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Il flusso di lavoro sperimentale per valutare l'efficacia degli inoculanti microbici nel migliorare la tolleranza allo stress idrico nella lattuga romana (Lactuca sativa L. var. Paspartu) è riassunto nella Figura 1. Il protocollo integrava il monitoraggio continuo di regimi di irrigazione precisi con acquisizione periodica di dati fisiologici e termici. Sono stati utilizzati due prodotti microbici distinti: (I) consorzio microbico, un complesso consorzio di 67 ceppi comprendenti PGPR, actinomicetti e funghi benefici, progettato per agire come tampone fisiologico attraverso la colonizzazione radicale e la secrezione di esopolisaccaridi (EPS); e (II) Trichoderma harzianum, un inoculante a singolo ceppo di Trichoderma harzianum volto a indurre resistenza sistemica e modificare l'architettura radicale. I reagenti, le attrezzature e i software utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Inoculazione microbica
È stato implementato un regime di inoculazione standardizzato per entrambi i trattamenti microbici, composto da sei applicazioni impregnate di terreno mirate alla rizosfera utilizzando micropipette ad alta precisione per simulare dosi su scala di campo. La prima fase si è verificata durante la fase di piantinaggio a 5 e 15 giorni dalla semina (DAS). A 30 DAS, le piantine venivano trapiantate in vassoie a cavità più grandi, con la seconda fase di inoculazioni eseguita 1 giorno dopo il trapianto (DAT), seguita da applicazioni successive a 7, 15 e 20 DAT.
Per il consorzio microbico, le dosi sono state adeguate in base alla fenologia vegetale: le prime due applicazioni sono state applicate a 500 g/ha (3 mL/pianta), seguite da una dose ad alta concentrazione di 2 kg/ha al trapianto, e concludendosi con tre dosi di mantenimento di 300 g/ha. Analogamente, T. harzianum è stato applicato a 1 L/ha nelle prime due fasi, 3 L/ha al trapianto e 1 L/ha nelle ultime tre applicazioni. Questo approccio a fasi è stato progettato per garantire una colonizzazione radicale robusta e mantenere il ruolo della popolazione microbica come cuscinetto fisiologico durante i periodi critici di crescita e induzione dello stress.
2. Preparazione delle colture
I semi di lattuga romana certificati (Lactuca sativa L. var. Paspartu) sono stati germinati in vassoi di polistirene a 311 cavità (11 mL per cavità) utilizzando un substrato professionale a base di torba a una profondità di 1 cm. La germinazione è stata effettuata in una camera bioclimatica controllata mantenuta a temperature comprese tra 15 °C e 22 °C e un'umidità relativa tra il 60% e il 70%. Al raggiungimento del 90% di germinazione (circa 3–5 giorni dopo la semina), le piantine venivano trapiantate in vassoi più grandi con una capacità di 55 mL di testa per permettere lo sviluppo radicale senza restrizioni (Figura 2 e Figura 3). La sperimentazione è stata organizzata in un disegno completamente randomizzato (CRD), con 9 unità sperimentali (vassoi) e 20 piantine per vassoio. Questa configurazione era strutturata per accogliere una disposizione fattoriale 3 × 3 (3 trattamenti microbici × 3 regimi di irrigazione). Le proprietà fisico-chimiche dettagliate del substrato e la programmazione specifica della camerabioclimatica 14sono fornite nella Figura 3, Tabella Supplementare 1, Tabella Supplementare 2 e Tabella Supplementare 3.
I vassoi sperimentali sono stati distribuiti utilizzando una disposizione completamente casuale all'interno della camera bioclimatica per eliminare gli effetti di bordo e garantire un'esposizione uniforme. La camera era programmata per simulare condizioni dinamiche simili a un campo, utilizzando un regime ad alta temperatura per replicare lo stress termico in campo aperto. Durante la fase vegetativa, i parametri ambientali sono stati mantenuti all'interno di un intervallo di umidità relativa variabile e un fotoperiodo di 9 ore è fornito da illuminazione LED ad alta intensità (impostata sopra il 50% della capacità massima per garantire un'adeguata radiazione fotosintetica attiva)15. Dopo la fase di istituzione, il programma ambientale è stato adeguato per riflettere le esigenze crescenti dei trattamenti a deficit idrico, come illustrato nelle transizioni atmosferiche a passo15 (Figura 4 e Figura 5). I punti di regolazione specifici diurni/notturni per temperatura, umidità e intensità luminosa sono dettagliati nella Tabella Supplementare 1 e nella Tabella Supplementare 2 per semplificare il protocollo principale.
La strategia di fekmazione è stata progettata per soddisfare le specifiche esigenze fenologiche della lattuga romana, mantenendo un flusso nutrizionale equilibrato durante tutto il ciclo vegetativo. Durante la fase di piantina (12-24 DAS), i nutrienti sono stati forniti tramite applicazioni mirate di Nitrato di Potassio (KNO3), Fosfato di Monopotassio (KH 2PO4) e Nitrato di Calcio (Ca(NO3)2). Per favorire l'insediamento precoce, è stato integrato un biostimolante commerciale durante i primi24 giorni 16.
Da 26 DAS fino alla valutazione finale a 76 DAS, il programma di fertigazione è passato a un regime di mantenimento in cui il biostimolante è stato eliminato per isolare gli effetti specifici degli inoculanti microbici. Tutte le applicazioni sono state calibrate per mantenere la conducibilità elettrica (EC) e il pH ottimali all'interno della rizosfera. Il calendario cronologico completo delle concentrazioni minerali e i volumi di dosaggiospecifici 16sono dettagliati nella Tabella Supplementare 3.
3. Trattamento con microrganismi
Per valutare l'efficacia degli interventi biologici contro lo stress idrico, sono stati stabiliti tre trattamenti distinti: (I) consorzio microbico, un consorzio microbico ad alta diversità comprendente 67 ceppi benefici, tra cui Rizobatteri Promotori della Crescita delle Piante (PGPR), Actinomiceti e funghi; (II) T. harzianum, una formulazione specializzata a un solo ceppo di Trichoderma harzianum; e (III) un Controllo non vaccinato. Questi trattamenti sono stati selezionati in base al loro potenziale di Tolleranza Sistemica Indotta (IST), principalmente attraverso meccanismi come la modifica dell'architettura radicale, la produzione di ACC-deaminasi e la secrezione di esosaccacaridi (EPS).
L'inoculazione seguiva un approccio strategico a fasi. L'applicazione iniziale (3 mL per pianta) è stata eseguita tramite micropipetta ad alta precisione direttamente nella rizosfera al secondo stadio fogliare vero per garantire una colonizzazione radicale precoce. Le applicazioni successive furono calibrate a equivalenti su scala di campo (simulando una densità di 75.000 piante/ha). Per T. harzianum, è stata applicata una concentrazione di 2 L/ha, mentre il consorzio microbico è stato somministrato a 1 kg/ha. Queste formulazioni venivano sciolte nell'acqua di irrigazione e applicate ogni 15 giorni per mantenere una popolazione microbica stabile come cuscinetto fisiologico durante tutto il ciclovegetativo 17.
4. Trattamenti di irrigazione diversi
Per valutare la plasticità fisiologica e agronomica di L. sativa in condizioni idriche variabili, sono stati implementati tre regimi di irrigazione basati sulla sostituzione dell'evapotraspirazione delle colture (ETc). Il contenuto volumetrico d'acqua è stato calibrato rispetto alla capacità di campo (FC) del substrato per garantire un'induzione precisa dello sforzo. I regimi erano definiti come segue: (I) Controllo/Irrigato da pozzo (CC-100% ETc), dove l'evapotraspirazione completa veniva reintegrata; (II) Deficit idrico moderato (75% ETc), progettato per indurre la limitazione idraulica intermedia; e (III) Grave Deficit Idrico (50% ETc), mirato a generare stress idrico critico. L'irrigazione è stata somministrata quotidianamente dopo aver acquisito immagini termiche con pipette graduate per garantire una corretta sostituzione del volume d'acqua perso durante l'evapotratrarrazione18.
5. Registrazione dati e immagini
Per valutare la distribuzione termica e lo stato dell'acqua degli impianti, sono state catturate quotidianamente immagini termiche a infrarossi dal lunedì al venerdì durante tutto il periodo sperimentale. Tutte le registrazioni fotografiche sono state effettuate tra le 12:00 e le 14:00 per standardizzare le misurazioni durante il periodo di massima traspirazione e intensità solare. È fondamentale realizzare queste immagini immediatamente prima dei trattamenti di irrigazione giornalieri per registrare lo stress idrico cumulativo subito dalle piante nel ciclo precedente di 24 ore. Per l'acquisizione dell'immagine, la telecamera termica a infrarossi era collegata a un dispositivo mobile e manteneva un'orientazione perpendicolare rispetto al retro delle piante di lattuga a una distanza costante di 60–70 cm. Il software era configurato con una tavolozza termica multicolore in cui i gradienti di temperatura sono rappresentati dal più basso al più alto: iniziando dal viola (il più freddo), passando attraverso blu reale, turchese, verde (punto medio), giallo, arancione e infine rosso (il più caldo). All'interno dell'interfaccia software, l'area specifica del vassoio contenente la chioma delle piante veniva selezionata manualmente per catturare i dati termici. Questa scala cromatica funge da indicatore fisiologico: le piante ben idratate mostrano temperature della chioma più fresche (viola/blu) a causa della traspirazione attiva, mentre le piante disidratate mostrano temperature più elevate (arancioni/rossi) a causa della chiusura stomatica e del raffreddamento evaporativo ridotti. Successivamente, queste immagini ad alta risoluzione venivano elaborate utilizzando la funzione di misurazione a tre punti su specifiche regioni di interesse (ROI) per estrarre valori precisi della temperatura della chioma (Tc) per il calcolo dell'Indice di Stress Idrico delle Colture (CWSI).
Se CWSI è:
0, allora la coltura non è sotto stress idrico
1 allora il raccolto è sottoposto a grave stress idrico
Dove:
Tc è la temperatura della chioma delle colture, misurata con immagini a infrarossi. Tw è la temperatura della chioma in condizioni non dovute allo stress idrico. Td è la temperatura della chioma in condizioni di massima pressioneidrica 19.
Gli indicatori di crescita, sviluppo e condizioni fisiologiche delle piante, come altezza, numero di foglie e temperatura delle foglie, valutati tramite termografia a infrarossi, sono mostrati nella Tabella Supplementare 4 insieme alle variabili di studio e alle definizioni concettuali e operative utilizzate nell'esperimento. La combinazione di queste variabili ha permesso una valutazione completa dell'impatto dei trattamenti sperimentali sulle prestazioni fisiologiche e sullo sviluppo di ciascuna pianta.
6. Analisi dei dati
I dati fisiologici e morfologici sono stati analizzati utilizzando un'ANOVA unidirezionale per ciascun regime di irrigazione al fine di determinare l'effetto dei diversi trattamenti microbici. Tutte le procedure statistiche venivano eseguite tramite software statistico. Prima di condurre l'analisi inferenziale, sono stati verificati i requisiti fondamentali per la statistica parametrica per garantire l'affidabilità dei risultati. La normalità dei residui è stata confermata tramite il test di Anderson-Darling (p > 0,100), indicando la normalità. Inoltre, l'omogeneità delle varianze è stata validata tramite il test di Levene (p = 0,989), confermando un'elevata omoscedasticità tra i gruppi. Poiché entrambe le ipotesi sono state soddisfatte, è stato utilizzato il test post-hoc Tukey HSD (Honestly Significant Difference) per identificare differenze significative (p < 0,05) tra le medie del trattamento. La singola pianta era definita come unità sperimentale per tutte le valutazioni statistiche.
