Articolo metodologico

Un protocollo per il prelievo della sospensione a singola cellula dalle cornee dei topi

DOI:

10.3791/69844

⸱

3 aprile 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un protocollo per ottenere sospensioni monocellulari di alta qualità da intere cornee di topo attraverso la digestione sequenziale con collagenasi A e tripsina. Questo metodo produce cellule singole vitali con alta integrità dell'RNA, rendendole compatibili con applicazioni a valle come il sequenziamento a RNA a singola cellula e il citometroa flusso y.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Come strato più esterno del bulbo oculare, la cornea svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi e della vista della superficie oculare. I recenti progressi nel sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) hanno permesso un'analisi ad alta risoluzione dell'eterogeneità cellulare corneale, tuttavia la preparazione di sospensioni monocellulari di alta qualità dal tessuto corneale rimane impegnativa a causa della sua struttura densa e complessa. In questo studio, stabiliamo un protocollo robusto per generare sospensioni monocellulari da intere cornee del topo. La procedura prevede la triturazione delle cornee in frammenti fini seguita da una digestione enzimatica sequenziale utilizzando collagenasi A e tripsina. La sospensione cellulare risultante è stata valutata per la qualità attraverso più metriche: la colorazione con tripano blu è stata utilizzata per valutare la vitalità e il conteggio cellulare; la colorazione immunofluorescenza per Pancitocheratina e cheratocano ha permesso l'identificazione e la quantificazione dei principali tipi cellulari corneali; e l'integrità dell'RNA è stata verificata tramite un bioanalizzatore di analisi. Questo protocollo produce costantemente preparazioni a singola cellula con alti numeri cellulari, eccellente vitalità (≥ 94,6%) e un'alta percentuale di singole cellule (96,3%), soddisfacendo i requisiti compatibili con applicazioni a valle impegnative, inclusa la scRNA-seq.

Introduzione

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La cornea, situata nello strato più esterno del bulbo oculare, è essenziale per le sue funzioni di barriera e rifrazione, grazie a un'architettura altamente organizzata composta da cinque strati distinti: l'epitelio, lo strato di Bowman, lo stroma, la membrana di Descemet e l'endotelio1. L'epitelio corneale è una struttura squamosa stratificata non cheratinizzata che fornisce una barriera fisica contro i patogeni esterni e mostra robuste capacità antimicrobiche e rigenerative. Lo stroma, composto da fibrille di collagene allineate con precisione, mantiene trasparenza corneale e un indice di rifrazioneuniforme di 2. L'endotelio, uno strato monocellulare, regola il trasferimento di liquidi tra lo stroma e l'umore acquoso, preservando così l'idratazione corneale e l'apporto dinutrienti 3. Tuttavia, questa complessa complessità strutturale e cellulare ha storicamente posto sfide significative per l'indagine delle funzioni biologiche corneali e dei meccanismisottostanti 4.

Per studiare le interazioni intercellulari e identificare marcatori specifici per tipo cellulare, sono ampiamente impiegate tecniche come la selezione della citometriaa flusso 5 e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq)6 . Un importante ostacolo tecnico comune a entrambi gli approcci, tuttavia, è la preparazione di sospensioni a cella singola di alta qualità. Parametri quali la resa cellulare totale, la proporzione di singole cellule e la vitalità cellulare sono critici per l'affidabilità delle applicazioni a valle volte a caratterizzare la funzione cellulare corneale e l'espressione dei marcatorisuperficiali 7. Nonostante la sua importanza, persiste la mancanza di protocolli standardizzati ed efficienti per generare sospensioni a singola cellula da cornee intere di topo.

Sono stati sviluppati diversi metodi per ottenere sospensioni monocellulari dal tessuto corneale. La digestione enzimatica sequenziale tramite collagenasi A, tripsina o tripsina è stata impiegata per isolare singole cellule sia da cornee umane che da quellemurine 8. La tripsinizzazione ripetuta è stata utilizzata anche per la dissociazione corneale⁷. Inoltre, kit commerciali di dissociazione multitessutale, come quelli di Miltenyi Biotec, sono stati applicati con successo per generare sospensioni cornealimonocellulari 9. Nel nostro precedente studio comparativo di diversi metodi di digestione corneale, abbiamo dimostrato che il trattamento sequenziale con collagenasi e tripsina costituisce l'approccio ottimale. Questo metodo produce costantemente elevati numeri cellulari, eccellente vitalità (≥94,6%), un'alta percentuale di singole cellule (96,3%) e un'integrità dell'RNA benconservata 10.

In questo protocollo, forniamo una procedura dettagliata passo dopo passo per generare sospensioni monocellulari di alta qualità da cornee intere del topo utilizzando questa strategia di digestione enzimatica ottimizzata, basandosi sulla nostra esperienza consolidata e sui risultati precedenti.

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Protocollo

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Le femmine di topi C57BL/6 (B6), di 6-8 settimane, sono state fornite dal Centro Sperimentale per Animali dell'Università Medica del Guizhou. Gli animali sono stati ospitati in un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio con accesso ad libitum a cibo e acqua. Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico Sperimentale sugli Animali dell'Università Medica del Guizhou (Approvazione n. 2305185) e condotte in conformità con la Dichiarazione ARVO sull'Uso degli Animali nella Ricerca Oftalmica e Visiva.

1. Preparazione

  1. Preparazione degli strumenti chirurgici: pulire due paia di forbici oftalmiche, due paia di force oftalmiche, una coppia di pinze tissutali e un tubo centrifugo da 2 mL risciacquando due volte con acqua doppia distillata (DDW). Sterilizza gli strumenti e il tubo usando un'autoclave a vapore. Asciuga tutti gli alimenti durante la notte in un forno convenzionale a 65 °C.
  2. Preparazione della soluzione
    1. Medio Epiteliale Ormonale Supplementare (SHEM): Prepara SHEM integrando il mezzo DMEM/F12 con i seguenti componenti: 5% (v/v) siero fetale bovino (FBS), 0,5% (v/v) dimetil solfossido (DMSO), 10 ng/mL fattore di crescita epidermica del topo, 5,5 μg/mL transferrina, 0,5 μg/mL idrocortisone, 1% (v/v) penicillina-streptomicina (100 U/mL penicillina, 100 μg/mL streptomicina).
      NOTA: SHEM viene utilizzato per mantenere la vitalità della cella durante il processamento. Può essere sostituito con mezzi alternativi come il DMEM basale o la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente almeno il 10% (v/v) di FBS.
    2. Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)
      1. Sciogliere 22,4 g di polvere PBS in 2 L di acqua doppiamente distillata (DDW) durante l'agitazione usando un agitatore magnetico per ottenere 1× PBS.
      2. Autoclava la soluzione PBS un giorno prima e lascia raffreddarsi.
      3. In condizioni sterili, trasferire 47,5 mL di PBS sterile 1× in un tubo centrifuga da 50 mL e aggiungere 2,5 mL di penicillina-streptomicina all'1% (v/v).
        NOTA: La formulazione 1× PBS (2 L) contiene 137 mM di NaCl, 8 mMNa 2HPO 4 e 2 mMNaH 2PO4, pH 7,2.
    3. Soluzioni per la collagenasi A
      1. Soluzione standard: sciogliere 1 g di collagenasi A in polvere in 40 mL di DDW. Sterilizza il filtro con un filtro da 0,2 μm e conserva a -20 °C.
      2. Soluzione operativa: diluire 1 mL di collagenasi A in soluzione stock in 4 mL di DDW sterile per ottenere una concentrazione finale di 5 mg/mL.
    4. Soluzione di tripsina: Scongelare la soluzione di tripsina/EDTA disponibile commercialmente allo 0,25% (w/v) (contenente 0,91 mM EDTA) su ghiaccio prima dell'uso.
    5. Soluzione di Trippan Blue (0,4%): Sciogliere 0,4 g di Trypan Blue in 100 mL di DDW. Filtrare con carta filtro e conservare a 4 °C.
      NOTA: La soluzione Trippan Blue allo 0,4% viene utilizzata per valutare il numero totale di cellule, la proporzione di singole cellule e la vitalità. Può essere sostituito da kit commerciali di colorazione viva/morta o sistemi automatizzati di conteggio delle cellule.

2. Preparazione delle cornee del topo

  1. Sterilizza il microscopio di dissezione e l'area di lavoro pulendolo con etanolo al 75%, poi esponi l'area alla luce UV all'interno di un armadietto di sicurezza biologica per 30 minuti.
  2. Prepara i seguenti in condizioni sterili: una piastra di Petri da 60 mm con 5 mL di mezzo STEM, tre piastre di Petri da 60 mm ciascuna contenente 5 mL di 1× PBS integrato con 5% di penicillina-streptomicina (P-S), tre piastre di Petri da 60 mm ciascuna con 5 mL di PBS semplice a 1× e un tubo centrifugo sterile da 2 mL
  3. Eutanasia del topo tramite asfissia da CO2 , seguita da una lussazione cervicale.
  4. Risciacquare accuratamente la testa del topo e le palpebre chiuse per immersione tre volte in PBS contenente il 5% di P-S prima di procedere con l'enucleazione.
  5. Utilizzando forbici oftalmiche, si effettua un'incisione lungo il polo posteriore di ciascun bulbo oculare e si posiziona con cura gli occhi isolati nella piastra di Petri contenente il mezzo SHEM gelato (Figura 1A).
    NOTA: Per massimizzare la vitalità cellulare, tutte le soluzioni devono essere pre-raffreddate a 4 °C e tutti i passaggi di dissezione devono essere eseguiti sul ghiaccio.
  6. Trasferire immediatamente la piastra di Petri con gli occhi in un armadietto di sicurezza biologica. Lava i bulbi oculari tre volte in 1× PBS contenente il 5% di P-S, incubando per 5 minuti per ogni lavaggio.
  7. Al microscopio dissezionale, separare attentamente il tessuto corneale: utilizzando forbici oftalmiche e pinze, eseguire un'incisione dal polo posteriore verso il limbo corneale. Distacca delicatamente la cornea dalla sclera e dalla congiuntiva lungo il bordo limbare. Rimuovere completamente il cristallino e l'iride usando due paia di pinze (Figura 1B).
  8. Utilizzando le pinze oftalmiche, trasferire il tessuto corneale in una piastra di Petri contenente 1× PBS e lavare tre volte (5 min ciascuno) per rimuovere eventuali residui di tessuto non corneale e antibiotici.
    NOTA: L'iride spesso aderisce saldamente alla cornea. Assicurati che venga rimossa delicatamente e completamente con una pinza per evitare contaminazioni, lasciando solo tessuto corneale limpido.
  9. Utilizzando le pinze oftalmiche, trasferire il tessuto corneale pulito in un tubo centrifuga da 2 mL e aggiungere 1 mL di soluzione lavorativa di collagenasi A (5 mg/mL).
  10. Utilizzando forbici oftalmiche, trita il tessuto corneale in frammenti di circa 0,5 mm × 0,5 mm direttamente all'interno del tubo.
  11. Incubare il tubo contenente i frammenti corneali e la soluzione di collagenasi A in un incubatore di colture cellulari a 37 °C per 1 ora (Figura 2A-C).
  12. Durante la digestione della collagenasi A, monitorare il tessuto ogni 10 minuti. Interrompere la digestione quando non rimangono grandi frammenti di tessuto procedendo alla centrifugazione. Centrifuga il campione a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente usando una centrifuga. Aspira con cura il soprandante.
  13. Risospendere il pellet in 200 μL di soluzione allo 0,25% di tripsina/EDTA.
  14. Incubare il tubo in un incubatore di colture cellulari a 37 °C per 10 minuti per digerire i frammenti di tessuto residui.

3. Isolamento delle singole cellule corneali

  1. Triturare delicatamente la miscela (tessuto e soluzione di tripsina/EDTA) ripetutamente utilizzando una pipetta P1000 con punta a largo diametro per dissocere il tessuto in una sospensione unicellulare.
  2. Centrifuga la sospensione a celle a 300 x g per 5 minuti e scarta il soprantantante. Risospendere la pellet cellulare in 1 mL di PBS contenente albumina sierica bovina (BSA) allo 0,04% per ottenere una sospensione monocellulare.
    NOTA: Per le cellule destinate al sequenziamento o alla citometria a flusso, risospendere in PBS senza siero. Per le cellule che verranno coltivate, usa 1x PBS integrato con BSA allo 0,04%.
  3. Filtrare la sospensione della cella attraverso un filtro cellulare pre-bagnato da 40 μm in un nuovo tubo centrifuga da 50 mL per rimuovere grumi e detriti cellulari.
    NOTA: Pre-bagna il filtratore cellulare con PBS per minimizzare la perdita cellulare. Se necessario, le celle filtrate possono essere nuovamente centrifugate e risospese in un volume desiderato per la concentrazione.

4. Conteggio delle celle

  1. Combina 9 μL della sospensione della cella con 1 μL di soluzione di Trypan Blue allo 0,4% e mescola delicatamente.
  2. Caricare lentamente la miscela in una camera dell'emocitometro tramite il canale di carico designato. Contare le celle utilizzando il metodo dei quattro quadranti per determinare il numero totale di celle, la vitalità e la proporzione di singole cellule. Esegui almeno due repliche tecniche.

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Risultati

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La qualità delle sospensioni a singola è stata valutata in base alla resa totale delle cellule, alla proporzione di singole cellule e alla vitalità cellulare. La sospensione è stata colorata con Trippan Blue e analizzata utilizzando microscopia a contrasto di fase su più campi (Figura 3). Da quattro occhi di topo (otto cornee), sono stati ottenuti un totale di 1,05 × 105 cellule, con una vitalità cellulare media del 94,6% e un rapporto di singole ...

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Discussione

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L'introduzione del sequenziamento a RNA a singola cellula ha aumentato notevolmente l'uso di tecnologie genomiche, trasscrittomiche, epigenetiche e proteomiche nella ricercaoculare 9,10,11,12. Di conseguenza, la preparazione di sospensioni monocellulari di alta qualità è diventata sempre più critica, poiché consente di rilevare variazioni di segnalazione tra si...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano esprimere la loro gratitudine e rispetto a tutti gli animali che hanno contribuito alle loro cellule in questo studio. Questo studio è stato supportato in parte dai Progetti Provinciali di Scienza e Tecnologia del Guizhou (QKHJC-ZK[2024]ZD043 [a S.O.]); il Fondo Provinciale di Scienza del Fujian per Giovani Studiosi Distinti (2023J06053 [a S.O]); la Fondazione delle Scienze Naturali della Cina (n.82101084 [a S.O.]; il Programma Provinciale di Ricerca di Base del Guizhou (Scienze Naturali) (QKHJC-ZK[2025]MS-473) [a S.O.]; il Fondo dell'Unione per la Ricerca Medica per lo Sviluppo Sanitario di Alta Qualità della Provincia di Guizhou (2024GZYKYJJKM0043) [a S.O.].

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Alexa Fluor 594 anti-coniglioAbcamab150064
AnticheratinaAbcamab230175
Anti-pancitocheratinaThermo Fisher ScientificAE1/AE3, Alexa FluorTM 488
Sterilizzatore per autoclaveAn ShenLDZH-100KBS
Albumina Sirica Bovina VSolarbioA8020
Filtro cellulareNIDO25836940 & mu; m
Macchina centrifugaEppendorf AG22331 Amburgo
Collagenasi ARoche10103578001
Microscopio confocale  OberkochenZeiss LSM 880
Targa per il conteggioMARIENFELDM407859
Tubo centrifugoNIDO6206112 mL, 50 mL
CoperturaMARIENFELDM407859
DAPISolarbioC0065
Microscopio dissezionaleCarl ZEISSVISU150
DMEM/F12  MediaGibco11320033
DMSOSolarbioD8371
Fetal  bovino  SieroGibco16140071
IdrocortisoneSolarbioIH0100
ISGibco23337619
Fattore di crescita epidermica del topoInvitrogenPMG8041
chirurgia oftalmica   PinzeDumot0208-5-PO
Forbici chirurgiche oftalmicheFST15021-15
FornoAISITEDH6000 II
Penicillina & StreptomicinaGibco15070063100mL
Piastra di PetriNIDO70520160mm
Soluzione salina tamponata con fosfatoSolarbioP1010
Incubatore termostaticoThermo Fisher Scientific3111
Triton-X 100SolarbioT8200
Trippan Blue SolarbioT8070
Tripsina/EDTA GibcoR001100
Tavolo ultra-pulitoreYou QiVS-840-2
4% ParaformaldeideSolarbioP1110

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Cornea di topodigestione enzimaticacollagenasi Adigestione con tripsinacolorazione in immunofluorescenzavitalit cellulareintegrit dell RNAtipi di cellule cornealicitometria a flusso

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