Method Article

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula per il profilo di segmenti colonici gangglioni e aganglioni da pazienti affetti da malattia di Hirschsprung

DOI:

10.3791/69825

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May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal Surgery, The Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di sequenziamento dell'RNA a singola cellula per analizzare l'infiltrazione delle cellule immunitarie e le differenze trascrizionali specifiche per tipo cellulare tra segmenti colonici ganglioni e aganglioni nella malattia di Hirschsprung.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La malattia di Hirschsprung (HSCR) è un disturbo congenito della motilità intestinale caratterizzato dall'assenza di neuroni enterici nell'intestino distale. Rispetto al sequenziamento di RNA in massa, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) consente la profilazione dell'espressione genica a livello di singola cellula, risolvendo l'eterogeneità cellulare mascherata nelle analisi medie della popolazione. È stato istituito un flusso di lavoro standardizzato scRNA-seq per caratterizzare il panorama trascrizionale dei segmenti gangliari e aganglioni dei pazienti con HSCR. Sono stati raccolti tessuti del colon e è stata eseguita colorazione di ematossilina ed eosina per identificare le regioni ganglionari e aganglioni. I tessuti sono stati dissociati enzimaticamente e meccanicamente in sospensioni a singola cellula, seguite da filtrazione, valutazione della vitalità e costruzione di librerie di trascrittoma a singola cellula. Le librerie che superavano il controllo qualità venivano sequenziate e i dati grezzi venivano processati per la quantificazione delle celle e il filtro della qualità per rimuovere celle di bassa qualità e artefatti tecnici. Dopo la normalizzazione e la riduzione della dimensionalità, le cellule sono state raggruppate e annotate sulla base di geni marcatori consolidati. Analisi a valle hanno confrontato la composizione cellulare tra tessuti ganglionari e aganglionari e identificato geni espressi differenzialmente all'interno dei principali sottoinsiemi delle cellule immunitarie. I risultati rivelano differenze sostanziali nel microambiente immunitario tra i segmenti gangliari e aganglioni nell'HSCR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La malattia di Hirschsprung (HSCR) è uno dei disturbi congeniti della motilità intestinale più comuni, con un'incidenza di circa 1 su 5.000 nati vivi nel mondo1. La malattia nasce dal fallimento delle cellule della cresta neurale enterica (ENCC) nel migrare nell'intestino distale durante le settimane embrionali 5–12, con conseguente assenza di gangli enterici nei segmenticolpiti 2. Il segmento aganglioneare presenta quindi una contrazione spastica persistente e un peristalsi compromesso, portando a dilatazione intestinale prossimale. Clinicamente, questo si manifesta come ostruzione funzionale, causando stitichezza, distensione addominale e vomito, e può essere pericoloso per la vita nei casi gravi. La resezione chirurgica del segmento aganglioneare rimane il trattamento principale per l'HSCR; Tuttavia, una percentuale significativa dei pazienti presenta complicazioni post-operatorie, tra cui stitichezza, enterocolite e sporcizia fecale, che compromettono significativamente la qualità dellavita 3. Inoltre, la sindrome dell'intestino corto (SBS) può verificarsi dopo una resezione intestinale estesa, con conseguente riducimento dell'assorbimento dei nutrienti e maggiori difficoltà nella gestione clinica. Pertanto, l'elucidazione dei meccanismi sottostanti dell'HSCR e l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici rimangono esigenze cliniche critiche.

Negli ultimi anni, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) è stato ampiamente applicato per indagare meccanismi molecolari associati alle malattie. A differenza del tradizionale sequenziamento di RNA di massa, scRNA-seq consente l'analisi dell'espressione genica a risoluzione di singola cellula, consentendo l'identificazione di eterogeneità cellulare e di rare sottopopolazioni mascherate nelle analisi di massa4. Di conseguenza, scRNA-seq è emerso come uno strumento potente per dissezionare l'eterogeneità cellulare e la comunicazione intercellulare, promuovendo la ricerca in biologia e medicina5. Questo approccio ha rivelato nuovi meccanismi patogeni e bersagli terapeutici in malattie complesse, tra cui la malattia diAlzheimer 6, l'artritereumatoide 7, il cancro aipolmoni 8 e il diabetedi tipo 2 9.

In questo studio, scRNA-seq è stato applicato per caratterizzare il paesaggio trascrizionale delle cellule immunitarie e i modelli di infiltrazione nei tessuti colonici ganglionari e aganglioni di pazienti con HSCR. Il flusso di lavoro comprendeva tre fasi principali: preparazione e valutazione della qualità delle sospensioni a singola cellula, costruzione di librerie RNA-seq a 3′ singole cellule e analisi bioinformatica a valle. I campioni di tessuto sono stati conservati in una soluzione dedicata a conservazione unicellulare immediatamente dopo la resezione e sono stati dissociati enzimaticamente in sospensioni a singola cellula entro 48 ore. La vitalità cellulare ha superato l'80% e la concentrazione cellulare finale è stata regolata a 700–1.500 cellule/μL prima della preparazione della libreria. È stata confrontata l'infiltrazione delle cellule immunitarie tra i segmenti ganglionari e aganglioni, e sono state identificate sottopopolazioni di cellule immunitarie che mostrano differenze trascrizionali pronunciate. Queste analisi delineano le alterazioni delle cellule immunitarie associate alla patologia colonica nell'HSCR.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale dell'Ospedale Affiliato dell'Università Medica di Zunyi (Approvazione n.: KYLL-2024-030). Lo studio è conforme alla Dichiarazione di Helsinki. Il consenso informato (orale e scritto) è stato ottenuto da tutti i partecipanti e dai loro tutori. La Tabella 1 presenta le informazioni sui pazienti con HSCR.

Raccogliere tessuti colonici, inclusi segmenti ganglionari e aganglioni, da pazienti diagnosticati con HSCR e sottoposti a interventi chirurgici presso il Dipartimento di Chirurgia Pediatrica presso l'Ospedale Affiliato dell'Università Medica di Zunyi. Includere segmenti ganglionari e aganglioni di due pazienti maschi con HSCR. Informazioni cliniche dettagliate sono fornite nella Tabella 1. Tutti i reagenti, i prodotti chimici, le attrezzature e i software sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Colorazione di ematossilina ed eosina

  1. Raccolta e fissazione dei tessuti
    1. Fissare i campioni di tessuto intestinale in una soluzione di fissazione al 4% di paraformaldeide per almeno 24 ore.
      ATTENZIONE: Il paraformaldeide è tossico e rilascia vapori di formaldeide. Esegui tutte le procedure in una cappa chimica e utilizza l'attrezzatura di protezione individuale appropriata.
    2. Taglia i fazzoletti a circa 5 × 5 × 2mm 3 usando un bisturi. Metti i fazzoletti nelle cassette da inserimento e sciacquali sotto acqua del rubinetto corrente per 24 ore.
      NOTA: Rimuovi i bordi del tessuto e prepara blocchi con almeno una superficie piatta. Se non è uniforme, posiziona un fazzoletto tra le carte filtranti dopo il risciacquamento.
  2. Disidratazione da etanolo classificata
    1. Immergi i tessuti in modo sequenziale in soluzioni etanoliche: 70% etanolo durante la notte, 80% etanolo per 3 ore, 90% etanolo per 2 ore, 95% etanolo I per 2 ore, 95% etanolo II per 1 ora, 100% etanolo I per 1 ora e 100% etanolo II per 30 minuti.
      NOTA: Diluire etanolo (≥99,7%) con acqua ultrapura alle concentrazioni indicate.
      ATTENZIONE: Esegui la gestione dell'etanolo in una cappa chimica.
    2. Rimuovi il cesto antidisidratazione e svuota accuratamente tra un passaggio e l'altro.
  3. Radura
    1. Trasferire i tessuti allo xilene per 30 secondi per ottenere trasparenza.
  4. Infiltrazione e inserimento della paraffina
    1. Sciogli la cera di paraffina a 60 °C un giorno prima. Sottoporre la cera fresca a tre cicli di congelamento-scongelamento per rimuovere le bolle. Filtra la paraffina fusa attraverso carta filtrante dopo il terzo ciclo.
    2. Infiltrare i tessuti nella cera di paraffina pura (cera di paraffina I) per 1 ora.
    3. Infiltrare i tessuti nella miscela di paraffina (cera di paraffina II; cera pura di paraffina: cera d'api = 8:1) per 2 ore.
      NOTA: Scioglie completamente la cera d'api e filtra prima dell'uso.
    4. Versare cera di paraffina II negli stampi di incorporazione. Posiziona i blocchi di tessuto verticali e piatti, inserisci etichette e lascia solidificare.
  5. Sezionamento
    1. Taglia i blocchi di paraffina per ottenere superfici lisce senza incidere nel tessuto.
    2. Monta i blocchi su un microtomo. Regola l'orientamento e rimuovi l'eccesso di paraffina. Taglia sezioni seriali a spessore 4 μm. Spargere le sezioni su un bagno d'acqua a 50 °C e trasferirle su vetrini di vetro.
    3. Lame a secco in un forno a 60 °C per rimuovere l'umidità residua.
      NOTA: Sezioni asciutte per 12–48 ore.
  6. Deparaffinizzazione
    1. Esegui incubazione sequenziale: xilene I (15 min), xilene II (15 min), 100% etanolo I (5 min), 100% etanolo II (5 min), 90% etanolo (5 min), 80% etanolo (5 min), 70% etanolo (5 min) e acqua distillata (5 min).
  7. Colorazione con ematossilina
    1. Colora le sezioni con ematossilina per 50 secondi.
    2. Risciacquare sotto acqua corrente del rubinetto per 10 minuti.
  8. Colorazione con eosina
    1. Tingi sezioni con eosina per 40 secondi.
  9. Disidratazione
    1. Immergi sezioni sequenzialmente in etanolo I al 95% (30 s), 95% etanolo II (30 s), 100% etanolo I (30 s) e 100% etanolo II (30 s).
  10. Radura
    1. Trasferisci le sezioni nello xilene I per 10 minuti e nello xilene II per 10 minuti.
  11. Montaggio e osservazione
    1. Aggiungi un mezzo di montaggio. Copri con un voglio di vetro e rimuovi le bolle d'aria.
    2. Lascia che il mezzo di montaggio si solidifichi. Esamina le sezioni al microscopio ottico.

2. Sequenziamento dell'RNA a singola cellula

  1. Preparazione della sospensione a singola cella
    1. Trita i tessuti intestinali in frammenti di ~1 mm3 usando forbici.
    2. Incubare frammenti di tessuto nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, contenente 1 mg/mL di collagenasi II e 0,1 mg/mL di DNase I a 37 °C per 30 minuti, con una delicata agitazione su una piattaforma oscillante (60 rpm).
    3. Interrompere la digestione aggiungendo un volume uguale di DMEM freddo contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS).
    4. Filtra la sospensione attraverso un filtro a celle da 70 μm. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
    5. Scartare il soprantantante e trattenere la pellet cellulare. Lavare una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente albumina sierica bovina (BSA) allo 0,04%.
    6. I gruppi cellulari dissociati tramite pipetto delicato per ottenere una sospensione monocellulare.
    7. Filtra la sospensione attraverso un filtro a celle da 40 μm.
    8. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartate il soprannatante e raccogliete la pallina.
    9. Risospendere cellule in DMEM contenenti il 10% FBS e l'1% di penicillina–streptomicina (P/S).
    10. Determina la vitalità e la densità cellulare usando l'esclusione del blu di tripano. Utilizzare campioni con vitalità >80% e regolare la concentrazione a 700–1.500 cellule/μL.
      NOTA: Mescola la sospensione cellulare con il blu di tripano (1:1) e conta le cellule vitali usando un emocitometro.
  2. Preparazione della biblioteca
    1. Carica circa 15.000 celle per ogni corsa per la preparazione della biblioteca.
      NOTA: Nelle microgocce di gel bead-in-emulsion (GEM), l'mRNA si ibrida in poli(dT) oligonucleotidi sulle Gel Beads.
    2. Eseguire trascrizione inversa e amplificare il cDNA tramite PCR (95 °C per 10 minuti; 40 cicli a 95 °C per 15 secondi, 60 °C per 35 secondi, 72 °C per 25 secondi; estensione finale a 72 °C per 25 secondi). Utilizzare cDNA amplificato per la costruzione di librerie scRNA-seq a 3′.
      NOTA: Durante la sintesi del cDNA viene aggiunto un overhang CCC che si abbina alla sequenza oligonucleotidica switching template (TSO).
    3. Rompere le emulsioni e recuperare cDNA dalle GEM.
  3. Controllo qualità delle librerie e sequenziamento
    1. Quantificare l'espressione genica e valutare la distribuzione della dimensione dei frammenti.
    2. Eseguire una quantificazione accurata utilizzando uno strumento qPCR fluorescente.
      NOTA: Assicurati la concentrazione in biblioteca ≥10 nM.
    3. Librerie di sequenze usando uno strumento di sequenziamento.
      NOTA: Struttura della lettura: Lettura 1 (26 pb), Lettura 2 (91 pb), indice i7 (8 pb); Profondità bersaglio ~50.000 letture per cella.
  4. Controllo qualità dei dati
    1. Allinea le letture grezze al database di riferimento. Esegui il conteggio UMI e genera una matrice cellula per gene.
    2. Importare i risultati in formato AnnData (Annotated Data) per l'analisi a valle.
    3. Esegui un filtraggio QC basato su UMI, conteggio genico e letture mitocondriali.
      NOTA: Rimuovere i doppietti (Scrublet); escludere cellule con <200 o >5.000 geni, total_counts >40.000 o mt_ratio >20%.
  5. Riduzione della dimensionalità e annotazione
    1. Normalizzare il conteggio dell'Identificatore Molecolare Univoco (UMI) a 10.000 per cellula.
    2. Identifica geni altamente variabili.
    3. Eseguire analisi a componenti principali (PCA).
    4. Costruisci un grafo k-vicino più prossimo.
    5. Esegui l'embedding UMAP.
    6. Cluster di celle usando l'algoritmo di Leiden in Scanpy (v1.9.3).
      NOTA: Usa sc.pp.neighbors e sc.tl.leiden (risoluzione = 0,5).
    7. Annotare i tipi cellulari utilizzando uno strumento progettato per l'annotazione automatizzata e ad alta accuratezza dei tipi cellulari nei dati di sequenziamento RNA a singola cellula (scRNA-seq).
  6. Analisi differenziale
    1. Eseguire analisi differenziale dell'espressione genica in R (v4.2.2) utilizzando Seurat (v4.3.0).
      NOTA: Usa la funzione FindMarkers con il test di somma dei rangi di Wilcoxon.
    2. Esegui l'analisi di arricchimento GO utilizzando clusterProfiler (v4.8.1) con enrichGO.
      NOTA: Include le categorie CC, MF e BP.
    3. Esegui l'analisi di arricchimento dei percorsi KEGG usando clusterProfiler (v4.8.1) con enrichKEGG10.

3. Smaltimento dei rifiuti

  1. Raccogliere separatamente i rifiuti contenenti paraformaldeide e xilene.
  2. Neutralizza le soluzioni acide quando opportuno o smalti come rifiuti pericolosi.
  3. Segui le normative istituzionali sulla salute e sicurezza ambientale (EHS).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La colorazione di ematossilina ed eosina (HE) (Figura 1) ha rivelato differenze istologiche distinte tra segmenti ganglionari e aganglioni. Rispetto ai segmenti ganglionari, i segmenti aganglioni hanno mostrato un aumento dell'esfoliazione mucosa, una marcata riduzione delle cellule caliciforme e dei neuroni submucosi, e confini sfumati tra gli strati mucosali e muscolari. In un sottoinsieme di sezioni, la conservazione tissutale è stata subottimale, con dis...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il sequenziamento a RNA a singola cellula è stato applicato al profilo delle caratteristiche trascrizionali dei tessuti colonici (segmenti ganglionari e aganglioni) chirurgicamente resezionati da pazienti affetti da malattie di Hirschsprung 4,5. Particolare attenzione è stata data alla strategia di dissociazione tissutale, poiché i parametri di dissociazione influenzano il recupero cellulare, la rappresentazione del tipo cellular...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato dal Progetto Scienza e Tecnologia del Guizhou (Cooperazione Scientifica e Tecnologica del Guizhou - Fondazione - ZK - [2024] General 344) (a X.F. Yang) e dal contratto del Progetto Zunyi per la Scienza e Tecnologia (Cooperazione Scientifica e Tecnologica) (Cooperazione Scientifica e Tecnologica HZ (2023) n.). (a Y. Qu).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cera d'apiSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8012-89-3  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
Cera d'apiSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8012-89-3  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
Albumina sierica bovinaThermofisher30066575  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575? SID=srch-srp-30066575
Albumina sierica bovinaThermofisher30066575  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575? SID=srch-srp-30066575
CellTypistN/ANAhttp://celltypist.org/tutorials/onlineguide
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Pacchetto profiler di clusterBioconduttorev4.8.1https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
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Collagenasi IIThermofisher17101015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015? SID=srch-srp-17101015
Collagenasi IIThermofisher17101015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015? SID=srch-srp-17101015
Vetro di coperturaCITOTEST80340-0130  https://cn.citotest.com/pd40971476.html
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Lama usa e getta per microtomiPiumaS-35  https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
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DNasi IThermofisher18047019  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019? SID=srch-srp-18047019
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Forno di essiccazioneBORUKDHG-9140A  http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
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Dulbecco' s Eagle Medium ModificatoThermofisher12491015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
Dulbecco' s Eagle Medium ModificatoThermofisher12491015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
Alcol etilicoSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10009218  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
Alcol etilicoSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10009218  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
Siero bovino fetaleThermofisherA5669801https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
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Kit per la colorazione di ematossilina ed eosinaBeyotimeC0105S  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0105S
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Acido cloridricoSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10011028  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
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Vetri al microscopioCITOTEST80302-3111  https://cn.citotest.com/pd530614548.html
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Mezzo di montaggioBeyotimeC0173-100ml  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0173-100ml
Mezzo di montaggioBeyotimeC0173-100ml  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0173-100ml
Microscopio otticoNikonECLIPSE SI  https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
Microscopio otticoNikonECLIPSE SI  https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
Cera paraffina Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8002-74-2  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
Cera paraffina Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8002-74-2  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
Soluzione di correzione al paraformaldeideBeyotimeP0099-3L  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=P0099-3L
Soluzione di correzione al paraformaldeideBeyotimeP0099-3L  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=P0099-3L
Penicillina e dash; StreptomicinaThermofisher15140122  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122? SID=srch-srp-15140122
Penicillina e dash; StreptomicinaThermofisher15140122  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122? SID=srch-srp-15140122
Soluzione salina tamponata con fosfatoThermofisher10010023  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
Soluzione salina tamponata con fosfatoThermofisher10010023  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
Carta filtro qualitativaSolarbioYA0166https://www.solarbio.com
Carta filtro qualitativaSolarbioYA0166https://www.solarbio.com
Pacchetto software RR Foundation for Statistical Computingv4.2.2https://www.r-project.org/
Pacchetto software RR Foundation for Statistical Computingv4.2.2https://www.r-project.org/
Microtomo rotatorioLeicaLeica RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
Microtomo rotatorioLeicaLeica RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
ScanpySviluppata dalla comunitàv1.9.3https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/?utm_source=chatgpt.com
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SeuratCRANv4.3.0https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html
Disidratatore tissutaleWuhan Junjie Electronics Co., LTDJT-12H  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
Disidratatore tissutaleWuhan Junjie Electronics Co., LTDJT-12H  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
Macchina per l'incassamento dei tessutiWuhan Junjie Electronics Co., LTDJB-L8  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
Macchina per l'incassamento dei tessutiWuhan Junjie Electronics Co., LTDJB-L8  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
Trippan blu & nbsp;SolarbioC0040https://www.solarbio.com/haveRegion?id=48&all=0&key=%20Trypan%20Blue
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XyleneSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10023418  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418
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