esperimento, identificazione animale, gruppo sperimentale, velocità, inclinazione e percentuale di riduzione del peso.
7. Fissare la fotocamera industriale ad alta velocità (UC70, risoluzione: 1280X1024, frame rate: 60 fps), dotata di obiettivo manuale (f = 12 mm), su un profilo in alluminio. Posizionare l'obiettivo della fotocamera perpendicolarmente all'asse longitudinale del tapis roulant per catturare una visuale strettamente laterale, mantenendo una distanza di lavoro orizzontale di 15 cm dal piano della cintura del tapis roulant.
8. Posiziona l'obiettivo orizzontalmente usando un livello a bolla e assicurati che il busto del ratto occupi i 2/3 centrali della cornice. Regola la messa a fuoco e l'apertura finché le linee di scala sul righello posteriore (griglia di 1 cm) non sono chiaramente visibili.
9. Clicca su Anteprima per confermare che non ci sia traccia di sfondo e che la luminosità di sfondo sia uniforme. Se l'immagine è troppo scura, si utilizza un retroilluminazione a diodo a emissione di luce (LED) per aumentare la luminosità; Se sovraesposto, riduci il guadagno e restringi l'apertura di conseguenza.
10. Clicca su Inizia la registrazione per testare la qualità della registrazione dei dati. Clicca su Ferma la registrazione e imposta il percorso di archiviazione dei dati. Dopo aver completato i test delle attrezzature sopra elencate, iniziare i test sugli animali.

2. Preparazione animale e test di esecuzione

1. Trasferisci il ratto insieme alla sua gabbia originale nella stanza sperimentale e lascialo riposare per 10 minuti. Durante questo periodo, è permesso libero accesso a cibo e acqua.
2. Registra il peso corporeo usando una bilancia elettronica (con una precisione di 0,1 g). Includere ratti con pesi corporei corrispondenti (±10 g) per minimizzare gli effetti di confusione della dimensione corporea.
3. Se il colore del pelo delle zampe posteriori non contrasta sufficientemente con lo sfondo, usa un rasoio elettrico per rimuovere delicatamente una striscia di pelo larga 1 cm sul lato esterno della coscia e sul retro della zampa inferiore, al fine di migliorare la precisione del riconoscimento articolare.
4. Poi usa un nastro morbido per misurare la distanza in linea retta dall'anca alla caviglia (mm), che servirà da base per la successiva normalizzazione del passo.
5. Indossa i guanti, afferra il topo e avvolgi la fascia elastica del petto intorno all'ascella anteriore, fissandola alla slitta regolabile. Assicurati che la cinghia sia abbastanza larga da inserire un dito senza influenzare la respirazione dell'animale.
6. Ruota lentamente la maniglia del braccio della sospensione osservando il valore di tensione sullo schermo, aumentando gradualmente fino al rapporto di riduzione del peso bersaglio. Conferma che le zampe posteriori del ratto toccano ancora completamente il suolo.
7. Regola l'altezza della barra dell'impugnatura. Allenta la manopola superiore e posiziona la barra anteriore leggermente sotto la punta del naso del ratto quando sei in posizione verticale, assicurandoti che l'animale possa afferrarla facilmente senza dover inclinare eccessivamente la testa all'indietro o piegarsi.
8. Sullo schermo di controllo touch, imposta la velocità a 150 mm/s e l'inclinazione a 0°. Conduci una sessione di acclimatazione di 10 minuti per adattare l'animale al livello specifico di supporto del peso corporeo. Monitora il topo per eventuali segnali di stress, ad esempio congelamento, defecazione.
   1. Se il passo rimane irregolare (definito come [>3 interruzioni/min]), estendere la durata di incrementi di 2 minuti, fino a un massimo di 20 minuti.
9. L'acclimatamento è considerato efficace quando il ratto mantiene un'andatura continua e uniforme per almeno 60 secondi senza trascinare la zampa, e la coda pende naturalmente senza rigidità. Escludere gli animali che non soddisfano questi criteri dopo il massimo periodo di acclimatazione.
10. Inserisci i parametri necessari per l'esperimento formale. Inserisci sequenzialmente la velocità desiderata (qualsiasi valore tra 0 e 300 mm/s) e l'inclinazione (−30° a +30°) sul touchscreen, e seleziona la direzione della cinghia del tapis roulant.
11. Dopo aver avviato il tapis roulant, osserva la postura del ratto. Se si discosta dall'area centrale di 1/3, tocca delicatamente una volta la parete laterale destra con la nocca. La maggior parte degli animali corregge la propria posizione da sola. Se due correzioni consecutive non sono efficaci, riposiziona il ratto e registra nuovamente la prova.
12. Dopo la stabilizzazione, clicca su Inizia la registrazione e cattura continuamente almeno cinque cicli completi di camminata.
13. Alla fine di ogni prova, riduci immediatamente la velocità a 0, sganci la fascia toracica e riporta il ratto nella gabbia corrispondente.
14. Somministrare acqua durante il riposo, con almeno 3 minuti tra una prova e l'altra.
15. Registra almeno tre prove nelle stesse condizioni. Se un animale corre ininterrottamente per più di sei prove, aggiungi un riposo aggiuntivo di 2 minuti per prevenire una fatica cumulativa.
16. Effettuare un pre-allenamento per cinque giorni consecutivi prima dell'esperimento formale: camminare per 10 minuti al giorno a 150 mm/s, inclinazione di 0° e zero riduzione di peso, osservando l'andatura.

3. Estrazione dei dati dell'andatura

1. Innanzitutto, estrarre i segmenti contenenti l'andatura bersaglio, solitamente intorno ai 10 s, che dovrebbero includere almeno 10 cicli di camminata stabili e analizzabili.
2. Importare il file .mov nel software di analisi e registrare le informazioni individuali dei ratti, inclusi numero ID, gruppo e condizioni sperimentali.
   NOTA: Il sistema utilizza l'architettura YOLO-NAS Pose, una rete neurale all'avanguardia ottimizzata per la stima della pose ad alte prestazioni.
   Costruzione del dataset: Il modello è stato addestrato su un dataset robusto di 6.000 fotogrammi video. Questi fotogrammi venivano annotati manualmente con le coordinate di cinque articolazioni chiave degli arti posteriori (cresta iliaca, anca, ginocchio, caviglia e dita) utilizzando l'interfaccia grafica DeepLabCut per garantire una precisione accurata.
   Addestramento: La rete ha subito un transfer learning su una GPU NVIDIA RTX 3080 per adattare i pesi YOLO-NAS Pose alle caratteristiche specifiche dell'arto posteriore del ratto.
   Inizializzazione: Nel software, seleziona il modello pre-addestrato 'Rat_Hindlimb_YOLO_v1' e imposta la Soglia di Confidenza a 0,8 per escludere i punti chiave a bassa certezza.
   Durante la fase di analisi, il modello YOLO-NAS Pose elabora il flusso video fotogramma per fotogramma. A differenza dei metodi tradizionali di computer vision che si basano sulla sottrazione di background, questa architettura di deep learning localizza direttamente il rat e prevede le coordinate congiunte all'interno della bounding box.
   Post-elaborazione: L'algoritmo estrae le coordinate x e y dalle mappe di probabilità. Per mitigare il jitter ad alta frequenza, si applica un filtro mediano (dimensione della finestra: 3 fotogrammi) alle traiettorie grezze.
   Output: Il sistema si blocca con successo sulle cinque articolazioni target all'interno del fotogramma video, generando coordinate spaziali risolte nel tempo per l'intera sequenza di camminata. Questi dati vengono esportati automaticamente come file .csv per il calcolo cinematico. Utilizzando il righello del tabellone (griglia da 1 cm) catturato simultaneamente, il sistema stabilisce una relazione di conversione, calcola automaticamente il fattore di scala e converte in batch le coordinate dei pixel in millimetri.
3. Esporta le coordinate di posizione spaziale di ogni giunzione nel tempo come file .csv per il calcolo successivo dell'indice.
   NOTA: Il software calcola automaticamente la lunghezza del passo, la frequenza dei passi e l'altezza dei piedi, ed esporta i cambiamenti nella posizione spaziale e negli angoli delle cinque articolazioni degli arti inferiori nel tempo. In base all'altezza delle dita dei piedi, il software divide automaticamente ogni passo in fase di swing e fase di posizione, e calcola la proporzione tra la fase di swing e la fase di posizione all'interno di ogni ciclo di camminata.

4. Confronti cinematici intergruppi

1. Normalizzare ogni ciclo di camminata all'interno del gruppo da 0% (contatto con i piedi) al 100% (di nuovo stesso contatto con i piedi) per unificare le diverse durate dei cicli, facilitando la media e il confronto tra i gruppi stessi. I tipi di immagini che possono essere generate per illustrare la dinamica del passo sono forniti nel Supplementary File 1.

5. Analisi statistica

1. Esegui tutte le analisi statistiche utilizzando il software GraphPad Prism.
2. Verifica la normalità della distribuzione dei dati utilizzando il test di Shapiro-Wilk.
3. Per i confronti dimostrativi di validazione cinematica e indice di massa corporea (BMI), presentare i dati come media ± SEM.
4. Valutare le differenze tra le due condizioni sperimentali utilizzando un test t di Student non accoppiato.
5. Definire le soglie di significatività statistica come *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,005. Si noti che in questo studio pilota di validazione è stato incluso un totale di n = 3 ratti.

6. Incorporamento del modulo elettrofisiologico

1. Dopo aver completato la modellazione animale, impiantare il dispositivo di registrazione elettrofisiologica.
2. Per la registrazione neurale, posizionare elettrodi sulla superficie del cranio, nello spazio epidurale o nella corteccia cerebrale per registrare i segnali cerebrali.
3. Per la registrazione del midollo spinale, inserire elettrodi di registrazione nello spazio epidurale del forame intervertebrale.
4. Per la registrazione EMG, infila fili d'argento bipolari nei muscoli per registrare l'attività elettrica muscolare.
5. Dopo l'impianto, lascia all'animale recuperare per 5-7 giorni, controllando ogni giorno la ferita e il passo per assicurarti che non ci siano segni di infezione o dolore prima di procedere con l'esperimento sul tapis roulant.
6. Completa l'attrezzatura e le preparazioni animali come descritto sopra.
7. Sincronizza la raccolta di parametri elettrofisiologici e video di movimento, assicurandosi che i dati elettrofisiologici e video condividano lo stesso timestamp.
8. Dopo la raccolta dei dati, allineare i segnali neurali con i fotogrammi video durante l'analisi per osservare intuitivamente i modelli elettrofisiologici nelle diverse fasi del ciclo dell'andatura, fornendo prove dirette per l'esplorazione del meccanismo di accoppiamento centrale-periferico.

Results

Il diagramma schematico e la foto reale della struttura del sistema del tapis roulant sono mostrati rispettivamente nelle Figure 1A,B. Il dispositivo è in grado di ottenere immagini laterali ad alto contrasto senza marcatori. Il tapis roulant supporta regolazioni per velocità, inclinazione, direzione e riduzione del peso, ed è dotato di un pannello di controllo numerico. L'interfaccia software che accompagna include un'interfaccia di monitor...

Discussion

Questo protocollo delinea un sistema di analisi dell'andatura basato su tapis roulant per i ratti e le sue procedure operative, fornendo uno strumento di valutazione multidimensionale e oggettiva per la ricerca comportamentale neuromuscolare. Come dimostrato nei confronti intergruppi dei parametri di camminata tra LM e ratti sani nello studio esemplare, il sistema acquisisce coordinate di movimento spaziale grezze degli arti inferiori dei soggetti tramite videografia continua ad alta fre...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annotazione AI e Passo Software per acquisizione	Shanghai Clinical Technology Co., Ltd.	MouseAI	MouseAI è il software integrato di analisi per il tapis roulant MOVEMETRICS, unificando la registrazione video, la registrazione dei metadati e l'analisi automatica dell'andatura in un unico flusso di lavoro.
Impatto meccanico	RWD Life Science, Shenzhen, Cina
Sistema di registrazione elettrofisiologica multicanale	Kedou (suzhou) Brain - Computer Technology Co.	KedouBC RHD128A	KedouBC RHD128A è un sistema compatto di acquisizione elettrofisiologica in vivo a 128 canali, a 128 canali , progettato per la registrazione neurale ad alta risoluzione in animali da laboratorio di piccole a grandi dimensioni. Integrando headstage leggeri, plug-and-play (&le), conversione A/D a 16 bit e amplificatori programmabili, cattura EEG, ECoG, LFP, spikes, segnali EMG ed ECG da 0,1 Hz a 30 kHz con ≤ 2.4 & micro; Rumore del sistema V e > 10 GΩ impedenza di ingresso. RHD128A fornisce dati neurali robusti e scalabili per l'utente per accelerare gli studi sulle interfacce cervello-macchina, neurodegenerazione e riabilitazione.
Tapis roulant	Shanghai Clinical Technology Co., Ltd.	MOVEMETRICHE	MOVEMETRICS è un tapis roulant strumentato ad alta precisione per analisi avanzata dell'andatura dei roditori.