Standardizzazione biologica della biofabbricazione umana basata su ASC per costrutti tissutali su scala macro riproducibili

Sommario

Questo studio presenta un flusso di lavoro di biofabbricazione riproducibile utilizzando sferoidi di cellule staminali derivate dall'adipo e impalcature GelMA stampate in 3D. Dimostra il controllo spaziale, la capacità di fusione e metriche di controllo qualità, dando origine a costrutti tissutali su scala macro trapiantabili con potenziali applicazioni nella medicina rigenerativa.

Abstract

La mancanza di protocolli standardizzati tra i laboratori rappresenta una barriera significativa alla comparabilità dei risultati sperimentali e al trasferimento efficiente delle tecnologie di biofabbricazione. Una rigorosa standardizzazione biologica non solo migliora la riproducibilità, ma facilita anche l'allineamento con i quadri normativi nazionali e internazionali, essenziali per la traduzione clinica delle strategie di ingegneria tissutale. Questo studio introduce un flusso di lavoro standardizzato di biofabbricazione che comprende la coltura monostrato di hADSC, la formazione di sferoidi, la stampa 3D di impalcature di Gelatina Metacriloile (GelMA) e il bioassemblaggio di sferoidi. Sono state integrate metriche di controllo qualità per garantire la riproducibilità. L'impalcatura GelMA stampata in 3D fu progettata con due pori centrali, ciascuno capace di ospitare centinaia di sferoidi. La fedeltà di stampa è stata confermata confrontando le dimensioni dell'impalcatura con il modello CAD, con piccole deviazioni non significative. Gli hADSC formavano sferoidi uniformi entro 24 ore in microstampi di agarosio. Quando sono stati seminati nei pori impalcaturati, gli sferoidi hanno subito una fusione continua per 72 ore, formando costrutti su scala macro confermati dall'imaging confocale. Il design dell'impalcatura e la precisione nella stampa garantivano un supporto strutturale, mentre l'uniformità degli sferoidi permetteva la formazione prevedibile del costrutto. La fusione degli sferoidi all'interno dei pori impalcatrici ha prodotto costrutti tissutali adatti al trapianto, con o senza impalcatura, evidenziando la versatilità di questo approccio di bioassemblaggio. I risultati sottolineano il ruolo fondamentale della standardizzazione biologica nell'avanzare delle metodologie riproducibili per la biofabbricazione di costrutti di tessuto vivente, con promettenti implicazioni per future applicazioni cliniche nella medicina rigenerativa.

Introduzione

Bioassemblaggio e biostampa sono approcci complementari di biofabbricazione nell'ingegneria tissutale che si concentrano sulla costruzione di tessuti e organi complessi su scala macro utilizzando tecnologie^{automatizzate} 1,2,3,4.

Gli sferoidi sono stati incorporati nella biofabbricazione come mattoni fondamentali principalmente per approcci di^{bioassemblaggio 5}. Gli sferoidi sono considerati microtessuti che riproducono le interazioni tra cellule e il microambiente tissutale circostante in vivo. Tra le fonti cellulari utilizzate per la formazione degli sferoidi, le cellule staminali derivate da adiposi (ADSC) si distinguono per la facilità di isolamento, il mantenimento della coltura a lungo termine e il potenziale di differenziazione ^6,7,8.

Grazie alla loro capacità intrinseca di formare aggregati più grandi, gli sferoidi possono generare costrutti tissutali più complessi quando sottoposti ad approcci di bioassemblaggio. Questa organizzazione guidata dalla fusione potenzia il potenziale rigenerativo e di differenziazione degli sferoidi delle cellule^{staminali 9,10}.

Il bioassemblaggio degli sferoidi può essere supportato o addirittura guidato dai biomateriali¹¹, rendendo questa strategia adatta per la biofabbricazione scalabile^{e automatizzata 12,13.}

Le strategie di biofabbricazione esistenti possono essere ampiamente suddivise in approcci di assemblaggio sferoidi senza impalcature e sistemi di biostampa embedded^{in idrogel 2,5,14}. I metodi senza impalcature si basano esclusivamente sull'auto-assemblaggio cellulare spontaneo e sulla fusione intersferoide, sfruttando interazioni cellula-cellula intrinseche. Tuttavia, poiché avvengono senza una guida architetturale esterna o confinamento geometrico, questi approcci mostrano un controllo spaziale ridotto e una prevedibilità strutturale^{inferiore 5,15}. Al contrario, gli approcci di incapsulamento basati su idrogel incorporano le cellule all'interno di matrici di massa per fornire supporto strutturale e un'architettura^{predefinita 16,17}, che può parzialmente limitare il contatto diretto cellula-cellula durante le prime fasi di fusione e influenzare la dinamica della migrazione^{cellulare 18}. In questo contesto, biomateriali stampabili come il Gelatin Methacryloill (GelMA) presentano motivi di adesione cellulare e possono fungere da impalcature per facilitare il bioassemblaggio degli^{sferoidi 19}. Si ipotizza che un impalcatura GelMA stampata in 3D fornisca confinamento geometrico e guida spaziale per gli sferi, favorendo così la formazione controllata dei tessuti tramite fusione in costrutti più grandi e strutturalmente definiti. Questo approccio mira a migliorare il controllo spaziale e la riproducibilità strutturale durante il bioassemblaggio degli sferoidi combinando l'organizzazione guidata da impalcature con la fusione degli sferoidi all'interno di un'architettura idrogel definita. Tuttavia, l'attuale flusso di lavoro si concentra sulla standardizzazione dei processi e sui parametri di biofabbricazione strutturale e non affronta la maturazione a lungo termine dei tessuti, la differenziazione funzionale o la produzione automatizzata su larga scala.

La standardizzazione biologica è essenziale non solo per garantire riproducibilità e scalabilità, ma anche per preservare l'integrità funzionale dei tessuti^{biofabbricati 19,20}. Di conseguenza, un controllo preciso dei parametri ingegneristici, geometrici e strutturali è fondamentale, poiché questi fattori influenzano direttamente le prestazioni biologiche, inclusa la funzione tissutale e la maturazione ^5,21. Viene presentato un flusso di lavoro di biofabbricazione standardizzato e riproducibile, che comprende i seguenti passaggi chiave: (1) coltura monostrato ASC; (2) formazione sferoide ASC; (3) stampa 3D dell'impalcatura GelMA; e (4) bioassemblaggio sferoideo (Figura 1). All'interno di questo flusso di lavoro, sono state stabilite metriche di controllo qualità oggettive, tra cui uniformità e sfericità degli sferoidi, fedeltà di stampa e integrità della forma del pontificatore.

Protocollo

I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione di microstampi di agarosio e fabbricazione di impalcature stampate in 3D con GelMA

1. Produzione del microstampo di agarosio al 2% in soluzione di cloruro di sodio (NaCl) allo 0,9% (vedi Figura 2A)
   NOTA: Tutti i rifiuti chimici devono essere gestiti e smaltiti in conformità con le normative istituzionali sulla sicurezza chimica e le linee guida sui rifiuti pericolosi.
   1. Prepara una soluzione di NaCl allo 0,9% in acqua ultrapura e autoclave per 30 minuti a 121 °C. Conserva in condizioni sterili fino all'uso.
   2. Diluire 1 g di agarosio ultrapuro sterile in 50 mL di soluzione di NaCl allo 0,9%. Omogeneizzare e depolimerizzare l'agarosio in un microonde a intervalli di 10 secondi per 3–5 cicli, fino a disciolto.
   3. In un armadietto di sicurezza biologica, posizionare uno stampo in silicone disponibile commercialmente contenente 81 rientri circolari su garza sterile.
   4. Deposa con cura 600 μL di agarosio al centro dello stampo in silicone e lascialo riposare per 40 minuti per garantire una polimerizzazione completa.
   5. Smallare con cura il microstampo di agarosio completamente polimerizzato e trasferirlo in un pozzo di una piastra microtitolata a 12 pozzi.
   6. Regolare la posizione del microstampo di agarosio e fissarlo sul fondo del pozzo riempiendo con 600 μL di agarosio.
   7. Pre-incubare il microstampo incubando con Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucosio (DMEM, 2 mL/pozzo) per 15 minuti. Ripetere questa procedura due volte e, nella terza incubazione, sostituirla con il mezzo di coltura tridimensionale (3D), composto da DMEM integrato con acido ascorbico (50 μg/mL), albumina sierica umana (1,25 μg/mL), penicillina-streptomicina (PS, 1×, da una soluzione al 100×) e integratore ITS (1×, da soluzione al 100×).
      NOTA: Il mezzo di coltura 3D si differenzia dal mezzo di espansione monostrato per l'assenza del Siero Bovino Fetale (FBS) e per l'inclusione di integratori definiti che promuovono l'interazione cellula-cellula e il supporto della matrice extracellulare, favorendo un correttono autoassemblaggio e stabilizzazione degli sferoidi. Se la produzione di muffe e la placcatura cellulare vengono eseguite in giorni diversi, la procedura può essere interrotta dopo la seconda incubazione DMEM e le muffe dovrebbero essere conservate in condizioni sterili in un incubatore umidificato a 37 °C per un massimo di 5 giorni. La terza incubazione con mezzo di coltura 3D deve essere eseguita solo il giorno della placcazione. Prima di seminare le cellule, rimuovi completamente il substrato sia dal pozzo che dal microstampo.
2. Preparazione dell'idrogel di Gelatina Metacriloile (GelMA)
   NOTA: L'intera procedura dovrebbe essere eseguita al buio, poiché i reagenti sono fotosensibili. In questo studio sono stati utilizzati GelMA (forza del gel 300 g Bloom, grado di sostituzione 60%) e il fotoiniziatore fenil-fenil-2,4,6-trimetilbenzilfosfinato (LAP). Per preparare 10 mL di una soluzione GelMA al 10% w/v contenente 0,5% w/v LAP:
   1. Sciogliere 50 mg di polvere LAP in 1 mL di DMEM, mescolando delicatamente con una pipetta fino a ottenere una soluzione trasparente e omogenea.
   2. Trasferire la soluzione LAP in un tubo centrifugo contenente 9 mL di DMEM e mescolare accuratamente.
   3. In un armadietto di sicurezza biologica, sterilizza la soluzione risultante tramite filtrazione attraverso un filtro da 0,22 μm.
   4. Aggiungere 1 g di GelMA alla soluzione e omogeneizzare tramite mescolamento magnetico a 50 °C per circa 3 ore, oppure fino a ottenere una soluzione chiara e omogenea. Tieni la fiaschetta alla luce per assicurarti che la soluzione sia libera da particelle visibili e torbidità.
   5. Carica l'idrogel risultante in una siringa da 10 mL per la stampa successiva oppure, se non viene usata immediatamente, conservala a 2–8 °C, protetta dalla luce, fino all'uso.
      NOTA: Le soluzioni GelMA e LAP sono state utilizzate circa 24 ore dopo la preparazione. Non è consigliata una conservazione prolungata di questa soluzione. Sia le polveri GelMA che LAP devono essere conservate a 2–8 °C, secondo le istruzioni del produttore. Il fotoiniziatore LAP è classificato come non pericoloso secondo standard come ABNT NBR 14725 e il Regolamento (EC) nº 1272/2008. Tuttavia, il produttore raccomanda l'uso di dispositivi di protezione individuale per prevenire irritazioni respiratorie, cutanee e oculari. Si raccomanda l'uso di occhiali di sicurezza testati e approvati in conformità con gli standard governativi pertinenti, come NIOSH (National Institute for Occupational Safety and Health - US) o EN 166 (EU), così come guanti in gomma nitrilica con uno spessore minimo di 0,11 mm. La protezione respiratoria è necessaria solo quando si genera polvere. Le raccomandazioni del produttore riguardo alla protezione respiratoria con filtro si basano su standard come DIN EN 143, DIN EN 14387 e altri standard complementari relativi al sistema specifico di protezione respiratoria in uso. Il produttore raccomanda l'uso di un filtro tipo P1.
3. Progettazione del modello 3D, slicing e generazione del file G-code
   NOTA: Il modello 3D di impalcatura è stato progettato utilizzando il software online di progettazione assistita da computer (CAD) Tinkercad. Per questo protocollo fu generato un impalcatura cilindrica con un diametro di 15 mm, uno spessore del fondo di 1 mm e due pori circolari, ciascuno con un diametro di 5,50 mm e una profondità di 2 mm.
   1. Una volta completato il design del modello 3D, esportalo come file *.stl (File Supplementare 1).
   2. Apri il software Repetier-Host V2.3.2, che verrà usato per tagliare il modello progettato.
   3. Nella scheda "Slicer", seleziona l'opzione slicer desiderata. In questo studio è stato utilizzato il CuraEngine .
   4. Configura il profilo parametro appropriato. In quest'opera, Velocità 10 mm/s; Altezza dello strato 0,2 mm; Modello di riempimento: griglia; Furono utilizzati un diametro dell'ugello di 0,41 mm.
   5. Carica il file *.stl del modello 3D da stampare.
   6. Nella scheda "Slicer", seleziona la configurazione precedentemente creata.
   7. Clicca su "Slice con CuraEngine". Il modello 3D tagliato verrà poi visualizzato nell'interfaccia software.
   8. Clicca su "Salva nel file" per salvare il file G-code nella posizione desiderata.
4. Stampa 3D di impalcature in idrogel Gelatina Metacriloile (GelMA) per bioassemblaggio sferoideo
   NOTA: La stampa 3D deve essere eseguita in condizioni sterili. Pertanto, prima di iniziare il processo di stampa, verifica che l'armadietto di sicurezza biologica che ospita la stampante sia acceso e che il flusso d'aria funzioni correttamente. Conferma che l'altezza del vetro di protezione dell'armadio sia uguale alla marcatura del sensore dell'apparecchiatura.
   1. Rimuovi i blocchi di sicurezza dalla biostampante.
   2. Rimuovi la lastra di vetro dal piano di stampa rilasciando le clip metalliche.
   3. Attacca una guida acrilica dalla forma appropriata per supportare la fissazione della piastra di coltura sulla piattaforma di stampa, usando le clip metalliche.
   4. Collega la stampante alla fonte di alimentazione. Si noti che questa apparecchiatura supporta doppia tensione (110/220 V).
   5. Collega il cavo USB della stampante al computer.
   6. Premi il pulsante on/off per accendere la stampante.
   7. Apri il software Repetier-Host V2.3.2, che verrà utilizzato per visualizzare il modello 3D e stampare.
   8. Clicca sull'opzione "Collega" nell'interfaccia software.
   9. Utilizzando il controllo manuale software, seleziona l'estrusore (1 o 2) e invia la testina di stampa alla posizione di origine (X = 0, Y = 0, Z = 0).
   10. Regola l'estrusore selezionato per un adattamento corretto della siringa usando lo strumento appropriato del controllo manuale in Repetier.
   11. Inserire con cura la siringa nell'estrusore, già caricata di idrogel e fissata a un ugello di estrusione (in questo studio abbiamo utilizzato un ugello conico in polipropilene con diametro interno di 0,41 mm).
   12. Inserisci la piastra di coltura nella guida acrilica attaccata al piano di stampa.
   13. Regola la posizione Z home (Z = 0) usando la vite di fermata Z situata sul lato sinistro della bioprinter. Cioè, imposta la distanza desiderata tra l'ugello di estrusione e la superficie di stampa. Idealmente, l'ugello dovrebbe toccare leggermente il substrato, che in questo studio era la piastra di coltura.
   14. Riporta la testina di stampa nella posizione principale.
   15. Carica il file G-code generato in precedenza.
   16. Utilizzando lo strumento di controllo manuale appropriato nel software, estrusca un po' dell'idrogel dalla siringa per garantire il flusso del materiale attraverso l'ugello.
   17. Inizia il processo di stampa.
   18. Dopo la stampa, eseguire il fotocrossing dell'impalcatura risultante utilizzando il sistema di luce UV della biostampante 3D, dotato di due LED a 395-400 nm. Esponi l'impalcatura alla luce UV per 5 minuti (intensità luminosa di 20 mW/^cm2).
   19. Utilizzare la stessa soluzione di agarosio al 2% depolimerizzato utilizzata per la fabbricazione dei microstampi per fissare le impalcature stampate in 3D ai pozzi di una piastra di coltura a 12 pozzi. Fissare gli impalcature al fondo dei pozzi è necessario per garantire maggiore stabilità e prevenire lo spostamento durante la semina degli sferoidi e durante tutto il periodo di coltura.
       NOTA: Durante il passaggio 4.16, verifica se l'idrogel forma un filamento continuo durante l'estrusione. Tipicamente, la soluzione di gelatina viene caricata nella siringa mentre è ancora allo stato liquido (circa 37 °C). Nel giro di pochi minuti a temperatura ambiente (22–25 °C), questo biomateriale inizia a trasformarsi in una consistenza simile a un gel. Il materiale non dovrebbe gocciolare durante l'estrusione, poiché questo influirebbe negativamente sulla qualità della stampa. La formazione continua del filamento durante l'estrusione indica che l'idrogel ha raggiunto una consistenza ottimale per la stampa. La soluzione GelMA e LAP diluita in DMEM presenta una colorazione leggermente arancione. Dopo il fotoincrocio indotto dai raggi UV, si osserva comunemente un cambiamento di colore, con il materiale che diventa biancastro o traslucido, come mostrato nella Figura 3D,E. Quando si utilizza il sistema UV, gli occhiali di sicurezza sono obbligatori per garantire un'adeguata protezione oculare contro le radiazioni ultraviolette.
5. Analisi della fedeltà di stampa
   NOTA: L'analisi di fedeltà della stampa 3D delle impalcature GelMA considera i seguenti parametri: diametro dell'impalcatura, diametro dei pori e spessore dell'impalcatura. Per eseguire le misurazioni è stato utilizzato il software ImageJ Versione 1.54.
   1. Innanzitutto, cattura immagini delle impalcature osservate da uno stereomicroscopio. Usa un righello o un calibro come riferimento.
   2. Prima di analizzare le immagini, calibra e imposta la scala in ImageJ per effettuare le misurazioni.
   3. Usa lo strumento a linea retta per eseguire le misurazioni.
   4. Poiché sia la forma dell'impalcatura che dei pori sono circolari, si utilizza la media aritmetica dell'impalcatura e dei diametri dei pori per l'analisi statistica.
   5. Per l'analisi della fedeltà di stampa, confrontare le misurazioni ottenute da ImageJ dagli impalcature stampate con i valori definiti nel modello 3D generato da Tinkercad.
      NOTA: Lo spessore misurato dell'impalcatura stampata viene confrontato con la somma dei valori di profondità dei pori e spessore del fondo proiettati in Tinkercad.
   6. Eseguire un'analisi statistica dei dati ottenuti. In questo caso, per confrontare i valori misurati dell'impalcatura con i valori attesi, si può utilizzare il test Mann-Whitney U (non parametrico). Il test di Shapiro-Wilk viene utilizzato per valutare la normalità. Le differenze sono considerate statisticamente significative quando p < 0,05.

2. Preparazione degli hADSC e della formazione degli sferoidi

NOTA: Le cellule staminali mesenchimali derivate dall'adiposo umano disponibili in commercio (hADSC) sono state coltivate in un mezzo di crescita specifico per cellule e sono passate con confluenza dell'80%–90% secondo le raccomandazioni del produttore. Le cellule sono state utilizzate fino al passaggio 7 per questo protocollo. Tutti i rifiuti biologici devono essere adeguatamente decontaminati o sterilizzati prima dello smaltimento e gestiti secondo le linee guida istituzionali per la biosicurezza. Per una successiva visualizzazione confocale, il monostrato dovrebbe essere etichettato con un colorante fluorescente prima della formazione della sferoide e incubato come raccomandato dal produttore. La formazione degli sferoidi può essere avviata 30 minuti dopo l'etichettatura.

1. Tripsinizzazione del monostrato ASC
   1. In un armadietto di sicurezza biologica, apri la fiaschetta di coltura e trasferisci il suo contenuto in un contenitore di rifiuti.
   2. Lava il monostrato due volte con 1× di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e scarta la soluzione.
   3. Aggiungere una soluzione di tripsina/EDTA allo 0,125% sufficiente a coprire il monostrato. Chiudi la fiaschetta e incuba in un incubatore umidificato a 37 °C per un massimo di 5 minuti.
   4. Inattivare la tripsina/EDTA aggiungendo un volume uguale di DMEM integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS).
   5. Raccogli la sospensione cellulare usando una pipetta sierologica o trasferisci su tubi centrifughe. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (20–25 °C).
   6. Scartate con cura il soprandanante.
   7. Risospensi la pellet cellulare in DMEM e omogeneizza. Prendi un'aliquota per il conteggio delle cellule e la valutazione della vitalità.
2. Cultura sferoide (vedi Figura 2B)
   1. Separare il numero appropriato di celle da placcare per ogni stampo in un tubo centrifuga da 15 mL. Per gli hADSC, ogni stampo di agarosio contenente 81 rientri dovrebbe ricevere 1 × 10⁶ celle—un micropozzo si forma uno sferoide, producendo 81 sferoidi per microstampo.
   2. Aggiungi 1× PBS e centrifuga a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il soprantantante e aggiungere 1× PBS. Ripeti questo passaggio due volte.
   3. Dopo la terza centrifugazione, scartare con cura il surnatante e asciugare l'apertura del tubo con una garza sterile prima di riportarla in posizione verticale.
   4. Sospendere il pellet cellulare in 120 μL di mezzo di coltura 3D per la coltura degli sferoidi e omogeneizzare. Regolare il volume di sospensione a 200 μL con un ulteriore mezzo di coltura 3D se necessario.
      NOTA: Ogni stampo con 81 resezioni ha una capacità di 200 μL.
   5. Aspirare 200 μL e placcare con attenzione al centro dello stampo, evitando la formazione di bolle.
      NOTA: Questo passaggio può essere automatizzato utilizzando un sistema robotico di pipetaggio, come descritto^{in precedenza 22}.
   6. Lascia la piastra nell'armadietto di sicurezza biologica per 5 minuti per permettere alle cellule di depositarsi nelle resezioni.
   7. Metti il piatto in un incubatore umidificato per 40 minuti.
   8. Dopo questo periodo, aggiungi con cura 2 mL di medium 3D a ciascun pozzo. Riportare la piastra nell'incubatore umidificato a 37 °C.
3. Misurazione degli sferoidi e analisi statistica
   1. Cattura immagini degli sferoidi posizionati lungo le due diagonali del microstampo di agarosio, formando un motivo a "X", utilizzando un microscopio ottico rovesciato dotato di una fotocamera digitale e di un obiettivo a 10×. Usa la barra della scala da 100 μm per calibrare la scala dell'immagine prima di misurare i diametri.
   2. Per determinare i diametri maggiori e minori degli sferidi, si utilizza lo strumento "lineare" del software ed esegui due misurazioni perpendicolari per ciascun sferoide fotografato, con un angolo approssimativo di 90° tra di essi.
   3. Calcola il diametro medio di ciascun sferoide come media aritmetica dei due diametri perpendicolari precedentemente misurati. Calcola la sfericità come il rapporto tra il diametro più grande e il più piccolo di ogni sferoide, con valori più vicini a 1 che indicano maggiore uniformità e una forma più sferica.
   4. Eseguire analisi statistiche utilizzando i valori ottenuti di diametro e sfericità.

3. Semina degli sferoidi su impalcature GelMA per la fusione e il bioassemblaggio degli sferoidi

1. Dopo 24 ore di formazione sferoide, si prelevano dai microstampi di agarosio usando una pipetta con punte a largo diametro e si trasferissero in microtubi da 2 mL.
2. Quando gli sferoidi si depositano sul fondo dei microtubi, scartare il soprantantante.
3. Sospensa gli sferoidi in 50 μL di medium 3D.
4. Utilizzando una pipetta con punte a larga diametro, raccogli gli sferoidi e infondili delicatamente nei pori dell'impalcatura GelMA.
   NOTA: In un poro di supporto GelMA di circa 5,50 mm di diametro e 2 mm di profondità, si seminano circa 480-640 sferoidi (corrispondenti a 6–8 microstampi di agarosio, ciascuno generando 81 sferoidi con diametri che vanno da 200 a 400 μm) in 50 μL. Questa stima si basava sul volume dei pori e sul diametro medio degli sferoidi, con la quantificazione effettuata tramite il numero di microstampi completi trasferiti piuttosto che tramite il conteggio individuale degli sferoidi, garantendo una stima pratica e riproducibile della densità degli sferoidi all'interno del poro.
5. Dopo aver depositato gli sferoidi nel poro di supporto GelMA, attendere 20–40 minuti per permettere agli sferoidi di depositarsi. Aggiungi 1 mL di mezzo 3D in ogni pozzo.
6. Dopo 24 ore, aggiungi 1 mL di mezzo 3D in ogni pozzo.
7. Monitorare la fusione degli sferoidi nei pori delle impalcature GelMA tramite microscopia a contrasto di fase e stereomicroscopia. Acquisire le immagini ogni 24 ore, dal giorno 0 (immediatamente dopo la semina) al giorno 3 (72 ore).
8. Fissare la costruzione biologica in paraformaldeide al 4% dopo 72 ore per la visualizzazione tramite microscopia confocale. Maneggiare il paraformaldeide in una cappa chimica certificata utilizzando dispositivi di protezione personale appropriati (camice da laboratorio, guanti e protezione per gli occhi) grazie alle sue proprietà tossiche e irritanti, e smaltire i rifiuti secondo le linee guida istituzionali per la sicurezza chimica. Per l'osservazione confocale, le cellule dovrebbero essere pre-marcate nel monostrato con un colorante fluorescente prima della formazione degli sferoidi.
   NOTA: Se è necessaria la rimozione del costrutto dal poro di GelMA per analisi o applicazione in vivo , si recupera con attenzione utilizzando pinzette di precisione o un perforatore per biopsia di dimensioni adeguate.

Risultati

Le cellule staminali umane derivate dalle membrane adipose (hASC) coltivate in un monostrato (Figura 2C) sono state indotte con successo a formare sferoidi entro 24 ore dopo la semina in microstampi di agarosio (Figura 2D). Gli sferoidi risultanti presentavano una morfologia compatta e ben definita. L'analisi morfometrica ha rivelato un diametro medio di 239,8 μm ± 87,0 μm a 24 ore (Figura 2E) e un ...

Discussione

I risultati mostrati in questo studio evidenziano la riuscita integrazione delle metriche di controllo qualità in un flusso di lavoro standardizzato di biofabbricazione per garantire la riproducibilità. L'uso di impalcature stampate in 3D basate su progetti predefiniti fornisce supporto strutturale per il bioassemblaggio^{sferoideo 19,23}. Come prova di concetto, fu progettato un impalcatura solida con due regioni porose centrali, d...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Preparato in laboratorio		-
593iCAN 3D Bioprinter, Modello 593 iCan2X Printhead	593iCAN	-	-
Agarosio	Sigma-Aldrich	16500-500	-
Acido Ascorbico	Sigma-Aldrich	A4544-100MG	-
Carl Zeiss Microscopy GmbH Primovert	Zeiss	-	415510-1101-000
Celldiscover	Zeiss	-	LSM 900 with Airyscan 2
Celltracker	Invitrogen	C7025	-
Centrifugatrice	Eppendorf	-	5702
Gabinetto di sicurezza biologica Classe II	Streamline	-	Modello SC2-4E3
Incubatore CO2 per la coltura cellulare	Thermo Fisher Scientific	-	Serie 8000 WJ
Ugello conico in polipropilene 0,41 mm	593iCAN	-	-
Dulbecco’s Modified Eagle Medium a basso contenuto di glucosio	Sigma-Aldrich	D2902-10L	-
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	-
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	12657-029	-
Gel di gelatina metacriloil con forza 300 g Bloom, grado di sostituzione 60%	Sigma-Aldrich	900622	Numero di lotto/lotto: MKCS2673. La documentazione per ogni lotto, incluso il foglio di dati di sicurezza (SDS) e il certificato di analisi (CoA), può essere ottenuta dal sito web del produttore.
Software GraphPad Prism 6.0	GraphPad Inc	-	-
Agitatore magnetico a piastra calda	IKA	Z671797	Modello C-MAG HS7
Albumina sierica umana 100 mg/ml	FUJIFILM Irvine Scientific	9988	-
Supplemento ITS (Insulin-transferrin-selenite di sodio) 100x	Sigma-Aldrich	I3146-5ML	-
Litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP)	Sigma-Aldrich	900889
Microscopio stereozoom Luxoeo 4Z	Labomed	-	-
Piatto Petri 3D MicroTissues® micro-stampo per sferoidi	Sigma-Aldrich	Z764019	-
Penicillina-streptomicina 100x	Sigma-Aldrich	15140122	-
Cellule staminali derivate dal tessuto adiposo umano Poietics™ (ADSC)	Lonza	PT-5006
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	71382-500G	-
Tripsina/EDTA	Gibco	27250018	-