Visualizzazione dei nettari fogliari e bracteali del cotone tramite microscopia digitale per migliorare l'accuratezza della valutazione e la conservazione dei dati

Summary

Qui illustriamo processi passo dopo passo per la fenotipizzazione dei nettari foglari e bracteali nelle piante di cotone utilizzando immagini generate tramite microscopia digitale. Questo è un metodo efficace per punteggiare i nettari sia delle foglie che delle brattee del cotone, poiché le informazioni possono essere raccolte e conservate sotto forma di immagini digitali.

Abstract

I nettari sono ghiandole distinte che producono nettare, presenti in molte specie vegetali. I nettari presentano strutture e funzioni diverse. Nel cotone, la tradizionale puntatura del tratto nettario è soggetta a errori, inaffidabile e presenta limitazioni poiché i fenotipi di questo tratto spesso non sono visibili a occhio nudo. Le espressioni dei tratti nettari sono controllate dai geni Ne1 e/o Ne2. Inoltre, l'espressione dei tratti può essere influenzata dall'ambiente e dalle fasi di crescita, sottolineando la necessità di metodi di punteggio accurati. In particolare, la puntatura fenotipica tramite immagini digitali porta a un metodo di punteggio dei nettari più accurato. Questo metodo supera i limiti della registrazione tradizionale generando immagini ad alta risoluzione. Inoltre, facilita l'identificazione e la differenziazione delle sottili differenze nell'espressione dei tratti nettari, preservando al contempo queste immagini digitali per riferimento futuro. Questo metodo di punteggio fenotipizzato descritto qui può essere facilmente adattato per puntare altri tratti vegetali come ghiandole, peli e colore. Questi metodi di punteggio possono essere adattati ad altre specie vegetali. In questo articolo, spieghiamo la procedura passo dopo passo su come raccogliere campioni dal campo o dalla serra, dissezionarli per osservarli tramite microscopia digitale e conservare queste immagini per future analisi di punteggio. Per questo metodo, utilizzeremo, ad esempio, la puntatura di campioni fogliari e bracteali di piante di cotone per differenziare la presenza di nettari (completamente sviluppati, ridotti e vestigiali) e l'assenza di nettari.

Introduction

Le piante hanno ghiandole specializzate chiamate nettari che sintetizzano e producono nettare nella maggior parte delle angiosperme, alcune felci e alcune gimnosperme 1,2,3,4. I nettari sono classificati in tre tipi, ovvero mesofillari, trichomatici ed epiteliali, basati sull'origine delle cellule che producono^{nettare 5}. I nettari nel cotone sono stomi modificati composti da tricomi ghiandolari noti come papille e sono classificati come tipo^{trichomatico 5,6}. La maggior parte delle specie di Gossypium possiede nettari; tuttavia, il numero di nettari presenti in questo genere varia da specie a^{specie 7}. I nettari floreali (FN) sono più comuni dei nettari extrafloreali (EFN) nelle^{piante 8}. Questi nettari possono trovarsi ovunque sulla pianta tranne che alle^{radici 1,2}. Ad esempio, Gossypium hirsutum mostra sia nettari floreali che^{extrafloreali 9}. Le piante di cotone domestiche mostrano tre nettari floreali extra e uno^{floreale 10}. I tre nettari floreali extra sono nettari fogliari, bracteali e^{circumbracteali 11}. Il nettario fogliare è vegetativo ed è tipicamente presente sulle foglie sul lato inferiore della nervatura centrale, mentre i nettari bracteali e circonbracteali sono riproduttivi e si sviluppano alla base della brattea e sulla superficie del calice abassiale. Il nettario floreale è associato a un fiore, che si sviluppa sulla superficie adassica (superiore) del calice. Questo tratto nettario è controllato da un singolo locus^{genico 12}. Studi condotti da due gruppi di ricerca indipendenti hanno identificato che il tratto nettario è controllato da un gene, Ne1 del genoma A o Ne2 del genoma D, mappato sui cromosomi 12 e 26,^{rispettivamente 12,13}. Questo tratto si esprime solo in una condizione doppia recessiva, il che significa che solo una condizione omozigote recessiva esprimerà il tratto senza nettari.

Oltre a questi geni, le condizioni ambientali e le fasi di crescita giocano un ruolo nel controllo del grado di espressione. Pertanto, è necessario un metodo accurato per valutare questo tratto. L'attuale studio si concentra sulla fenotipizzazione dei nettari fogliari e bracteali nel cotone. Le piante con nettari visibili che producono nettare sono valutate come nettarie, mentre le piante prive di questo tratto sono classificate come prive di nettari 1,2,3,4. L'obiettivo principale di questo articolo è presentare metodi di punteggio accurati del tratto nettario utilizzando la tecnologia di microscopia digitale. La punteggio tradizionale tramite osservazione visiva diretta non può rilevare facilmente a occhio nudo le differenze nella variazione di espressione del tratto nettario in situ. Queste sottili differenze nelle espressioni dei tratti nettari possono essere visualizzate tramite microscopia digitale. Per illustrare, nel nettario delle foglie di cotone, la rubrica di valutazione segue una scala standard da 1 a 4 in cui 1 rappresenta l'assenza di nettario, 2 rappresenta una protuberanza sul fenotipo della vena, 3 rappresenta cuscinetti o creste poco sviluppate senza nettare, e 4 rappresenta nettari completamente formati/completi con cuscinetti e creste^{trasparenti 13}. Questa valutazione fenotipica è stata generata utilizzando immagini digitali dei nettari fogliari [utilizzando immagini digitali del lato abassiale (inferiore) della nervatura centrale della foglia]. In generale, l'assenza di nettari è punteggiata come 0, ma per la significatività statistica, il valore 0 non può essere usato e sostituito dal valore 1. Pertanto, l'intervallo di punteggio del fenotipaggio è stato modificato da 1 a 4 dalla classificazione standardizzata^{0-4 13}. La griglia di valutazione dei fiori segue un modello di punteggio simile da 1 a 4, in cui 1 rappresenta ghiandole senza nettari, senza punte prominenti e senza cuscinetti o creste, 2 per ghiandole offuscate in cui i nettari presentano solo sottili segni a cuscinetti e nessun nettare, 3 per ghiandole mal formate con creste e/o cuscinetti deboli o assenti, e 4 per nettari completamente formati con nettare. Questo schema di punteggio mostra 4 per fenotipi nettari (omozigote/eterozigote dominante per uno dei geni), 3, 2 per l'espressione differenziale del tratto nettario come in eterozigote, e 1 per il nettariless (omozigote recessivo per entrambi i geni).

Allo stesso modo, i fiori vengono raccolti e dissezionati come descritto passo dopo passo in questo articolo per raccogliere immagini digitali per la puntatura dei nettari bracteali. Questo fenotipo può essere visualizzato al microscopio per una valutazione accurata che può essere memorizzata sotto forma di immagini digitali. Nel cotone, i tratti nettari non solo attirano impollinatori, ma anche parassiti che causano perdite di resa¹⁴. Per risolvere questo problema, gli selezionatori selezionarono piante senza nettari (senza nettari) come alternativa per controllare naturalmente i parassiti senza l'uso di pesticidi chimici^9,15. Il tratto senza nettari era originariamente derivato da Gossypium tomentosum a Gossypium hirsutum (cotone coltivato delle Upland)⁸. Questo metodo di punteggio è particolarmente utile per identificare la segregazione dei tratti senza nettari nelle popolazioni generate incrociando genitori nettari con genitori senza nettari. A causa di questi incroci di genitori diversi, F₂ (Seconda Generazione Filiale) mostra diversi genotipi di nettari, eterozigote nettariato e omozigote nettarido. È necessario un solo gene dominante per l'espressione del tratto nettario, che segue il rapporto di segregazione di 15:1 (9:3:3:1). Quindi, 1 su 16 esprimerà il tratto senza nettari in condizioni omozigoti recessive con genotipo ne1ne1ne2ne2. Tuttavia, i ricercatori nei programmi di riproduzione hanno osservato più linee prive di nettari rispetto al rapporto atteso di 1 su 16. Ciò significa che il tratto nettario è espresso quando i geni sono espressi come Ne1Ne1Ne2Ne2, Ne1ne1Ne2ne2, ne1ne1Ne2Ne2, ne1ne1Ne2ne2, Ne1ne1ne2ne2, and ne1ne1ne2Ne2. Il vario schema di espressione dei tratti nettari in tali popolazioni di nettari omozigoti (Ne1Ne1Ne2Ne2), eterozigote nettariato (Ne1ne1Ne2ne2), e omozigote senza nettari (ne1ne1ne2ne2) le piante possono essere perfettamente valutate rilevando i cambiamenti visualizzati nelle immagini digitali^12,13. Poiché le piante eterozigoti con nettario ridotto potrebbero non mostrare visivamente il tratto nettario e potrebbero assomigliare al tratto senza nettario, il fenotipaggio visivo pone difficoltà nella selezione affidabile di questo tratto. Questi problemi si amplificano nella tarda stagione di crescita, quando i nettari non sono presenti in alcune varietà di cotone. Le differenze tra piante eterozigoti e piante omozigoti senza nettari possono essere facilmente rilevate con imaging digitale, poiché le piante eterozigoti possono mostrare nettari piccoli o ridotti mentre le piante omozigoti non hanno alcuna caratteristica. Fenotipicamente, la presenza di nettari è classificata come nettariata (omozigota/eterozigote con almeno un gene dominante), la presenza di nettari piccoli o vestigiali come eterozigoti e l'assenza di nettari come piante omozigoti senza nettari. La valutazione digitale delle immagini ha ridotto la valutazione imprecisa delle piante eterozigoti come piante senza nettari. Allo stesso modo, la fase di fioritura a metà fase è preferita quando c'è massima espressione del tratto. Pertanto, in questa fase sono stati raccolti campioni di foglie e fiori per condurre questi esperimenti di punteggio fenotipizzato per una valutazione accurata e affidabile dei tratti nettari. Inoltre, la visualizzazione dei tratti nettari tramite microscopia digitale previene o riduce i falsi positivi di popolazioni senza tratti nettari. Questa valutazione fenotipica del tratto nettario viene utilizzata anche negli studi di mappatura per identificare marcatori del DNA associati al tratto senza nettario che gli allevatori possono utilizzare per la selezione assistita da marcatori (MAS) del tratto senza nettario¹³. Questa tecnica di punteggio può essere estesa ad altre specie vegetali oltre allo studio di altri tratti come ghiandole, peli e colore. In generale, la valutazione digitale delle immagini non solo risolve il problema della valutazione inaccurata dei tratti nettari fornendo immagini ad alta risoluzione, ma identifica anche cambiamenti sottili di espressione e memorizza le immagini digitali per un uso futuro. Il cotone con la caratteristica senza nettari può essere utilizzato per il biocontrollo dei parassiti, oltre a rispondere a domande di ricerca su come questa caratteristica favorisca le interazioni benefiche con insetti.

Protocol

1. Campionamento di foglie in serra/campo (Figura 1)

1. Prepara sacchetti zip-lock per campioni con ID campione. Conserva i sacchetti campione a temperatura ambiente fino all'uso.
2. Metti il frigorifero in frigorifero un giorno prima della raccolta del campione. Metti una borsa di ghiaccio dal congelatore sul fondo del frigorifero. Metti una teglia di plastica sulla borsa del ghiaccio nel frigorifero.
   NOTA: Qualsiasi frigorifero portatile può essere utilizzato a questo scopo. Posizionare la borsa di ghiaccio nel frigorifero seguita da una vaschetta di plastica (questa separazione previene i danni da congelamento, che avviene per il contatto diretto del campione con il ghiaccio) prima di trasportare il raffreddatore al sito di raccolta del campione.
3. Trasporta sacchetti con zip lock e frecchiatori etichettati nella serra/campo per la raccolta dei campioni. Erano programmate regolarmente spruzzazioni per le piante da campo per raccogliere campioni privi di parassiti. Analogamente, per le piante in serra, sono state seguite regolarmente spruzzazioni e programmi di fertilizzante per le piante sane.
4. Raccogli tessuto fogliare giovane da una singola piante di cotone in serra o in campo di età tra 8 e 12 settimane in sacchi campioni etichettati.
   1. Seleziona la fase di fioritura centrale per la selezione del campione a causa della massima espressione del tratto nettario in questa fase. Seleziona le foglie giovani di tutte le piante in questa fase di sviluppo. Oltre all'influenza genetica e ambientale, il tratto nettario è influenzato anche dalla fase di sviluppo.
   2. Per mantenere costante lo stadio di sviluppo per il confronto tra i diversi genotipi all'interno della popolazione di_F2 , si raccolgono campioni di foglie in modo uniforme in una fase per limitare il confronto a questa fase. Usa la dimensione delle foglie di 5-7 cm come misura, ma le foglie giovani possono essere raccolte da tutti i campioni della stessa dimensione. Le foglie vecchie mostrano espressione del tratto nettario, ma in alcune linee il tratto nettario non si esprime nelle fasi successive dello sviluppo. Per evitare questa variazione e migliorare la coerenza della raccolta dei dati, segui queste istruzioni durante il prelievo dei campioni.
5. Raccogli il tessuto fogliare campione e mettilo nella rispettiva busta per il campione. Raccogli almeno 2 foglie per ogni campione di pianta.
6. Per il tessuto fogliare, seleziona foglie sane di 5-7 cm lungo la lama fogliare dal ramo superiore della pianta.
   NOTA: Le foglie giovani presenti sui rami superiori sono preferite per tutti i campioni. Questo tipo di raccolta del campione non solo limita il campionamento a una specifica fase dello sviluppo, ma riduce anche gli errori di fenotipizzazione mantenendo costante il tipo di campione. Altri parametri includono facile accesso e foglie sane. Un confronto coerente dei dati sarà effettuato quando vengono raccolte diverse foglie di piante dallo stesso stadio di sviluppo per identificare differenze fenotipiche basate sul genotipo nella popolazione.
7. Metti ogni sacchetto sigillato con il tessuto fogliare nel frigorifero. Trasporta il frigorifero in laboratorio.
8. Trasferire i singoli campioni nel frigorifero per mantenere condizioni di raffreddamento di 4 °C. Conserva i campioni in frigorifero fino all'imaging digitale del nettario. Le foglie possono essere conservate fino a 2 giorni per l'imaging digitale, ma si preferisce scattare immagini lo stesso giorno o il giorno successivo.
9. Per lo screening di un gran numero di campioni di foglie, raccogliere i campioni in lotti per completare l'imaging entro un giorno dopo il raccolto. Raccogli campioni in lotti da 10 a 20 o usa più dissipatori per prevenire danni ai tessuti o pieghe del tessuto. Bisogna prestare attenzione alla raccolta dei campioni per ottenere buone immagini digitali.

2. Campionamento di fiori in serra/campo (Figura 1)

1. Segui i passaggi da 1.1 a 1.6. Raccogli fiori da una serra di 8 a 12 settimane o da una pianta di cotone coltivata nei campi. Raccogli almeno 2 fiori per ogni campione di pianta.
   1. Raccogli fiori solitamente dai rami superiori quando le piante sono nella fase di fioritura media. Il tratto nettario mostra l'espressione più alta nella fase di fioritura media.
2. Scegli fiori sani. Metti ogni sacchetto campione sigillato con almeno due fiori nel frigorifero. Trasporta il frigorifero in laboratorio.
3. Trasferire i singoli campioni nel frigorifero per mantenere condizioni di raffreddamento di 4 °C. Conserva i campioni in frigorifero fino all'imaging digitale dei nettari bracteali.
   1. Processare i campioni lo stesso giorno o il giorno successivo alla raccolta. Raccogli campioni di fiori, conservali a 4 °C e lavora i nettari bracteali lo stesso giorno. Raccogli i fiori prodotti più tardi il giorno successivo o più tardi nella settimana e procedi per l'imaging digitale dei nettari bracteali lo stesso giorno.

3. Configurazione iniziale del microscopio digitale (Figura supplementare 1)

NOTA: Altri microscopi comparabili possono essere utilizzati per catturare e memorizzare digitalmente le immagini.

1. Accendi il microscopio (VHX 600) e completai i primi passaggi. Posiziona un foglio bianco A4 piegato a metà che corrisponda alle dimensioni dello stadio del microscopio.
2. Regola la luce sulla piattaforma/palco del microscopio usando le piccole manopole della luce presenti sul controller della console.
3. Gira l'interruttore della luce (piccola manopola sulla console) al massimo per la massima luminosità (manopola grande sulla console) su media alta girando la manopola della console per tre quarti.
4. Il software integrato VHX 600 mostra opzioni per regolare l'obiettivo sullo schermo del computer. Regola l'obiettivo a 10x selezionando l'opzione 10x sullo schermo. Accendi l'interruttore di alimentazione del monitor sullo schermo frontale del computer e apparirà il menu principale, che mostra le opzioni per l'obiettivo e l'immagine registra.
5. Prendere un piccolo numero di campioni (da 3 a 5) dal frigorifero nel frigorifero per l'imaging digitale. Metti il frigorifero con i campioni accanto al microscopio.
6. Tieni il tagliere e la lama sterile sul banco vicino al microscopio. Prendi un campione dal dissipatore e estrai il tessuto per procedere con l'imaging digitale (Figura 1).

4. Imaging digitale e punteggio del nettario delle foglie (Figura 2)

1. Segui i passaggi 1 e 3. Apri il sacchetto con zip lock per il campione e posiziona il campione di foglie sul tagliere. Taglia il picciolo della foglia usando una lama sterile.
   NOTA: Per un uso sicuro delle lame, indossa i guanti e tieni i bordi affilati della lama rivolti lontano dalle dita, posizionando il tessuto tra le dita durante le incisioni.
2. Trasferire il tessuto fogliare sul foglio bianco pretagliato posizionato sul palco. Capovolgi il tessuto fogliare al centro dello stadio del microscopio con il lato abassiale rivolto verso l'alto.
3. Concentrati sulla nervatura centrale della foglia ruotando delicatamente le regolazioni grossolane e fini delle manopole del microscopio. Continua a regolare finché non c'è più sfocatura nell'immagine.
4. Poiché il nettario è presente all'estremità inferiore della nervatura centrale, mantenelo centrato dove sono state osservate la nervatura centrale e le vene successive divergenti. Mantieni la foglia centrata e a fuoco sul palco.
   NOTA: Nel cotone domestico si osserva solo un nettario fogliare, mentre i tipi selvatici mostrano tre nettari, uno sulla nervatura centrale e uno su ciascun vena laterale ai lati della nervatura centrale (nettari totali :3).
5. Regola le regolazioni grossolane e fini del microscopio per migliorare la nitidezza dell'immagine digitale. Effettua tutte le modifiche dell'immagine per catturare e salvare l'immagine nettaria della foglia.
   1. Per evitare riflessioni di luce sull'immagine digitale, spegni tutte le luci e registra l'immagine sullo schermo del computer. Spegni tutte le luci della stanza e usa una lampada da tavolo per processare ogni campione. Dopo aver completato tutti i passaggi, spegni la lampada e lascia accesa solo la luce del microscopio e registra l'immagine.
6. Salva l'immagine una volta che il programma mostra una finestra che mostra diverse opzioni per salvare. Salva l'immagine (etichettando ogni immagine) con il numero ID del campione. Valuta l'immagine digitale del nettario fogliare come 1, 2, 3 e 4 in base al fenotipo del nettario. Aggiorna il tuo foglio di punteggio per ogni ID campione.

5. Imaging digitale e punteggio del nettario bracteale (Figura 3)

1. Segui i passaggi 2 e 3. Trasferire un piccolo numero di campioni di fiori (2-3) per l'imaging (imaging). Prendi il campione di fiore dal sacchetto zip-lock.
2. Rimuovere le brattee dal fiore usando una pinza o manualmente a mano. Metti il fiore sul tagliere pulito. Usa una lama sterile per tagliare il gambo del fiore. Usa una lama sterile per fare un'incisione dritta lungo il bordo delle bractee rimosse.
3. Posiziona il tessuto capovolto (con il picciolo rivolto verso l'alto) sul foglio bianco pretagliato posato sul palco del microscopio.
4. Usa regolazioni grossolane e fini per migliorare la nitidezza dell'immagine visualizzata sullo schermo. Effettua tutte le modifiche dell'immagine e clicca sul pulsante record sul controller della console per catturare l'immagine della foglia.
   1. Regolare l'immagine impostando la piccola manopola/interruttore della luce al massimo e la manopola grande/interruttore luminosità a media alta (girando la manopola a 3/4^{di th}). Successivamente, migliora la risoluzione dell'immagine ruotando le regolazioni grossolane e fini del microscopio. Mantieni costanti queste regolazioni e cambia campioni finché non vengono registrate le immagini per l'intero set di campioni. Per evitare riflessioni di luce sull'immagine digitale, spegni tutte le luci e registra l'immagine sul computer.
5. Successivamente, il programma richiama una finestra che mostra tutte le posizioni del computer per salvare l'immagine. Salva l'immagine digitale nel computer con il numero ID del campione.
6. Punteggiare i nettari bracteali (Figura Supplementare 2) con 1, 2, 3 e 4 in base al fenotipo osservato nelle immagini digitali acquisite. Aggiorna il foglio di valutazione con l'ID del campione e il rispettivo punteggio per analisi future

Results

Per questo studio sono state selezionate piante di cotone coltivate nel campo per 8-12 settimane. Sono state raccolte almeno due repliche tecniche per ciascuna pianta in base al tipo di tessuto. Campioni giovani e sani vengono raccolti dai rami superiori con lame fogliari lunghe da 5 a 7 cm. Campioni di fiori sani vengono raccolti da fiori aperti o boccioli che si apriranno lo stesso giorno. Campioni di foglie e fiori sono stati raccolti dal campo da diverse linee vegetali, e sono state generate immagini digitali per entrambi i tipi di tessuto in laboratorio utilizzando un microscopio (Figura 1). Tutti i passaggi sono stati seguiti come descritto sopra nella procedura, dalla raccolta del campione all'imaging (come spiegato nella Figura 2 e nella Figura 3). I risultati rappresentativi sia per i nettari fogliari che per quelli bracteali mostrano tipicamente l'assenza di nettario (1), la presenza di nettari con fenotipi intermedi (2, 3) e nettari completamente sviluppati che producono nettare (4). I dati generati nella Figura 4 sono le immagini digitali acquisite da due diverse piante di cotone (nettariate e senza nettari). I risultati della valutazione digitale delle immagini della superficie abassiale della foglia (sul lato inferiore della nervatura centrale) hanno mostrato due fenotipi con punteggi 1 (senza nettari sulla nervatura centrale) e 4 (con nettario completamente sviluppato con nettare; Figura 4A,B). Analogamente, quando i campioni di fiori sono stati analizzati per nettari bratecali, sono stati evidenziati due fenotipi di 1 (senza nettario) e 4 (nettare che produce nettare completamente formato; Figura 4C,D). Idealmente, sia le foglie che i fiori raccolti dalla stessa pianta dovrebbero seguire lo stesso schema, il che significa che la foglia e il fiore senza nettario dovrebbero appartenere a una sola pianta, mentre la foglia nettariata e il fiore nettariato dovrebbero appartenere alla stessa pianta. La Figura 5 è prodotta raccogliendo immagini digitali sia delle foglie che dei nettari bracteali delle piante nettarie a 10x, 20x e 40x per visualizzare chiaramente i tratti nettari. Inoltre, per comprendere come questa valutazione venga data nella segregazione delle popolazioni F₂ di genitori di cotone nettariato e privo di nettari, sono stati raccolti tessuti fogliari da una di queste popolazioni e sono state prodotte immagini digitali per ogni campione di nettario fogliare. Le immagini digitali a foglia selezionate corrispondenti al punteggio standard di 1, 2, 3 e 4 sono evidenziate nella Figura 6¹³. Il modello comune e facile da identificare è l'assenza di nettario e la presenza di nettario. L'assenza di nettario riceve il punteggio più basso, mentre un nettario completamente sviluppato riceve il punteggio più alto di 4. L'intervallo di punteggi tra 1 e 4, ovvero 2, 3, è poco sviluppato e inferiore rispetto ai nettari normali. Questo schema si osserva in nettari omozigoti senza nettari, ovvero 1 (assente), condizioni eterozigoti come in 2 e 3 punteggi (nettari ridotti) e 4 nettari (completamente sviluppati). Inoltre, possono essere coltivate linee genitoriali nettarie e prive di nettari insieme alle popolazioni per confrontare e comprendere queste differenze.

Figura 1: Panoramica dei passaggi di visualizzazione dei nettari fogliari e bracteali, a partire dal campionamento alla microscopia digitale. (A) Selezionare le piante di cotone a metà fioritura per la raccolta sia di foglie che di campioni di fiori. (B) Raccogliere campioni di foglie dal campo per osservare i tratti nettari sulla foglia. (C) Girare la foglia in modo che il lato abassiale della foglia sia rivolto verso l'alto e osservare il tratto nettario nella regione della scatola nera evidenziata. (D) Posizionare la foglia sul palco del microscopio e mantenere la messa a fuoco nella regione della scatola nera evidenziata per registrare immagini digitali del nettario della foglia. (E) Raccogliere fiori a metà fioritura dal campo (A). (F) Fare un'incisione posizionando il fiore su un tagliere e incidere in linea retta nella zona della scatola bianca in direzione della freccia, separando la base del fiore. (G) Posizionare la sezione incisa sul palco del microscopio per l'imaging digitale dei nettari bracteali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Procedura a passo per l'imaging digitale e la registrazione dei nettari fogliari nel cotone. 1. Raccogliere materiale fogliare dal campo in sacchetti campioni etichettati e metterlo in un frigorifero 2. Trasporta il frigorifero con i campioni al laboratorio 3. Prendi i singoli campioni dal dissipatore 4. Apri il singolo sacchetto campione e estrai la foglia 5. Taglia manualmente il piccololo della foglia o usa una lama. 6. Posizionare la foglia sul palco del microscopio preimpostato con il lato abassiale (inferiore) rivolto verso l'alto 7. Regola lo zoom a 10x nel programma VHX 600 dello schermo del computer. Regola le regolazioni grossolane e fini del microscopio per ottenere la migliore risoluzione dell'immagine. 8. Guarda lo schermo del computer per eventuali modifiche dell'immagine osservata sullo schermo (regola luce e luminosità controllate da manopole piccole e grandi ruotando queste manopole, usa pulsanti fini e grossolani sul microscopio per la migliore risoluzione dell'immagine, e spegni altre luci per rimuovere riflessioni, ecc.) nel nettario delle foglie 9. Salva l'immagine digitale per il punteggio. Il cerchio trattino attorno al nettario nella foglia evidenzia la regione del nettario fogliare nelle immagini 8 e 9. Osserva i nettari delle foglie al microscopio a un ingrandimento di 10x (100 μm). Nel cotone domestico si osserva solo un nettario fogliare (come si osserva in questa immagine). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Procedura a passo per l'imaging digitale e la registrazione dei nettari bracteali nel cotone. 1. Raccogliere campioni di fiori dal campo nei sacchetti etichettati e conservarli nel frigorifero 2. Rimuovi un campione dal dissipatore 3. Togli un fiore 4. Rimuovi manualmente le bractee tagliandole lontano dal fiore 5. Effettuare un'incisione con una lama sterile tagliando lungo il bordo bracteale in linea retta (riquadro bianco mostrato nella Figura 1 prima di passare all'imaging digitale dei nettari brateali) 6. Capovolgi la sezione incisa 7. Posiziona la sezione incisa con il lato del piccolo rivolto verso l'alto sul palco del microscopio stadio 8. Effettua regolazioni della luce usando gli interruttori di luce e luminosità sulla console collegata al microscopio. Usa regolazioni grossolane e fini al microscopio per raccogliere immagini con buona risoluzione. Tutte le immagini vengono osservate al microscopio con un ingrandimento di 10x (100 μm). Raccogli immagini digitali per puntare i nettari bracteali. I cerchi nelle immagini digitali del nettario bracteale evidenziano la presenza di nettario, e ci sono 3 nettari bracteali nel cotone domestico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Immagini digitali di nettario di foglie di cotone e nettario bracteale. (A) Foglia con nettario; (B) Foglia senza nettario; (C) Fiore che mostra 3 nettari bracteali, e (D) Fiore che non mostra nettari bracteali. Osserva sia i nettari delle foglie che dei fiori al microscopio con un ingrandimento di 10x (100 μm). I cerchi a trattino mostrano la presenza e l'assenza di nettario nei nettari fogliari e nei nettari bracteali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: I nettari fogliari e bracteali sono stati zoomati a 10x, 20x e 40x per una chiara identificazione dei nettari nelle immagini digitali. (A) Raccogliere campioni di foglie per osservare la caratteristica nettaria sulla nervatura centrale. (B) Osservare il nettario fogliare sulla nervatura centrale al microscopio a un ingrandimento di 10x. (C) Osservare il nettario delle foglie sulla nervatura centrale al microscopio a un ingrandimento di 20x. (D) Osservare il nettario delle foglie sulla nervatura centrale al microscopio a un ingrandimento di 40x. (E) Incidere la sezione del fiore per i nettari bratecali. (F) Osservare nettari bratecali al microscopio a un ingrandimento di 10x. (G) Osservare nettari bratecali al microscopio a un ingrandimento di 20x. (H) Osservare nettari bratecali al microscopio a un ingrandimento di 40x. Le barre di scala su ogni immagine rappresentano l'ingrandimento a cui sono state scattate le immagini del nettario fogliare o del nettario bracteale (come mostrato qui come 10x, 20x e 40x). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Schema standard di punteggio del nettario fogliare seguendo i modelli 1,2,3 e 4. (A) Campione di foglie senza nettario come evidenziato nei cerchi tratteggiati (Punteggio 1 per l'assenza di nettario). (B) Il nettario delle foglie piccole osservato mostra un modello di una delle condizioni eterozigoti (immagine cerchio tratteggiata del nettario punteggiata come 2). (C) nettario fogliare con punteggio 3, un altro schema dell'eterozigote. (D) nettari completamente formati con un punteggio di 4. La scala 10x rappresenta l'ingrandimento a cui sono state scattate le immagini. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: nettario delle foglie e nettari bracteali senza usare un microscopio. La figura raffigura come appaiono i nettari con la tradizionale partitura. Questa cifra è stata adattata da¹³. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Possibili genotipi della popolazione La figura mostra i genotipi delle popolazioni F₂ derivanti da un incrocio di genitori diversi, nettariati e senza nettari. Questa tabella è stata adattata da¹³. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Configurazione del microscopio digitale. Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare 2: Diverso numero di nettari bracteali osservati. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

I nettari sono tricomi ghiandolari specializzati che producono nettare nelle piante per un successo di impollinazione incrociata. Sia nettari vegetativi che riproduttivi sono presenti nelle piante. Il genere Gossypium (cotone) conta più di 50 specie, e la maggior parte di esse contiene¹⁶ nettari fogliari. Tuttavia, questa caratteristica nel cotone attira anche parassiti, causando ulteriori perdite di^{raccolta 17}. Gli allevatori selezionarono tratti naturalmente esistenti senza nettari (assenza di nettari) scoperti per la prima volta in G. tomentosum per risolvere questo problema. Per questo motivo, introdussero questa caratteristica senza nettario nel cotone coltivato delle zone^{montagne 17}. Alla fine, diverse popolazioni sono state generate selezionando linee nettarie e senza nettari come genitori. Poiché le popolazioni omozigoti senza nettari ed eterozigoti non mostrano differenze quando osservate a occhio nudo, è necessario uno strumento speciale per differenziare queste piante. Pertanto, questo metodo di punteggio tramite microscopia digitale, a differenza della puntatura tradizionale (come mostrato nella Figura 7), non solo visualizza la riduzione dei nettari, ma previene anche una valutazione imprecisa delle piante eterozigoti senza nettari come piante omozigoti senza nettari.

La valutazione fenotipica tramite immagini digitali dipende da diversi fattori chiave, come il momento specifico della raccolta del campione, la selezione del campione, l'uso di una scala standard per i nettari fogliari e bratteali, il possibile genotipo e come i dati di punteggio possano essere interpretati per applicazioni a valle. Innanzitutto, è importante raccogliere foglie e fiori durante la stagione di crescita, quando la secrezione nettaria è più alta, generalmente a metà fioritura a luglio. In secondo luogo, la scelta di foglie o fiori nella giusta dimensione e stadio gioca un ruolo fondamentale nella punteggio fenotipico. Per le foglie, i rami superiori con lame fogliari lunghe da 5 a 7 cm sono stati preferiti per la scavatura dei nettari fogliari. Analogamente, per i nettari bracteali che scoprono i punti, sono stati scelti i fiori sani dai rami superiori. La selezione del campione in specifiche fasi dello sviluppo aiuta, anche confrontando tutte le piante all'interno di una popolazione escludendo le espressioni di tratti dipendenti dallo stadio di sviluppo (come mostrato nella Figura 8). Per verificare se la punteggio è ripetibile, sono state generate immagini digitali per almeno due campioni per tessuto e pianta. Raccogliere più repliche della stessa pianta aiuta a una raccolta coerente dei dati.

Il possibile limite del metodo è mantenere le piante libere dai parassiti fino alla raccolta del campione. Le aree infestate da parassiti possono essere identificate da chiazze di tessuti o uova deposte nei tessuti o da danni alle regioni nettarie con aree nere senza apparente nettario a causa del loro consumo da parte di afidi o altri insetti. Questo è stato osservato durante lo screening di centinaia di campioni. In tali casi, foglie e fiori sani sono stati raccolti nuovamente e analizzati per ottenere dati coerenti da quei campioni. Questo può essere risolto mantenendo regolarmente programmi di controllo dei parassiti e integrando fertilizzanti per ottenere piante sane. Seguire tutti i passaggi critici descritti aiuterà nella risoluzione dei problemi per il punteggio fenotipico.

Questa tecnica ha diverse applicazioni, come la mappatura per identificare marcatori del DNA che aiutano gli allevatori a individuare i genotipi per la selezione assistita dai marcatori. Questo punteggio fenotipico richiede la conferma da marcatori del DNA a causa delle influenze ambientali e dello stadio di sviluppo, oltre che dei geni che controllano questa caratteristica. Pertanto, la fenotipizzazione di questo tratto tramite microscopia digitale sarà un punto di partenza per restringere un gran numero di piante provenienti da diverse popolazioni a un piccolo numero di linee sospette senza nettari. Utilizzando marcatori di DNA, queste linee vengono ulteriormente validate per l'uso in programmi di selezione al fine di sviluppare una resistenza alle malattie mediata da caratteri senza nettari in varietà di nuova evoluzione. Questo metodo può anche aiutare i ricercatori a comprendere il ruolo del tratto nettario nelle piante e le interazioni benefiche con insetti.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio digitale	Keyence VHX	VHX 600	Possono essere utilizzati altri microscopi
Tagliere Farberware	Farberware	Modello n. 78892-10	14''L x 11''Wide X 0,5''Th, può essere usata qualsiasi marca, questa è disponibile a amazon.com
Igloos Laguna piccolo raffreddatore 9 QT	Igloo	Numero di parte 00043567	Qualsiasi marca o qualsiasi dimensione in base alle esigenze del progetto può essere utilizzata
Sacchetti di plastica (400 pezzi), 3 x 4 pollici	Marchio Aubeco	NA	4''L x 3''L X 0,01''H, può essere usata qualsiasi marca, preferendo quelle trasparenti in plastica
Singola e nbsp; Lame da rasoio da filo, confezione da 100	Weupe	NA	Qualsiasi marca può essere utilizzata, questa è disponibile a amazon.com