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Articolo di ricerca
* These authors contributed equally
Questo studio identifica una firma da 10 LNA legata allo stress ossidativo nel carcinoma a cellule squamose polmonari (LUSC) utilizzando dati dell'Atlante del Genoma del Cancro. Sebbene la validazione abbia mostrato prestazioni predittive cliniche limitate, la firma ha differenziato i modelli del microambiente immunitario e i saghi in vitro hanno supportato LINC01615 come candidato correlato alla migrazione-invasione per ulteriori indagini meccanicistiche.
L'RNA non codificante a catena lunga (lncRNA) influenza significativamente il valore prognostico del carcinoma squamoso polmonare (LUSC) e l'infiltrazione immunitaria. Questo studio mirava a dimostrare come gli LNA correlati allo stress ossidativo influenzino il carcinoma a cellule squamose polmonari (SCC). Il dataset del Cancer Genome Atlas (TCGA) ha raccolto informazioni sul trascrittoma e dati clinici correlati per LUSC. Per costruire un modello prognostico, sono stati identificati 10 geni correlati al prognostico utilizzando una serie di analisi bioinformatiche che hanno confrontato l'espressione aberrante del gene OS nei tumori e nei tessuti sani, nonché la sua associazione con la malignità. I soggetti sono stati stratificati in gruppi ad alto e basso rischio in base al punteggio mediano di rischio derivato dalla firma dei 10 geni. Sebbene il modello matematico di rischio abbia mostrato prestazioni predittive indipendenti limitate nella coorte di validazione (AUC ~ 0,5), le valutazioni funzionali e immunologiche hanno rivelato differenze significative nel microambiente tumorale (TME) tra gli strati di rischio. In particolare, i pazienti ad alto rischio hanno mostrato profili di infiltrazione immunitaria distinti e punteggi immunologici alterati rispetto ai loro omologhi a basso rischio. Pertanto, invece di fungere da strumento diretto di previsione clinica, questa firma di lncRNA legata allo stress ossidativo fornisce preziose informazioni biologiche sul panorama immunitario della LUSC e evidenzia potenziali bersagli terapeutici per ulteriori indagini meccanicistiche.
Il cancro ai polmoni mostra la più alta incidenza e mortalità globale tra leneoplasie 1. All'interno delle varianti istologiche del cancro polmonare non a piccole cellule (NSCLC), il carcinoma a cellule squamose polmonari (LUSC) è un sottotipo predominante, spesso correlato a esiti clinici sfavorevoli e a una mancanza di trattamenti mirati altamente efficaci rispetto all'adenocarcinomapolmonare 2. Sebbene gli approcci terapeutici primari comprendano interventi chirurgici, radioterapia e chemioterapia, i pazienti con LUSC avanzata spesso mostrano resistenzaterapeutica 3. Di conseguenza, è urgente identificare biomarcatori molecolari robusti per migliorare la stratificazione prognostica e guidare strategie terapeutiche esplorative perLUSC 4.
Lo stress ossidativo, caratterizzato dall'accumulo patologico di specie reattive di ossigeno (ROS), svolge un ruolo fondamentale nell'inizio, nella crescita e nella metastasi del tumore. In assenza di meccanismi efficienti di eliminazione ROS, livelli elevati di ROS inducono danni al DNA e genotossicità, portando infine a varie alterazioni genomiche che contribuiscono allo sviluppo del cancro. In particolare, gli studi hanno costantemente dimostrato un aumento dei livelli di ROS e dello stress ossidativo, in particolare nella patogenesi del cancropolmonare 5,6. Ricerche recenti hanno ulteriormente evidenziato che cluster di geni collegati allo stress ossidativo possono funzionare come biomarcatori prognostici prospettici nelle neoplasiepolmonari 7. Gli RNA non codificanti lunghi (lncRNA) sono emersi come regolatori cruciali dell'espressione genica e rappresentano promettenti biomarcatori prognostici in varie neoplasie. Sebbene un precedente studionotevole abbia stabilito con successo un modello prognostico degli lncRNA legato allo stress ossidativo per l'adenocarcinoma polmonare (LUAD), il paesaggio prognostico specifico e le implicazioni immunitarie di tali lncRNA nel LUSC rimangono in gran parte inesplorati.
In questa indagine, gli autori hanno analizzato sistematicamente i dataset TCGA per costruire una nuova firma di lncRNA legata allo stress ossidativo specificamente adattata per LUSC. Inoltre, a differenza delle analisi puramente bioinformatiche, il presente studio incorpora la validazione sperimentale in vitro per confermare il ruolo funzionale biologico degli lncRNA identificati chiave (ad esempio, Linc01615). Piuttosto che rivendicare un'applicabilità clinica immediata per decisioni diagnostiche e terapeutiche, questa ricerca mira principalmente a esplorare i potenziali meccanismi dello stress ossidativo nel LUSC e la sua correlazione con il microambiente immunitario tumorale. Questi risultati sono destinati a fornire preziose intuizioni biologiche e a mettere in evidenza potenziali obiettivi terapeutici per future indagini meccanicistiche.
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Acquisizione e preelaborazione dei dati
Tutti i dati analizzati in questo studio sono stati ottenuti dal database TCGA accessibile al pubblico indicato nella Tabella dei Materiali. Questo studio ha rispettato rigorosamente la Genomic Data Sharing Policy dei National Institutes of Health (NIH) e le linee guida di pubblicazione fornite dalla TCGA. Poiché i dataset consistono in dati clinici e multi-omici, de-identificati, pubblicamente disponibili, questo studio è stato esente da ulteriori approvazioni da parte dell'Institutional Review Board (IRB). I dati trascrivertici e le relative informazioni cliniche per LUSC sono stati scaricati dal database Cancer Genome Atlas (TCGA). Inizialmente, la coorte comprendeva 551 campioni (502 tumorali e 49 normali). Per garantire la robustezza di questo modello prognostico, i pazienti privi di dati completi di sopravvivenza complessiva (OS), dello stato di sopravvivenza o di caratteristiche cliniche essenziali sono stati esclusi dall'analisi di sopravvivenza a valle. A seguito di questo rigoroso processo di filtraggio, è stata stabilita una coorte analitica finale di 470 pazienti con LUSC. Questi 470 pazienti sono stati successivamente divisi casualmente in un set di addestramento (n = 235) e un set di test (n = 235) per la costruzione e la validazione del modello di rischio. Un totale di 792 geni correlati allo stress ossidativo sono stati raccolti tramite il database GeneCards, elencato nella Tabella dei Materiali, utilizzando un criterio di inclusione con punteggio di rilevanza ≥ 7. Il pacchetto limma (versione 3.66.0) è stato utilizzato per lo screening dei geni di stress ossidativo espressi differenzialmente. I grafici dei vulcani venivano prodotti utilizzando il pacchetto ggplot2 (versione 4.0.2). Tra il gruppo di addestramento e quello di test, non vi sono state variazioni apprezzabili nelle caratteristiche cliniche (p > 0,05). Il set di addestramento veniva utilizzato per la costruzione del modello, mentre il set di test per la validazione interna.
Costruzione e verifica del modello di rischio
Per identificare gli LNCa associati allo stress ossidativo, è stata condotta un'analisi di coespressione di Pearson. Gli autori hanno valutato la correlazione tra i profili di espressione dei geni identificati differenzialmente espressi allo stress ossidativo e di tutti gli LNRNA annotati all'interno del dataset TCGA-LUSC. I criteri di correlazione per la selezione degli LNCRNA co-espressi sono stati fissati a un coefficiente di correlazione |R| > 0,4 e un p-value < 0,001. Sulla base di queste soglie, sono stati derivati ed estratti in totale 6.088 candidati LNRNA correlati allo stress ossidativo. Successivamente, questi 6.088 candidati lncRNA sono stati valutati tramite regressione LASSO e approcci analitici complementari per costruire il modello di rischio prognostico. Utilizzando i dati elaborati, i pazienti partecipanti sono stati suddivisi in strati ad alto e basso rischio.
Fattori indipendenti e curve ROC
Sono stati utilizzati modelli di regressione di Cox univariata e multivariata per identificare variabili prognostiche indipendenti. In particolare, per controllare il tasso di errore familiare durante le analisi di regressione di Cox univariate multiple (n = 236 test), è stata applicata la correzione di Bonferroni, fissando la soglia di significanza rigorosamente aggiustata a p < 0,00021 (calcolata come 0,05 / 236).
Analisi della sopravvivenza e analisi dei componenti principali
Il pacchetto di sopravvivenza (versione 3.8-6) è stato utilizzato per calcolare i tassi complessivi di sopravvivenza (OS), mentre l'analisi delle componenti principali (PCA) è stata utilizzata per valutare la robustezza del modello di rischio.
Nomogramma
L'indice di adattamento è stato valutato utilizzando il pacchetto rms in R per verificare l'affidabilità del nomogramma. Il carico mutazionale tumorale (TMB) è stato valutato e visualizzato utilizzando il pacchetto maftools (versione 2.22.0). Sono stati utilizzati algoritmi, incluso ssGSEA, per rilevare l'infiltrazione immunitaria. Inoltre, il pacchetto ggpubr (versione 0.6.3) è stato utilizzato per confrontare i checkpoint immunitari tra gruppi di rischio. L'algoritmo ESTIMATE è stato utilizzato per caratterizzare il microambiente tumorale (TME).
Analisi funzionale
Il pacchetto clusterProfiler (versione 4.14.6) in R veniva utilizzato per l'analisi dell'arricchimento. Per esplorare ulteriormente le vie funzionali, è stata effettuata un'analisi GSEA. Utilizzando Cytoscape, è stata creata una rete di co-espressione per l'osservazione.
Metodi sperimentali
Condizioni della coltura cellulare e raggruppamento
La linea cellulare NCI-H520 del carcinoma squamoso polmonare umano (RRID: CVCL_1566; elencata nella Tabella dei Materiali) è stata coltivata in mezzo RPMI-1640 integrato con siero fetale bovino al 10% (v/v) e 1% di penicillina-estreptomicina. Le cellule in fase logarithmithmica sono state seminate in piastre di coltura a 6 pozzi. Dopo l'aderenza con successo, le cellule sono state distribuite casualmente in tre gruppi sperimentali distinti: un gruppo di controllo vuoto mantenuto in condizioni di coltura standard, un gruppo di controllo negativo (si-NC) trasfetato con siRNA non targeting, e un gruppo sperimentale di knockdown (si-LINC01615) trasfetato con siRNA specifico per LINC01615.
Transfezione cellulare
I reagenti si-LINC01615 e si-NC furono scongelati sul ghiaccio. Per la preparazione del complesso di trasfezione, 95 μL di mezzo RPMI-1640 senza siero sono stati pipettati in tubi centrifughe sterili, seguiti dall'aggiunta sequenziale di 3 μg del rispettivo siRNA e 5 μL del reagente di trasfezione Lipo3000. La stessa procedura è stata applicata sia per il grupposi LINC01615 che per quello siNC. Le soluzioni sono state delicatamente miscelate e incubate a temperatura ambiente per 5 minuti per facilitare la formazione complessa, ottenendo un volume totale di circa 200 μL per provetta. Successivamente, questa miscela fu distribuita uniformemente nei pozzi di coltura designati contenenti 800 μL di mezzo basale RPMI-1640. Dopo un periodo di incubazione di 6 ore a 37 °C, il mezzo di trasfezione veniva atmospato con cura e sostituito con un mezzo di coltura fresco e completo.
Saggio di guarigione delle ferite (scratch)
Per il saggio di guarigione, cellule NCI-H520 in crescita logaritmica (RRID: CVCL_1566) sono state seminate in piastre di coltura a 6 pozzi a una densità di 5,6 × 10cellule da 5 per pozzo. Raggiungendo una confluenza del 95–100%, veniva creata artificialmente una ferita lineare graffiando verticalmente il monostrato cellulare attraverso il centro del pozzo usando una punta sterile di pipetta da 200 μL. I pozzi sono stati successivamente lavati tre volte con PBS per rimuovere cellule staccate e detriti cellulari, e poi incubati in un mezzo RPMI-1640 privo di siero. Immagini delle aree ferite identiche furono catturate alle ore 0, 24 e 48 utilizzando un microscopio invertito. L'area di guarigione della ferita è stata quantificata misurando la distanza dello spazio usando ImageJ (RRID: SCR_003070; elencata nella Tabella dei Materiali), e la velocità di migrazione è stata calcolata rispetto all'area iniziale della ferita a 0 h.
Migrazione transwell e saghi di invasione
Le capacità di migrazione e invasione cellulare sono state valutate utilizzando camere Transwell a 24 pozzi dotate di inserti a membrana in policarbonato di dimensioni 8,0 μm elencati nella Tabella dei Materiali. Per il test d'invasione, le camere apicali sono state pre-rivestite con 50 μL di Matrigel (diluito 1:8 in mezzo senza siero; elencato nella Tabella dei Materiali) e incubate a 37 °C per 2 ore per polimerizzarsi, mentre il saggio di migrazione utilizzava inserti non rivestiti. Dopo la trasfezione cellulare e un periodo di carestia sirica di 24 ore, le cellule NCI-H520 sono state prelevate, risospese in mezzo RPMI-1640 senza siero e seminate nelle camere apicali a una densità di 1,8 × 105 cellule per pozzo in 200 μL. Le camere basale erano riempite con 600 μL di mezzo RPMI-1640 integrato con FBS al 10% come chemoattragente. Dopo un'incubazione di 48 ore a 37 °C con il 5% di CO₂, gli inserti sono stati rimossi e lavati tre volte con PBS. Le cellule rimaste sulla superficie apicale della membrana venivano delicatamente rimosse con un cotton fioc umido. Le cellule che avevano migrato o invaso la superficie basolaterale sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 20 minuti e colorate con la soluzione di Giemsa elencata nella Tabella dei Materiali per 30 minuti a temperatura ambiente. Le cellule migrate e invase sono state visualizzate e enumerate su tre campi ottici selezionati casualmente per inserto utilizzando un microscopio rovesciato a un ingrandimento di 40x.
Analisi statistica
Tutte le analisi statistiche e le visualizzazioni dei dati sono state eseguite utilizzando il software R (versione 4.1.2; RRID: SCR_001905; elencati nella Tabella dei Materiali). I numeri di versione specifici per tutti i pacchetti R utilizzati in questo studio sono stati esplicitamente dettagliati nelle rispettive sottosezioni metodologiche. Un valore significativo era convenzionalmente definito come p < 0,05 salvo diversa dichiarazione. Quando sono stati effettuati confronti multipli (ad esempio, le regressioni di Cox univariate multiple), il metodo di Bonferroni è stato applicato rigorosamente per mantenere il tasso di errore familiare (FWER), con la soglia esatta aggiustata (ad esempio, p < 0,00021) dettagliata nella rispettiva sottosezione metodologica. I dati quantitativi in vitro sono stati espressi come deviazione media ± standard e analizzati utilizzando il test t di Student o ANOVA unidirezionale secondo le opportunità.
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Identificazione di geni espressi differenzialmente per lo stress ossidativo
Il flusso di lavoro è mostrato nella Figura 1. Le caratteristiche cliniche della coorte analitica finale composta da 470 pazienti LUSC sono dettagliate nella Tabella 1. Basandosi sulla soglia definita di un punteggio di rilevanza ≥ 7, gli autori hanno recuperato un totale di 792 geni correlati allo stress ossidativo dal da...
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Il carcinoma a cellule squamose polmonari (LUSC) è un sottotipo istologico predominante e altamente aggressivo di cancro polmonare non a piccole cellule, spesso caratterizzato da tassi di sopravvivenza pessimi e resistenza alle modalità terapeuticheconvenzionali 8,9. Le evidenze emergenti sottolineano lo stress ossidativo come un fattore chiave nella patogenesi e nella progressione di varie neoplasie. L'accumulo patologico di spe...
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Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto. Durante la preparazione dei manoscritti non sono stati utilizzati strumenti di intelligenza artificiale (IA) o tecnologie assistite dall'IA; Tutti i contenuti scientifici, le analisi, i dati grezzi e le conclusioni sono stati generati, revisionati e approvati indipendentemente dagli autori.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant No. 8200430). Ringraziamo sinceramente i contributori e le istituzioni coinvolte, tra cui l'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Hunan e l'Ospedale Affiliato dell'Accademia di Medicina Tradizionale Cinese di Hunan, per le loro risorse e il loro supporto. Esprimiamo inoltre la nostra gratitudine a tutti i ricercatori e ai partecipanti che hanno contribuito a questo studio.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime | P0099 | Usato per fissare le cellule |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | Usato per la creazione di reti di co-espressione |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Concentrazione finale 10% (v/v) |
| GeneCards database | GeneCards Human Gene Database | https://www.genecards.org/ | Screening di geni correlati allo stress ossidativo |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldrich | GS500 | Usato per la colorazione di cellule migrate/invasive |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | Usato per la quantificazione del gap della ferita |
| Lipo3000 Transfection Reagent | GLPBIO | GK20006 | Usato per la trasfezione di siRNA |
| Matrigel | Corning | 356234 | Diluito 1:8 in mezzo privo di siero |
| NCI-H520 human lung squamous cell carcinoma | ATCC | HTB-182 | Usato per i saggi di validazione in vitro |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Gibco | 10010-023 | Usato per il lavaggio delle cellule |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140-122 | Integratore antibiotico per la coltura cellulare |
| R software (v4.1.2) | R Foundation | https://www.r-project.org/ | Analisi statistica e visualizzazione |
| RPMI-1640 Medium | Gibco | 11875-093 | Mezzo di coltura cellulare |
| The Cancer Genome Atlas (TCGA) | Genomic Data Commons | https://portal.gdc.cancer.gov/ | Fonte di dati trascrittomici e clinici |
| Transwell Chambers (8.0 μm) | Corning | 3422 | Usato per i saggi di migrazione e invasione |