Method Article

Microdissezione da cattura laser del tessuto epatico di topo fissato con paraformaldeide per l'analisi dell'RNA

DOI:

10.3791/69814

⸱

April 17th, 2026

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Center, Southern Medical University, 2School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, 3School of Pharmaceutical Science, Southern Medical University, 4Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co., Ltd., 5The Seventh Affiliated Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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Questo protocollo descrive un metodo per isolare l'RNA da regioni istologiche definite di tessuto epatico di topo inserito nel composto di paraformaldeide e composto Optimal Cutting Temperature, utilizzando microdissezione a cattura laser, consentendo un'analisi mirata dell'espressione genica a valle.

Abstract

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La microdissezione a cattura laser (LCM) fornisce accesso spaziale a specifiche popolazioni cellulari all'interno di tessuti complessi tramite visualizzazione e isolamento in situ . Per consentire l'analisi trascrivomica delle regioni istologicamente definite in tessuto fisso, viene presentato un protocollo dettagliato di LCM per l'estrazione di RNA da sezioni di fegato di topo inserite in composto di paraformaldeide (PFA), Temperatura di Taglio Ottimale (OCT). Il protocollo dettaglia l'identificazione e la raccolta di campioni su scala microscopica (circa 1.000 cellule) attraverso un flusso di lavoro che comprende fissazione tissutale, disidratazione del saccarosio, inserimento OCT, criosezionazione, colorazione dell'ematossilina e cattura laser di aree istologiche mirate. Con questo metodo si ottenne un RNA ad alta purezza (A260/A280: 1.9-2.1). Il numero di integrità dell'RNA (RIN) era 6,7 ± 0,9, riflettendo la frammentazione attesa associata alla fissazione della PFA. Tuttavia, la PCR quantitativa per β-actin ha prodotto valori di Ct di 17-19, e il sequenziamento dell'RNA eseguito tramite preparazione di librerie ottimizzata per la frammentazione ha generato letture di alta qualità, con il >90% delle basi che hanno rispettato le soglie Q20 e Q30, confermando che l'RNA è adatto per analisi sensibili a valle. Pertanto, questo protocollo consente un'analisi dell'espressione genica risolta e mirata spazialmente, fornendo RNA di purezza e integrità definite provenienti da specifiche regioni istologiche del tessuto epatico fissato con PFA.

Introduction

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L'acquisizione accurata di profili di espressione genica risolti spazialmente è fondamentale per comprendere l'eterogeneità tissutale in ambito sanitario e malattico. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) offre un'alta risoluzionecellulare 1,2, ma perde il contesto spaziale nativo e può alterare i profili trascrizionali durante la dissociazionetissutale 3,4. Per i tipi cellulari privi di marcatori specifici identificati pubblicamente, ottenere popolazioni pure tramite selezione basata su immunofluorescenza o isolamento immunomagnetico rimane difficile 5,6. Le tecnologie di trascritomica spaziale come Visium e GeoMx permettono la cattura in situ di dati di espressione genica ad alto rendimento, ma la loro risoluzione spaziale è limitata a livello di singola cellula osubcellulare 7,8. Al contrario, la trascritomica spaziale basata sull'imaging può raggiungere una risoluzione a livello nanometrico ma ha un throughput limitato di rilevamentogenico 9. Questo evidenzia una lacuna persistente nell'analisi guidata da ipotesi di specifiche regioni morfologiche.

La microdissezione a cattura laser (LCM) consente la selezione e l'isolamento guidati al microscopio di cellule specifiche da sezioni tissutali o colture cellulari vive basate su un fenotipo osservabile. Questo approccio preserva la struttura cellulare e le informazionispaziali 10. Questa tecnica è stata ampiamente applicata nella ricerca sulla malattia epatica per analisi a valle. Ad esempio, la LCM è stata utilizzata per raccogliere cellule epiteliali biliari da biopsie epatiche al fine di chiarirne il ruolo immunoregolatore nella colangite biliareprimaria 11. Inoltre, è stato utilizzato per isolare tessuto positivo γ-glutamil transferasi (GGT) da modelli sperimentali per confermare l'espressione genica Ggt1 specifica al sito 12. Ma questi studi si sono concentrati principalmente su tessuti freschi congelati, che spesso mancano di annotazioni cliniche o di follow-up a lungotermine 13. Al contrario, i tessuti chimicamente fissati offrono vantaggi per la diagnosiistopatologica 14. Sebbene il sequenziamento basato su LCM sull'RNA (RNA-Seq) sia stato applicato con successo a campioni di fegato archiviati, su larga scala fissati in formalina e incorporati inparaffina (FFPE) 15. Tuttavia, manca un protocollo robusto di profilazione dell'espressione genica basato su LCM, specifico per campioni su scala microscopica provenienti da tessuti epatici incorporati con composto con paraformaldeide (PFA) e composto a temperatura ottimale di taglio (OCT).

Per rispondere a questa esigenza insoddisfatta, è stato ottimizzato un protocollo completo utilizzando criosezioni fisse con PFA e incorporate in OCT. Questo protocollo affronta i limiti dei flussi di lavoro FFPE (ad esempio, processi prolungati e sostanze chimiche aggressive) per applicazioni sensibiliLCM-RNA 16. Al contrario, il processo di fissazione e incorporamento per i campioni fissi in PFA e incorporati in OCT è relativamente più semplice e flessibile, consentendo una rapida preparazione di sezioni di alta qualità che preservano sia l'integrità dell'RNA sia la morfologia tissutale. Inoltre, questo protocollo viene eseguito utilizzando un sistema LCM basato su laser a ultravioletti (UV). Rispetto ai sistemi a infrarossi, l'UV-LCM offre una risoluzione di taglio più fine e consente la raccolta diretta e senza contatto dei campioni, minimizzando la contaminazione e rendendola adatta all'isolamento preciso di regioni in microscala da architetture tissutalicomplesse 17,18. Pertanto, il valore operativo di questo protocollo risiede nella sua capacità di effettuare la cattura morfologica di regioni su scala microscopica (~1.000 cellule) da sezioni epatiche fissate con PFA. Produce RNA adatto all'analisi mirata dell'espressione genica, permettendo una correlazione diretta tra caratteristiche istopatologiche e profili trascrittomici locali.

Qui descriviamo un protocollo per la microdissezione a cattura laser di tessuto in scala microscopica (~1.000 cellule) da sezioni di fegato di topo fissate in PFA e incorporate in OCT, seguito dall'estrazione di RNA e dall'analisi a valle tramite PCR e sequenziamento di RNA a trascrizione inversa quantitativa. Queste procedure possono essere completate entro cinque giorni.

Per guidare i lettori nella valutazione dell'applicabilità di questo protocollo, sono riassunti di seguito l'ambito chiave e le limitazioni. Questo protocollo è specificamente ottimizzato per il campionamento guidato da ipotesi e morfologica, guidato da ipotesi, di specifiche regioni istologiche da tessuti fissi in PFA e incorporati in OCT, con applicazione primaria nel fegato di topo. È adatta ai ricercatori che devono correlare dati trascritomici spazialmente risolti con caratteristiche istopatologiche precise conservate in campioni fissi. Il flusso di lavoro è particolarmente prezioso quando si lavora con tessuti fissi archiviati o clinicamente annotati quando non sono disponibili campioni freschi congelati. Tuttavia, questo protocollo non è ideale per studi che richiedono RNA ad alta integrità e non frammentato (ad esempio, numero di integrità dell'RNA (RIN) > 8), poiché la frammentazione intrinseca dovuta alla fissazione chimica ne limita l'uso in applicazioni che dipendono da trascritti a lunghezza intera.

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Protocol

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Tutte le procedure per la gestione e la cura degli animali sono state eseguite secondo le linee guida etiche e approvate dal Comitato Etico degli Animali della Southern Medical University. Il metodo descritto utilizzava topi maschi adulti C57BL/6J ed è stato mantenuto con una dieta ricca di grassi, zucchero e carente di colina per modellare la steatoepatite metabolica associata (MASH). Prima del prelievo del tessuto epatico, gli animali venivano soppressi per decapitazione.

1. Preparazione del campione fissato con PFA

  1. Fissare campioni freschi di tessuto epatico (singoli lobi, spessore di 5 mm o meno) in 30 mL di PFA freddo al 4% (appena preparato) a 4 °C per 24 ore.
    NOTA: Si raccomanda perfondere il fegato con ×soluzione salina tamponata fosfato (PBS, 1×, tipicamente composta da 137 mM di NaCl, 2,7 mM di KCl, 10 mM di Na₂HPO₄ e 1,8 mM di KH₂PO₄, pH 7,4) per 5 minuti, seguita da fissazione per perfusione con PFA al 4% per 5 minuti. In alternativa, il tessuto può essere fissato anche in una soluzione al 10% di formalina.
    ATTENZIONE: Il fissatore PFA è tossico. Tutti i rifiuti PFA devono essere raccolti in un contenitore designato e correttamente etichettato, in conformità con le normative istituzionali e locali.
  2. Lava i campioni di tessuto fissi 3× volte per 5 minuti con una soluzione PBS 1× senza RNasi.
  3. Inserire il tessuto epatico fisso in un tubo da 50 mL riempito con 50 mL di saccarosio al 30% (appena preparato in PBS sterile 1×). Mantieni i campioni a 4 °C per 10-12 ore.
  4. Rimuovi i campioni di tessuto dalla soluzione di saccarosio. Rifilare i campioni per ottenere blocchi facili da maneggiare (circa 5 mm × 3 mm × 5 mm), poi incorporare i campioni in un cryomold (7 mm × 7 mm × 5 mm) contenente composto OCT.
    NOTA: Regolare l'orientamento del tessuto con le pinze se necessario.
  5. Aggiungi il composto OCT sopra per coprire completamente i campioni di tessuto, poi posiziona immediatamente il blocco tissutale incorporato in OCT su azoto liquido o ghiaccio secco per congelare rapidamente il composto OCT e formare un blocco solido. Questo rapido congelamento è essenziale per ottenere criosezioni di alta qualità.
    ATTENZIONE: Indossa guanti resistenti alla criogenia per proteggere le mani durante la maneggiatura di materiali criogenici.
  6. Posizionare i blocchi incorporati in OCT a -80 °C fino alla criosezionazione.

2. Criosezionamento per microdissezione a cattura laser

  1. Esponi le lamine di polietilenaftalato (PEN) alla luce UV per 30 minuti, poi spalma le vetrine con 0,1 mg/mL di poli-L-lisina, seguita da asciugare all'aria. Poi, sigilla i bordi della lama a membrana PEN con un mezzo di montaggio neutro.
    NOTA: L'irraggiamento UV e il trattamento con poli-L-lisina delle vetrine a membrana PEN possono migliorare l'adesione dei campioni di tessuto alle vetrine della membrana PEN. Sigillare il perimetro con un mezzo di montaggio neutro previene l'infiltrazione d'acqua o la formazione di bolle sotto la membrana, cosa fondamentale per mantenere l'efficienza del LCM.
    ATTENZIONE: Proteggi pelle e occhi dalla luce UV. Indossa occhiali protettivi UV o una visiera (omologata per la protezione UV), oltre a camice da laboratorio, guanti in nitrilo e maniche lunghe per coprire la pelle esposta.
  2. Pulisce tutte le superfici accessibili del criostato e di tutti gli strumenti con un agente di decontaminazione RNasi, e pulisci la spazzola con etanolo al 75%.
    ATTENZIONE: Smaltire le salviette e le soluzioni etanoliche usate in conformità con i protocolli locali di salute e sicurezza ambientale istituzionale.
  3. Lascia che lo strumento raggiunga e si stabilizzi a −20 °C.
  4. Preleva i campioni di fegato da -80 °C e inseriscili nel criostato per almeno 15 minuti.
  5. Applicare uno strato sottile (2-3 mm) di composto OCT sulla superficie della fase del campione. Posiziona la fase del campione su una mensola di congelamento rapido (o nella camera criostatica) per pre-solidificare lo strato OCT.
  6. Applica una piccola quantità di OCT sullo strato OCT pre-solidificato nella fase del campione. Recupera il blocco tissutale equilibrato (dal passo 2.4) e posiziona immediatamente il blocco orizzontalmente su questo OCT, tenendolo fermo per 10-15 secondi per permettere il congelamento parziale e l'adesione. Una volta fissato, montare lo stadio del campione (con il blocco di tessuto attaccato) sulla testa del campione criostato.
  7. Inserisci con cura la lama tra le piastre di serraggio e le piastre posteriori da un lato del criostato, poi stringi la leva di serraggio.
  8. Regola lo spessore del criostato a 10 μm.
    NOTA: Regolare lo spessore della fetta secondo necessità per il tessuto, ma mantenere lo spessore tra 5-15 μm19.
  9. Tagliare e montare le sezioni direttamente sulle lamine a membrana PEN pretrattate all'interno della camera criostatica mantenute a -20 °C.
    NOTA: Ogni vetrino di membrana PEN può ospitare 6-8 sezioni di tessuto. Si raccomanda che l'intero processo di suddivisione venga completato entro 1 ora. Limitare il tempo di sezionamento riduce l'esposizione dei tessuti alle condizioni ambientali, riducendo così i rischi di degradazione dell'RNA, disidratazione tissutale e artefatti morfologici, fondamentali per preservare la qualità dell'RNA e l'integrità istologica per la LCM e l'analisi a valle.

3. Colorazione con ematossilina per microdissezione a cattura laser

  1. Scongelare i vetri a temperatura ambiente (RT) per 20 minuti prima dell'uso.
  2. Lava le vetrine con PBS 1× senza RNasi (3 volte, 10 secondi ciascuna).
  3. Immergi le vetrine tissutali nella soluzione filtrata di ematossilina di Mayer (composta da 1,0 g/L di ematossilina, 0,2 g/L di iodio di sodio, 50 g/L di solfato di alluminio ammonio dodecaidrato, 50 g/L di cloral idrato e 1,0 g/L di acido citrico) per 5-10 secondi.
    NOTA: Far passare la soluzione di lavoro ematossilina attraverso una membrana filtrante a siringa da 0,22 μm prima della colorazione.
  4. Lavare le vetri con acqua senza RNasi (3 volte, 10 secondi ciascuna) per rimuovere la soluzione residua di ematossilina.
  5. Valuta la qualità delle colorazioni al microscopio.
    NOTA: I nuclei ottimalmente colorati dovrebbero apparire nitidamente blu-viola su uno sfondo limpido. Una colorazione insufficiente produce nuclei deboli, mentre una sovracolorazione oscura i dettagli cellulari. Solo le diapositive che soddisfano questi criteri ottimali di colorazione dovrebbero passare al passaggio successivo.
  6. Asciuga i vetrini con carta assorbente e poi asciuga completamente all'aria (10-15 minuti).
    NOTA: Assicurati che i vetri siano completamente asciutti prima di procedere con la LCM. Poi inserisci i vetri nei tubi centrifughe da 50 mL e conservati temporaneamente sul ghiaccio fino al completamento della LCM.

4. Microdissezione a cattura laser

NOTA: La durata dell'esperimento LCM per ogni vetrata deve essere mantenuta tra 30 minuti e 1 ora. Si raccomanda che l'intero esperimento LCM sia completato entro 4 ore. Questo limite è impostato per minimizzare la degradazione dell'RNA a RT e per prevenire l'evaporazione del buffer di raccolta nel tappo del tubo, fondamentale per un recupero efficiente del campione. In pratica, la resa target di circa 1.000 celle da regioni definite morfologicamente può essere raccolta in modo affidabile entro 4 ore.

  1. Pulire le superfici del banco di laboratorio usando l'agente di decontaminazione RNasi.
  2. Accendi il controllore e lascia che il microscopio completi il processo di inizializzazione.
  3. Ruota il tasto in senso orario dalla posizione Off a quella On per avviare il sistema laser.
    NOTA: Il sistema laser richiede circa 10 minuti per riscaldarsi.
  4. Accendi il computer e apri il software LCM, poi attendi che il processo di inizializzazione si completi.
  5. Inserire un tubo PCR sterile da 0,2 mL (tubo di raccolta) nel dispositivo di raccolta.
  6. Aggiungere 10 μL di un buffer di digestione K della proteinasi (vedi la Tabella dei Materiali) al tappo del tubo PCR.
    NOTA: Il volume totale del buffer di digestione della proteinasi K sarà portato a 150 μL in una fase successiva (vedi Passaggio 5.4.1) come parte della procedura completa di lisi.
  7. Carica il dispositivo di raccolta nel portacampioni del microscopio.
  8. All'interno della finestra Change Collector Device , seleziona prima il pulsante Sposta al punto di riferimento . Successivamente, regola la messa a fuoco della fotocamera per assicurarti una visuale chiara del punto di riferimento. Se necessario, usa le frecce nella finestra per centrare il punto di riferimento nel campo visivo.
  9. Carica una sezione di tessuto nel portacampioni, assicurandoti che la sezione sia orientata con la faccia in giù e che l'etichetta sia a destra.
  10. Seleziona la lente obiettivo del 10×, identifica e delinea le regioni di interesse che mostrano caratteristiche patologiche specifiche, come la steatosi microvescicolare (caratterizzata da epatociti con numerose piccole vacuole citoplasmatiche chiare e nuclei centrali). Poi, vai al menu Laser e clicca sul pulsante Calibra . Conferma il messaggio a schermo selezionando Sì e procedi con la calibrazione.
    NOTA: La lente obiettivo del 10× non è esclusiva per la microdissezione; Altri obiettivi di ingrandimento (ad esempio, 20×) possono essere selezionati in base alla nitidezza del campione e alla risoluzione desiderata.
  11. Nel pannello di controllo laser, imposta i parametri di taglio a: Potenza laser = 50, Apertura (diametro del fascio laser) = 5 e Velocità = 9.
    NOTA: I valori dei parametri sopra elencati fungono da riferimento per il sistema UV-LCM con i campioni di tessuto utilizzati in questo protocollo. Gli utenti di altri sistemi UV-LCM dovrebbero considerare questi come punto di partenza e probabilmente dovranno modificare le impostazioni in modo empirico. Le impostazioni ottimali possono variare in base al tipo di tessuto, allo spessore della sezione e ad altri sistemi LCM.
  12. Disegna un cerchio intorno all'area target usando la barra grafica. Seleziona la Forma Singola, clicca sul pulsante Start Cut per eseguire la LCM, poi posiziona il dispositivo di raccolta per raccogliere il tessuto dissezionato.
    NOTA: Il distacco riuscito è indicato dalla separazione dell'area selezionata, spesso con un vuoto visibile o un movimento di frammento. Per coerenza, raccogliere da un numero predefinito di regioni di dimensioni simili per campione. Se l'area del bersaglio non si stacca automaticamente, clicca sul pulsante Move and Cut per tagliare manualmente il campione usando il mouse. Per una stima più precisa del numero di celle, il software LCM può registrare automaticamente l'area totale del taglio. Questo valore può essere diviso per l'area media della sezione trasversale di una cella target per approssimare il numero totale di celle catturate.
    ATTENZIONE: Durante il processo LCM, non fissare direttamente il fascio laser per evitare l'esposizione alle radiazioni laser.
  13. Opzionalmente, cattura un'immagine Prima e Dopo del sito di dissezione selezionando il comando Salva immagine come nel menu File . Nella finestra di dialogo, scegli una posizione, un nome file e salva in un formato preferito (ad esempio, .tif).
  14. Dopo aver raccolto il numero desiderato di celle, clicca sul pulsante Scarica per rimuovere il raccoglitore dal livello. Prima di sigillare il tubo PCR, verificare che il volume di tamponamento di digestione della proteinasi K nel tappo rimanga a 10 μL; rifornire il tampone se si verificava evaporazione durante la LCM (vedi Passo 4.6).
    NOTA: Aggiungere 10 μL di tampone garantisce che la superficie del tappo sia completamente bagnata, facilitando così il trasferimento efficiente del pellet di tessuto micro-dissezionato durante la centrifugazione nello Passo 4.16.
  15. Vortice i tubi di raccolta a fondo.
  16. Fai ruotare brevemente i tubi di raccolta e conserva i tubi campione a -80 °C fino all'estrazione dell'RNA.
    NOTA: Ripeti i passaggi da 4,5 a 4,16 per il campione successivo. Il protocollo può essere messo in pausa fino all'estrazione dell'RNA.

5. Estrazione totale di RNA da campioni micro-dissezionati

  1. Pulire le superfici del banco di laboratorio usando l'agente di decontaminazione RNasi.
  2. Trasferire i campioni di LCM dal congelatore a -80 °C in un bagno di ghiaccio. Se desiderato, mettere in pool diversi lotti degli stessi campioni catturati.
  3. Incubare i tubi micro-dissezionati capovolti a 42 °C per 30 minuti.
    NOTA: Questa inversione garantisce che qualsiasi tessuto rimasto aderente al cappuccio dopo una breve centrifugazione (Passo 4.16) venga rilasciato nel tampone digestionale. Questo garantisce il massimo trasferimento del campione nel buffer prima della regolazione del volume e della centrifugazione ad alta velocità nello Passo 5.4.1.
  4. Isolare l'RNA totale da campioni di LCM utilizzando un kit standard di estrazione di RNA ottimizzato per tessuti fissi (vedi la Tabella dei Materiali).
    1. Regolare il volume in ogni tubo campione a un finale di 150 μL con il buffer di digestione della proteinasi K (vedi la Tabella dei Materiali). Fai girare i tubi a 11.000 × g (1 min), poi trasferisci i campioni in un tubo sterile da 1,5 mL.
    2. Aggiungi 10 μL di proteinasi K (20 mg/mL) per provetta, poi mescola delicatamente i campioni con pipetazioni ripetute. Questo porta a un volume finale di 160 μL e a una concentrazione finale di proteinasi K di circa 1,25 mg/mL nella reazione digestionale per campione.
    3. Eseguire un'incubazione in due fasi: prima a 56 °C per 15 minuti, seguita da 15 minuti a 80 °C. Durante ogni incubazione, vortice brevemente i tubi ogni 5 minuti.
      NOTA: Per un flusso di lavoro ottimale, usa due bagni d'acqua preriscaldati. Se si utilizza un solo bagno, si ferma dopo l'incubazione a 56 °C: si trattengono i campioni a RT mentre il bagno si riscalda a 80 °C, poi procedi.
    4. Mettere i campioni per 3 minuti sul ghiaccio, seguiti da centrifugazione a 20.000 × g ( 15 min).
    5. Aspira il sovrandanante chiarificato su un nuovo tubo da 1,5 mL, facendo attenzione a evitare il pellet.
    6. Aggiungere 16 μL di tampone di incubazione DNasi e 10 μL di enzima DNasi I (2,73 unità/μL, vedi la Tabella dei Materiali) a ciascun campione. Poi, mescola bene il contenuto invertendo delicatamente i tubetti. Questo porta a un volume finale di 186 μL e a una concentrazione finale di DNasi I di circa 0,15 unità/μL nella reazione digestionale per campione.
    7. Esegui una rapida rotazione per raccogliere liquidi residui dalle pareti del tubo.
    8. Incubare i tubi campione a RT per 15 minuti.
    9. Trasferire 320 μL di tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale (vedi la Tabella dei Materiali) a ciascun campione e mescolare accuratamente i campioni. Questo porta a un volume finale di 506 μL per campione.
    10. Trasferire 720 μL di etanolo assoluto a ciascun tubo, mescolare i campioni tramite pipetto (senza centrifugazione) e procedere immediatamente. Questo si traduce in un volume finale di 1.226 μL per campione.
      ATTENZIONE: L'etanolo assoluto è altamente infiammabile. Raccogli l'etanolo di scarto in un contenitore designato per i rifiuti organici non alogenati per lo smaltimento corretto.
    11. Trasferire 700 μL della miscela campione a una colonna di purificazione (posta in un tubo di raccolta da 2 mL, vedi la Tabella dei Materiali). Chiudi delicatamente il coperchio e centrifuga a 8.000 × g ( 15 s).
    12. Scartare il flusso del tubo di raccolta. Conserva la colonna della purificazione.
    13. Ripeti i passaggi 5.4.11 a 5.4.12.
    14. Aggiungere 500 μL di buffer di lavaggio a base di etanolo (vedi la Tabella dei Materiali) a ciascun tubo campione. Chiudi delicatamente i coperchi e centrifuga a 8.000 × g ( 15 s). Poi, scartare il flusso del tubo di raccolta.
    15. Ripeti il Passaggio 5.4.14 per intero, con l'unica modifica di aumentare il tempo di centrifugazione a 2 minuti a 8.000 × g.
    16. Trasferire ogni colonna di purificazione in un nuovo tubo da 2,0 mL. Centrifuga a 14.000 × g (5 min) con il tappo aperto, poi scarta il tubo e il liquido residuo.
    17. Trasferire ogni colonna di purificazione in un nuovo tubo da 1,5 mL. Pipetta 16 μL di acqua priva di RNasi sulla membrana, chiudi il tappo e centrifuga a 14.000 × g ( 5 min) per facilitare l'eluzione dell'RNA totale.
      NOTA: Conservare tutti i campioni di RNA eluzionati sul ghiaccio per i passaggi 5.5 e 5.6 per prevenire il degrado.
  5. Quantifica i campioni di RNA e verifica la purezza (rapporto A260/A 280 ) tramite spettrofotometria.
    NOTA: La misurazione della concentrazione e della purezza (rapportoA 260/A 280 ) in questo passaggio, insieme alla valutazione dell'integrità nello Step 5.6, rappresenta il punto di controllo quantitativo definitivo per un recupero efficace dell'RNA. Si prevede un eluato di RNA chiaro.
  6. Eseguire elettroforesi su gel di agarosio con una concentrazione di gel dell'1% e determinare il numero di integrità dell'RNA (RIN) utilizzando un sistema bioanalizzatore per valutare la qualità dell'RNA.
  7. Conservare i campioni di RNA a -80 °C fino all'esecuzione della qRT-PCR o RNA-Seq.

6. Analisi dell'RNA

NOTA: la qRT-PCR è descritta nei Passaggi 6.1 e 6.2, mentre RNA-Seq è descritto nello Passo 6.3.

  1. Prepara la miscela di reazione di trascrizione inversa e aggiungi 50 ng di RNA totale per ogni reazione sul ghiaccio. Procedere con la reazione di trascrizione inversa utilizzando un termociclatore secondo le istruzioni fornite (vedi la Tabella dei Materiali).
  2. Sul ghiaccio, preparare il master mix quantitativo per PCR per β-actin secondo le istruzioni del produttore (vedi la Tabella dei Materiali per le sequenze di inn). Eseguire amplificazione PCR in tempo reale su un sistema PCR quantitativo utilizzando il protocollo di ciclaggio raccomandato dal produttore con 10 ng di cDNA per reazione.
  3. Utilizzando un kit stranded a basso input (vedi la Tabella dei Materiali), costruire librerie RNA-Seq da 50 ng di RNA totale. Determinare la dimensione e la concentrazione della libreria con un sistema bioanalizzatore (vedi la Tabella dei Materiali) e poi eseguire sequenziamento a coppie su una piattaforma ad alta produttività (vedi la Tabella dei Materiali).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il flusso di lavoro sperimentale, che include fissazione del PFA, disidratazione al 30% di saccarosio, incorporamento e criosezione dell'OCT, colorazione dell'ematossilina, identificazione e raccolta precisa della regione target (~1.000 cellule) tramite LCM, lisi cellulare, isolamento dell'RNA, metriche di controllo qualità dell'RNA e le due applicazioni analitiche chiave, è delineato nella Figura 1. La sezione epatica colorata con ematossilina sul vetrito P...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La forza della LCM risiede nella sua cattura precisa e in situ di cellule o regioni tissutali selezionate, facilitando lo studio di aree specifiche all'interno di un tessuto eterogeneo. Ma la sua bassa resa campionaria, il processo che richiede tempo, l'elevato costo e la necessità di attrezzature specializzate limitano l'applicazione diffusa di questa tecnica neilaboratori 23. In questo studio, il protocollo LCM-RNA è stato stabilito per superare le prin...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (82070589), della Guangdong Natural Science Foundation (2022A1515010218) e del Guangzhou Science and Technology Plan Project (206077078001) al Prof. Yan Wang. Siamo grati al Biomedical Research Center della Southern Medical University per il supporto tecnico e l'accesso al sistema di microdissezione a cattura laser.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materiale
Tubi a parete sottile da 0,2 mlAssigenoPCR-02-CTubi per la raccolta LCM
Tubo centrifugo da 1,5 mLAssigeno339653
4% di paraformaldeideLeageneDF0135
Tubo centrifuga da 50 mLThermoFisher Scientific339653
DEPC (pirocarbonato dietilico)SigmaD-5758
Set digeritivo DNasi IQiagen73504Componente del kit FFPE RNeasy include la soluzione di base DNase I e il DNase Booster Buffer
Etanolo (100%)Thermo Fisher ScientificBP2818Purificato per la biologia molecolare
Buffer di lavaggio a base di etanoloQiagen73504RPE buffer (componente del kit FFPE RNeasy)
Tampone di lavaggio ad alto contenuto di saleQiagen73504RBC buffer (componente del kit RNeasy FFPE)
Lame microtome a profilo bassoLeica Biosystems819
Mayer' s ematossilinaLeageneDH0001
Composto OCTSakura4583
Slide rivestito a membrana PENLeica11505188
Soluzione salina tamponata con fosfatoLeageneCC0010Priva di DNasi/RNasi
Poli-L-lisinaMacklinP875131S
Buffer digestionale della proteinasi KQiagen73504PKD buffer (componente del kit RNeasy FFPE)
Colonna di purificazioneQiagen73504Colonna spin RNeasy MinElute (componente del kit FFPE RNeasy)
Master mix quantitativo PCRBiografia di TakaraRR820ATB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)
Kit di trascrizione inversaQiagen205411Kit di trascrizione inversa QuantiNova
Kit di estrazione RNAQiagen73504RNeasy FFPE Kit
Kit di sequenziamento dell'RNA (A basso input, catenato)Biografia di Takara634412Kit SMARTer RNA-seq totale catenato - mammifero con input pico v2
Agente di decontaminazione RNasiSolarbioSR0040Pulizia
SucrosioMacklinS818049
Animali e Dieta
Mouse: C57BL/6JCentro per gli Animali da Laboratorio della Provincia del Guangdong03
Speciale e Bere acqua
Dieta ricca di grassi e carenza di colina (dieta base)TROPHIC Animal Feed High-Tech Co., Ltd.TP36310MMacronutrienti: proteine, 14 kcal%; carboidrati, 26 kcal%; grasso, 60 kcal%
Acqua potabile con zuccheroMacklinN/A (preparato internamente)Una miscela di D-glucosio (Macklin, Cat# F87500) e D-fruttosio (Macklin, Cat# S818049) è stata aggiunta all'acqua potabile autoclavata a una concentrazione finale di 42 g/L, con un rapporto glucosio/fruttosio di 55:45 (a settimana)
Primer per topi
β-actin (Avanti: AGAGGGAATCGTGCGTGAC)Sequenziamento BGIPersonalizzatoHPLC purificato
β-actin (Reverso: CAATAGTGATGACCTGGGT)Sequenziamento BGIPersonalizzatoHPLC purificato
Equipaggiamento
Microtomo criostaticoLeica BiosystemsCM3050 S
Sistema bioanalizzatoreAgilentG2939BA
Piattaforma di sequenziamento ad alta produttivitàIllumina; Inc.Sistema NovaSeq 6000
Sistema di microdissezione a cattura laserLeica MicrosystemsLeica LMD6500
Sistema PCR quantitativoBiosistemi applicatiSistema PCR in tempo reale QuantStudio 5
SpettrofotometroThermoFisher ScientificNP80NanoDrop
Thermal CyclerBioRadT100
Software
Adobe Illustrator CC 2019 (versione 23.0.2)Adobehttps://www.adobe.com/products/illustrator.html
GraphPad Prism (versione 8.3.0)GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
  2. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 543 (7647), 352-356 (2017).
  3. Aizarani, N., et al. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
  4. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  5. Baron, C. S., et al. Cell Type Purification by Single-Cell Transcriptome-Trained Sorting. Cell. 179 (2), 527-542.e19 (2019).
  6. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  7. Dries, R., et al. Advances in spatial transcriptomic data analysis. Genome Res. 31 (10), 1706-1718 (2021).
  8. Chen, A., et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).
  9. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  10. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).
  11. Baba, N., et al. Gene expression profiling in biliary epithelial cells of primary biliary cirrhosis using laser capture microdissection and cDNA microarray. Transl Res. 148 (3), 103-113 (2006).
  12. Mena, J. E. T., et al. Laser capture microdissection after γ-glutamyl transferase histochemistry: An optimization for gene expression analysis. Anal Biochem. 447, 126-132 (2014).
  13. Liu, Y., et al. Next-generation RNA Sequencing of Archival Formalin-fixed Paraffin-embedded Urothelial Bladder Cancer. Eur Urol. 66 (6), 982-986 (2014).
  14. Ludyga, N., et al. Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses. Virchows Arch. 460 (2), 131-140 (2012).
  15. Mägel, L., Bartels, S., Lehmann, U. Next-Generation Sequencing Analysis of Laser-Microdissected Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded (FFPE) Tissue Specimens. Methods Mol Biol. 1723, 111-118 (2018).
  16. Von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA Quality from FFPE Samples. PLoS One. 2 (12), e1261(2007).
  17. Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. Am J Pathol. 151 (1), 63-67 (1997).
  18. Schütze, K., et al. Cut out or poke in--the key to the world of single genes: laser micromanipulation as a valuable tool on the look-out for the origin of disease. Genet Anal. 14 (1), 1-8 (1997).
  19. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histol Histopathol. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  20. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565(2010).
  21. Ge, S. J., Gan, W. Q., Karlinsey, K., Zhou, B. Y., Pachter, J. S. Immuno-laser capture microdissection of perfusion-fixed mouse brain tissue coupled to RNA-seq. J Neurosci Methods. 423, 110548(2025).
  22. Takahashi, K., Beltran, W. A., Sudharsan, R. An optimized workflow for transcriptomic analysis from archival paraformaldehyde-fixed retinal tissues collected by laser capture microdissection. Exp Eye Res. 246, 109989(2024).
  23. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods Mol Biol. 1723, 1-17 (2018).
  24. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Converg. 4 (1), (2017).
  25. Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nat Protoc. 4 (6), 902-922 (2009).
  26. Pan, D. Y., et al. Laser Capture Microdissection-Based RNA Microsequencing Reveals Optic Nerve Crush-Related Early mRNA Alterations in Retinal Ganglion Cell Layer. Transl Vis Sci Technol. 9 (11), 30(2020).
  27. Civita, P., et al. Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues. Front Oncol. 9, 482(2019).
  28. Phan, H. V., et al. High-throughput RNA sequencing of paraformaldehyde-fixed single cells. Nat Commun. 12 (1), 5636(2021).
  29. Thomsen, E. R., et al. Fixed single-cell transcriptomic characterization of human radial glial diversity. Nat Methods. 13 (1), 87-93 (2016).
  30. Lin, X. J., et al. A comparative analysis of RNA sequencing methods with ribosome RNA depletion for degraded and low-input total RNA from formalin-fixed and paraffin-embedded samples. Bmc Genomics. 20 (1), 831(2019).
  31. Luzzi, V., Mahadevappa, M., Raja, R., Warrington, J. A., Watson, M. A. Accurate and reproducible gene expression profiles from laser capture microdissection, transcript amplification, and high density oligonucleotide microarray analysis. J Mol Diagn. 5 (1), 9-14 (2003).

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