Microscopia di localizzazione a singola molecola delle proteine di membrana utilizzando la marcatura a singolo anticorpo

Summary

Questo protocollo descrive la marcatura a singolo anticorpo (SAL) per risolvere l'organizzazione spaziale su scala nanometrica delle proteine della membrana plasmatica. Sfruttando le interazioni cumulative anticorpo-epitopo a livello di singola molecola, il SAL di membrana (mSAL) mappa le distribuzioni locali degli epitopi catturando contemporaneamente il comportamento di legame degli anticorpi nell'ambiente cellulare nativo.

Abstract

La membrana plasmatica definisce la forma cellulare e funge da interfaccia che governa la comunicazione intercellulare. Le proteine di membrana costituiscono una classe principale di bersagli terapeutici; Pertanto, la super-risoluzione della membrana cellulare attraverso le sue proteine costitutive offre grandi promesse per l'avanzamento della biologia cellulare e delle terapie degli anticorpi. A tal proposito, la microscopia di localizzazione a singola molecola (SMLM) consente la visualizzazione su scala nanometrica delle organizzazioni proteiche sulle strutture biologiche. Nonostante la sua importanza, applicare la SMLM alle proteine della membrana plasmatica presenta sfide uniche. In questo protocollo, presentiamo un approccio efficace utilizzando la marcatura a singolo anticorpo (SAL) a time-lapse denominata membrana SAL (mSAL). Forniamo istruzioni dettagliate passo dopo passo, tra cui l'ottimizzazione della concentrazione di anticorpi, la densità di potenza del laser, la durata degli intervalli di non illuminazione, la ricostruzione dell'immagine e l'analisi dei cluster basata sulla densità, per risolvere la distribuzione nanometrica delle proteine a membrana e la morfologia della membrana. Utilizziamo la proteina tetraspanin CD81 come proteina modello di membrana per dimostrare la capacità dell'mSAL sia su cellule aderenti che su cellule mammiferi in sospensione. Oltre a super-risolvere la membrana cellulare e le distribuzioni delle proteine di membrana, la nostra tecnica consente di indagare la farmacodinamica degli anticorpi terapeutici che interagiscono con i loro bersagli di membrana nell'ambiente di membrana nativo.

Introduction

La membrana plasmatica contiene una vasta gamma di proteine che regolano la mobilità cellulare, l'adesione, il rilevamento e la comunicazione intercellulare. Comprendere la distribuzione su scala nanometrica delle proteine della membrana plasmatica è importante, poiché la funzione delle proteine è spesso governata non solo dai livelli di espressione ma anche dalla loro organizzazione spaziale sulla^{membrana 1,2}. In particolare, molti anticorpi terapeutici mirano alle proteine di^{membrana 3,4}, rendendo essenziali le indag....

Protocol

Questo protocollo utilizza le linee cellulari Jurkat E6.1 e U2OS consolidate e non coinvolge materiali primari umani o animali vivi.

1. Semina/atterraggio e fissazione delle cellule

NOTA: La preparazione del campione segue i protocolli standard di colorazione a immunofluorescenza (IF), ottimizzati per preservare l'organizzazione subcellulare delle proteine della membrana plasmatica tra diversi tipi cellulari. Se esiste un protocollo di immunocolorazione consolidato per il target di interesse, gli utenti possono seguire quel protocollo fino allo stadio 1.2.14 per il blocco del campi....

Results

La tecnica mSAL descritta in questo protocollo consente la visualizzazione di singoli eventi di legame di anticorpi ai rispettivi bersagli proteici di membrana plasmatica, produendo una mappa a super-risoluzione della distribuzione delle proteine di membrana. CD81 è usato qui come esempio rappresentativo, anche se l'approccio è facilmente adattabile ad altre proteine di membrana.

L'immobilizzazione delle cellule T di Jurkat con sufficiente distanza tra le cell.......

Discussion

L'organizzazione delle proteine della membrana plasmatica svolge un ruolo fondamentale nella regolazione della funzione cellulare. Le tecniche convenzionali di microscopia a fluorescenza sono limitate dal limite di diffrazione della luce, che ne maschera l'organizzazione su scala nanometrica. SMLM supera questa limitazione raggiungendo risoluzioni spaziali di 10-20^{nm 47}, permettendo la caratterizzazione dei loro assemblaggi in scala^nanometrica

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorpo anti-CD81 Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	MA5-44132	Anticorpi per imaging
Centrifuga da banco	Eppendorf	5424
Albumina sierica bovina	MilliporeSigma	A7906-100G
Vetro a coperchio camerato, 8 pozzi	Cellvis	C8-1-N
Media DMEM	Thermo Fisher Scientific	11960069
Soluzione salina tamponata a fosfato di Dulbecco	Thermo Fisher Scientific	14190-144
Siero bovino fetale	MilliporeSigma	F0926-500ML
Glutaraldeide, 10 %	Scienze della microscopia elettronica	16120
Colloidi d'oro, 100 nm	Ted Pella	15711 e meno; 20	Marcatore fiduciario
Olio per immersione	Laboratori Cargille	16245
Microscopio rovesciato  equipaggiato con modulo TIRF	Strumenti Nikon	Eclipse Ti2-E	Microscopio
Linea cellulare Jurkat E6.1	MilliporeSigma	88042803-1VL	Celle di sospensione
Lancio laser, 6 linee	Oxxius	L6CC-CS8-1511	Laser di eccitazione
Lipofectamina 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019	Reagente di trasfezione
Tubo a microcentrifuga, 1,5 mL	VWR	89000-028
Software per l'imaging microscopico	Strumenti Nikon	Ricerca Avanzata NIS-Elements	Software per l'acquisizione delle immagini
Objective, 100x/1.49 CFI APO TIRF & nbsp;	Strumenti Nikon	MRD01991	Obiettivo del microscopio
Paraformaldeide, 16%	Scienze della microscopia elettronica	15710
Penicillina-Streptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140-122	Antibiotici
Soluzione di poli-L-lisina, 0,01%	MilliporeSigma	P4707-50ML
Fotocamera Prime 95B sCMOS	Soluzioni Teledyne Vision	01-PRIME-95B-R-M-16-C	Fotocamera
Supporti RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093	Mezzi per celle di sospensione
Azida di sodio	Thermo Fisher Scientific	19038-1000
Boridriduro di sodio	MilliporeSigma	213462-25G
Fiaschette di coltura T25	Thermo Fisher Scientific	169900
Microsfere TetraSpeck			Marcatore fiduciario
Piatto di coltura tissutale, 100 mm	Corning	353003
Linea cellulare U2OS	ATCC	HTB-96	Cellule aderenti