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Articolo metodologico

Microscopia di localizzazione a singola molecola delle proteine di membrana utilizzando la marcatura a singolo anticorpo

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DOI:

10.3791/69853

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20 marzo 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la marcatura a singolo anticorpo (SAL) per risolvere l'organizzazione spaziale su scala nanometrica delle proteine della membrana plasmatica. Sfruttando le interazioni cumulative anticorpo-epitopo a livello di singola molecola, il SAL di membrana (mSAL) mappa le distribuzioni locali degli epitopi catturando contemporaneamente il comportamento di legame degli anticorpi nell'ambiente cellulare nativo.

Abstract

La membrana plasmatica definisce la forma cellulare e funge da interfaccia che governa la comunicazione intercellulare. Le proteine di membrana costituiscono una classe principale di bersagli terapeutici; Pertanto, la super-risoluzione della membrana cellulare attraverso le sue proteine costitutive offre grandi promesse per l'avanzamento della biologia cellulare e delle terapie degli anticorpi. A tal proposito, la microscopia di localizzazione a singola molecola (SMLM) consente la visualizzazione su scala nanometrica delle organizzazioni proteiche sulle strutture biologiche. Nonostante la sua importanza, applicare la SMLM alle proteine della membrana plasmatica presenta sfide uniche. In questo protocollo, presentiamo un approccio efficace utilizzando la marcatura a singolo anticorpo (SAL) a time-lapse denominata membrana SAL (mSAL). Forniamo istruzioni dettagliate passo dopo passo, tra cui l'ottimizzazione della concentrazione di anticorpi, la densità di potenza del laser, la durata degli intervalli di non illuminazione, la ricostruzione dell'immagine e l'analisi dei cluster basata sulla densità, per risolvere la distribuzione nanometrica delle proteine a membrana e la morfologia della membrana. Utilizziamo la proteina tetraspanin CD81 come proteina modello di membrana per dimostrare la capacità dell'mSAL sia su cellule aderenti che su cellule mammiferi in sospensione. Oltre a super-risolvere la membrana cellulare e le distribuzioni delle proteine di membrana, la nostra tecnica consente di indagare la farmacodinamica degli anticorpi terapeutici che interagiscono con i loro bersagli di membrana nell'ambiente di membrana nativo.

Introduzione

La membrana plasmatica contiene una vasta gamma di proteine che regolano la mobilità cellulare, l'adesione, il rilevamento e la comunicazione intercellulare. Comprendere la distribuzione su scala nanometrica delle proteine della membrana plasmatica è importante, poiché la funzione delle proteine è spesso governata non solo dai livelli di espressione ma anche dalla loro organizzazione spaziale sullamembrana 1,2. In particolare, molti anticorpi terapeutici mirano alle proteine dimembrana 3,4, rendendo essenziali le indagini su scala nanometrica per comprendere come le interazioni degli anticorpi siano influenzate dall'organizzazione locale delle proteine di membrana. Tuttavia, la mappatura precisa della distribuzione delle proteine di membrana, la profilazione da parte di una singola molecola della loro abbondanza e il monitoraggio in tempo reale delle loro interazioni dinamiche con i partner di legame rimangono una sfida.

Le tecniche di microscopia a localizzazione a singola molecola (SMLM) ampiamente utilizzate, come la microscopia di ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM)5,6 e l'accumulo di punti basato sul DNA per l'imaging in topografia su scala nanometrica (DNA-PAINT)7, utilizzano la colorazione a immunofluorescenza (IF) per la marcatura del campione. Raggiungono risoluzioni laterali di ~ 10 nm e hanno fornito ampie informazioni sull'organizzazione nanoscala dei bersagli terapeutici delle membrane, inclusi il recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2)8,9, CD2010, i recettori delle celluleT 11,12,13, il ligando della morte programmato1,14, i recettori delle cellule B 15,16,17 e CD19 17,18. Ad esempio, studi dSTORM che utilizzano l'anticorpo monoclonale terapeutico Trastuzumab per rilevare direttamente HER2, un recettore chiave implicato nel cancro al seno, hanno rivelato stati di clustering distinti tra pazienti HER2-positive8, mentre diversi anticorpi terapeutici hanno dimostrato modulare il clusteringHER2 9. DNA-PAINT combinata con microscopia a foglio luminoso a reticolo ha chiarito gli stati oligomerici e i profili di interazione del CD20 nelle cellule B con anticorpi monoclonali terapeutici rituximab, ofatumumab e obinutuzumab10. Sebbene la SMLM convenzionale fornisca preziose intuizioni sull'organizzazione su scala nanometrica, il suo pieno potenziale è limitato dagli approcci tradizionali di colorazione IF. La qualità dell'immagine SMLM dipende dalla colorazione IF, che a sua volta è regolata dalla specificità e affinità dell'anticorpo di marcatura. La SMLM tradizionale utilizza anticorpi ad alta affinità che tipicamente permettono di ottenere una colorazione IF e una qualità dell'immagine superiori. Tuttavia, la maggior parte degli anticorpi terapeutici interagisce con i recettori di membrana delle cellule vive con una moderata affinità per minimizzare gli effetti collaterali fuoribersaglio 19. Ad esempio, gli impegnatori delle cellule T bispecifiche (TCE) mostrano un'affinità inferiore per CD3, il che impedisce l'internalizzazioneTCR 20,21,22. Tali interazioni non possono essere catturate accuratamente dalle tecniche convenzionali di FI.

In precedenza abbiamo sviluppato una strategia che sfrutta direttamente le interazioni anticorpo-epitopo a singola molecola, chiamata marcatura a singolo anticorpo (SAL). Il SAL consente una mappatura ad alta densità delle interazioni anticorpo-epitopo preservando gli equilibri di legamenativi 23. Sebbene in precedenza abbiamo riportato un protocollo per proteine intracellulari del citoscheletro e mitocondriali, SAL sulle proteine di membrana non è stato dimostrato. In questo protocollo, forniamo un flusso di lavoro passo dopo passo per applicare SAL alle proteine di membrana, dimostrato attraverso la marcatura del tetraspanin CD81, un candidato terapeutico bersagliosegnalato 25,26,27,28, sia nelle cellule in sospensione che in quelle aderenti. Utilizzando anticorpi anti-CD81 marcati fluorescenti per sondare direttamente la distribuzione spaziale di CD81 sulle cellule T U2OS e Jurkat, dimostriamo l'applicazione di studi su scala nanometrica SAL sulle proteine di membrana. Abbiamo definito questa strategia come membrana SAL (mSAL). Infine, descriviamo una strategia basata sul clustering per ridurre le rilevazioni isolate di singola molecola all'esterno della cellula.

In sostanza, SAL utilizza la marcatura a singola molecola in time-lapse per catturare le interazioni individuali anticorpi-epitopi, e la successiva deconvoluzione a singolo emettitore produce un'immagine a super-risoluzione basata sull'SMLM. Regolando la concentrazione degli anticorpi e selezionando un intervallo non illuminato (NII) appropriato tra fotogrammi d'immagine consecutivi, SAL abbina la velocità di on-on degli anticorpi a quella della singola molecola, permettendo la localizzazione della singola molecola. La SAL richiede NII più lunghi a causa della cinetica di legame intrinsecamente lenta degli anticorpi, che prolunga la durata dell'acquisizione dell'immagine (~3-17 ore). SAL è particolarmente adatta per applicazioni che richiedono una mappatura precisa su scala nanometrica degli epitopi e la valutazione della dinamica di interazione individuale anticorpo-epitopo. Nonostante la sua portata più bassa, SAL offre una visione unica sull'organizzazione degli epitopi e sull'impegno degli anticorpi in condizioni quasi fisiologiche, rendendolo particolarmente prezioso per caratterizzare gli anticorpi terapeutici in situ.

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Protocollo

Questo protocollo utilizza le linee cellulari Jurkat E6.1 e U2OS consolidate e non coinvolge materiali primari umani o animali vivi.

1. Semina/atterraggio e fissazione delle cellule

NOTA: La preparazione del campione segue i protocolli standard di colorazione a immunofluorescenza (IF), ottimizzati per preservare l'organizzazione subcellulare delle proteine della membrana plasmatica tra diversi tipi cellulari. Se esiste un protocollo di immunocolorazione consolidato per il target di interesse, gli utenti possono seguire quel protocollo fino allo stadio 1.2.14 per il blocco del campione. La marcatura a singolo anticorpo (SAL) si basa sulla rilevazione cumulativa degli anticorpi marcati con fluorescenza mentre si legano al loro antigene a livello di singola molecola. Gli anticorpi marcati fluorescenti diluiti in un buffer di imaging vengono aggiunti ai campioni sul palco del microscopio, e la marcatura fluorescente avviene dinamicamente durante il progredire dell'acquisizione dell'immagine. Durante la fase di preparazione del campione non viene effettuata alcuna marcatura fluorescente.

  1. Preparare le cellule aderenti, come la linea cellulare U2OS, come descritto in un protocollo24 precedentemente pubblicato.
  2. Sospensioni delle celle
    1. Mantenere le cellule T di Jurkat a una densità di 1 x 105 a 1 x10 6 cellule/mL in 10 mL di mezzo RPMI completo (RPMI 1640 integrato con siero fetale al 10% (v/v), 100 U/mL penicillina e 100 μg/mL streptomicina) a 37 °C in un incubatore umidificato integrato con 5% di CO2.
      NOTA: I 10 mL raccomandati di mezzo completo si applicano alle fiaschette T25; Gli utenti dovrebbero scalare il volume di conseguenza quando utilizzano vasi di coltura diversi.
    2. Preparare la superficie del vetro aggiungendo 200 μL di soluzione di poli-L-lisina (PLL) allo 0,01% ai pozzi destinati all'uso in un vetro a 8 pozzi con copertura camerata. Incubare durante la notte a 4 °C o per 2 ore a 37 °C.
    3. Contare le cellule provenienti dalla coltura utilizzando un emocitometro, poi trasferire 3,5 x 104 cellule in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
      NOTA: Il conteggio delle cellule potrebbe dover essere regolato per ottenere una buona distribuzione delle singole cellule. Un intervallo di semina di 30.000-60.000 cellule T Jurkat raggiunge una densità ideale in cui singole cellule sono chiaramente separate tra loro senza essere troppo scarsamente distribuite. Il conteggio cellulare potrebbe dover essere modificato per un nuovo tipo di cellula.
    4. Centrifuga a 300 x g per 3 minuti per ottenere un pellet cellulare. Scartare il sovrantantante e risospendere il pellet cellulare in 200 μL di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS) preriscaldata (37 °C). Il pellet cellulare risultante sarà visibile come un piccolo deposito bianco sul fondo del tubo della microcentrifuga.
      NOTA: Smaltire i rifiuti biopericolosi secondo le linee guida dell'istituzione e tutte le normative locali, statali e federali applicabili.
    5. Aspirare la soluzione PLL dal vetro di copertura camerato preparato (passo 1.2.2). Se l'incubazione con PLL avviene durante la notte a 4 °C, preriscaldare il vetro di copertura a 8 pozzi a 37 °C prima di aspirare la soluzione.
    6. Aggiungi la sospensione a celle dal passaggio 1.2.4. sul pozzo della camera rivestito con PLL. Incubare in un incubatore umidificato a 37 °C integrato con il 5% diCO2 per 30 minuti per permettere alle cellule di attaccarsi alla superficie. Mescola accuratamente la sospensione delle celle prima di piastrare e pipetta su e giù per rompere gli ammassamenti cellulari e assicurare una distribuzione uniforme nel pozzo.
    7. Controlla l'attacco della cella alla superficie del vetro usando un microscopio ottico. Con un ingrandimento di 10x, mettere a fuoco il microscopio sul fondo del vetro di copertura.
      NOTA: Toccare delicatamente il vetro di copertura a camera mentre si osserva al microscopio può aiutare a valutare se le cellule si sono attaccate alla superficie o stanno ancora galleggiando.
    8. Prepara 200 μL del tampone di fissazione (4% paraformaldeide e 0,1% glutaraldeide nel DPBS) e preriscaldalo a 37 °C in un bagno d'acqua.
      NOTA: Il buffer di fissazione fornito è ottimizzato per CD81 ed è generalmente adatto alla conservazione delle proteine di membrana. Per nuovi bersagli proteici di membrana, la composizione del tampone potrebbe dover essere regolata per ottenere una conservazione ottimale. Gli utenti sono incoraggiati a consultare la letteratura per condizioni di fissazione adattate a nuovi obiettivi.
      ATTENZIONE: Il paraformaldeide è tossico e cancerogeno. Il glutaraldeide è tossico e corrosivo. Indossa l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) appropriata quando maneggia questo reagente. In caso di contatto con la pelle, lava immediatamente accuratamente l'area interessata con acqua e sapone. Smaltire il reagente secondo le linee guida dell'istituzione dell'utente e tutte le normative locali, statali e federali applicabili.
    9. Aspira il DPBS da ogni pozzo campione (dal passo 1.2.6) usando una micropipetta.
      NOTA: È fondamentale eseguire tutti i passaggi di scambio della soluzione lentamente per evitare che le celle si stacchino dal vetro di copertura. Smaltire i rifiuti biopericolosi secondo le linee guida dell'istituzione dell'utente e tutte le normative locali, statali e federali applicabili.
    10. Aggiungi 200 μL di buffer di fissazione a 37 °C preriscaldato in un angolo del pozzo e incuba a temperatura ambiente per 15 minuti.
      ATTENZIONE: Il paraformaldeide è tossico e cancerogeno. Il glutaraldeide è tossico e corrosivo. Indossa DPI appropriati quando maneggi questi reagenti. In caso di contatto con la pelle, lava immediatamente accuratamente l'area interessata con acqua e sapone. Smaltire il reagente secondo le linee guida dell'istituzione dell'utente e tutte le normative locali, statali e federali applicabili.
    11. Lava le celle fisse 3 volte con 500 μL di DPBS. Salta questo passaggio se procedi con il passaggio 1.2.12.
    12. Opzionale: Rimuovere lentamente la soluzione di fissazione e aggiungere 200 μL di boridrido di sodio appena preparato allo 0,1% in DPBS, poi incubare a temperatura ambiente per 7 minuti. Salta questo passaggio e procedi al passo 1.2.14 se non usi la riduzione del boridriduro di sodio.
      NOTA: La riduzione con boroidrido di sodio aiuta a stingere l'autofluorescenza generata dal glutaraldeide e neutralizza gli aldeidi non reati. Il rilascio di gas idrogeno come risultato della reazione del boroidrido di sodio con la soluzione acquosa si manifesterà come il rilascio di bolle. Se non si osserva il rilascio di gas idrogeno, si utilizza una soluzione fresca di boridriro di sodio.
      ATTENZIONE: Il boridrido di sodio è tossico e corrosivo. Indossa DPI appropriati quando maneggia questo reagente. In caso di contatto con la pelle, lava immediatamente accuratamente l'area interessata con acqua e sapone. Smaltire il reagente secondo le linee guida dell'istituzione dell'utente e tutte le normative locali, statali e federali applicabili.
    13. Aspirare la soluzione di boriddrura di sodio da ogni pozzo, poi lavare tre volte con 500 μL di DPBS.
    14. Prepara 200 μL del tampone di blocco e aggiungili al pozzo. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Non utilizzare un reagente di permeabilizzazione (ad esempio, TritonX-100, saponina), poiché potrebbe rimuovere proteine di membrana. Il protocollo membrane SAL (mSAL) presentato qui per CD81 non includeva uno step di blocco.
      NOTA: Un buffer bloccante contenente albumina sieroica bovina (BSA) al 5% (w/v) in DPBS è raccomandato per mSAL con nuovi bersagli. Quando si usano anticorpi secondari, il siero corrispondente viene utilizzato per bloccare. Ad esempio, siero caprano al 10% (v/v) in DPBS quando si utilizza un anticorpo secondario capra-ospite. Se esistono una ricetta di buffer di blocco stabilita e un protocollo per il target, gli utenti possono seguire quel protocollo. Il buffer bloccante può opzionalmente essere integrato con anticorpi di controllo isotipo o anticorpi derivati dal siero per ridurre i legami fuori targetdegli anticorpi 23,24. Includere un reagente di permeabilizzazione nel tampone bloccante solo se l'anticorpo prende di mira un epitopo intracellulare della proteina di membrana.
    15. Per mSAL con anticorpi primari coniugati con colorante, procedere direttamente al passo 1.2.20.
    16. Prepara 150 μL della soluzione primaria di colorazione anticorpale (anticorpo alla concentrazione desiderata diluito nel tampone bloccante). Saltare questo passaggio per mSAL con anticorpi primari coniugati con coloranti.
      NOTA: Per la colorazione primaria degli anticorpi, consulta la scheda tecnica del fornitore per le condizioni raccomandate. Se non vengono fornite informazioni sulla concentrazione, si inizia con 4 μg/mL (27 nM) per una IgG a lunghezzaintera 23,24.
    17. Sostituisci il tampone bloccante con la soluzione primaria per anticorpi. Incubare a temperatura ambiente per 2 ore o a 4 °C durante la notte in una camera umida. Saltare questo passaggio per mSAL con anticorpi primari coniugati con coloranti.
    18. Lava il campione due volte con 400 μL di DPBS. Aggiungi 200 μL di buffer di blocco al pozzo.
    19. Opzionale: sostituire il tampone bloccante con 200 μL di tampone post-fissazione (4% di paraformaldeide) e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: La post-fissazione aiuta a preservare il blocco del campione perSAL 23,24. Tuttavia, questo passaggio dovrebbe essere omesso se riduce l'accessibilità degli epitopi. Per valutare l'effetto della post-fissazione sul riconoscimento degli epitopi da parte degli anticorpi, eseguire la colorazione standard a immunofluorescenza con e senza post-fissazione, e confrontare la qualità della colorazione.
    20. Opzionale: lava il campione due volte con DPBS.
    21. Aggiungi 200 μL di DPBS in ogni pozzo e copri la camera con un film trasparente per evitare l'evaporazione. I campioni possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 1 mese. Se esegui mSAL immediatamente dopo il passaggio 1.2.14, o 1.2.19 senza post-fissazione, mantenere il campione nel buffer di blocco e procedere direttamente al passaggio 2.2.
      NOTA: Mantenere il campione in DPBS integrato con 5 mM di azide di sodio previene la crescita batterica durante la conservazione.
      ATTENZIONE: L'azida di sodio è estremamente tossica e può essere fatale se ingerita. Indossa DPI appropriati quando maneggia questo reagente. In caso di contatto con la pelle, lava immediatamente accuratamente l'area interessata con acqua e sapone. Smaltire il reagente secondo le linee guida dell'istituzione dell'utente e tutte le normative locali, statali e federali applicabili.

2. Acquisizione di immagini

NOTA: La procedura di imaging sia per cellule aderenti che per celle in sospensione è simile e viene eseguita tramite microscopia a fluorescenza interna totale (TIRF). Tuttavia, le condizioni di imaging dovrebbero essere ottimizzate per ciascun tipo cellulare.

  1. Lascia che i campioni conservati (a 4 °C) raggiungano la temperatura ambiente prima dell'imaging per evitare la condensa sul vetro. Salta questo passaggio se procedi direttamente all'imaging dopo la preparazione del campione.
  2. Accendi il sistema del microscopio: microscopio, camera sCMOS, unità laser e il computer con il software di acquisizione delle immagini. Lasciare che il sistema di microscopio si stabilizzi per 5-10 minuti dopo l'accensione per permettere ai componenti del sistema di raggiungere temperature di funzionamento e minimizzare la deriva termica.
    NOTA: il mSAL può essere eseguito utilizzando qualsiasi configurazione di microscopio TIRF e software compatibile. Accendi il sistema secondo le istruzioni dello strumento.
  3. Applicare olio a immersione su un obiettivo TIRF (ad esempio, 100x/1.49) e montare il vetro di copertura camerato sul palco del microscopio.
    NOTA: Se l'obiettivo è dotato di un collare correttivo, assicurarsi che sia impostato allo spessore corretto del vetro di copertura a 23 °C. Il vetro di copertura utilizzato in questo studio aveva uno spessore di 0,13-0,17 mm.
  4. Se equipaggiato, attivate il Sistema di Messa a Foco Perfetto (PFS), poi sollevate con attenzione l'obiettivo verso il vetro di copertura e portate il campione a fuoco.
  5. Prepara i colloidi d'oro come marcatori fiduciali (diluizione 1:2 in acqua ultra-pura). Sonica i colloidi d'oro prima di diluirli per 3 minuti per disperdere gli aggregati.
  6. Aspirare delicatamente il buffer di stoccaggio (DPBS o buffer bloccante) dal pozzo del campione e aggiungere 200 μL della soluzione colloidale d'oro al campione. Incuba per 1 minuto e rimuovi la soluzione.
  7. Usa l'illuminazione a campo chiaro per verificare che siano stati depositati abbastanza colloidi d'oro prima di aspirare la soluzione. Una densità ideale consiste in 5-10 colloidi d'oro all'interno della regione di interesse (ROI) designata.
    NOTA: In alternativa, microsfere fluorescenti (vedi Tabella dei Materiali) possono essere utilizzate con una diluizione di 1:1.000 in DPBS.
  8. Lavare 1 volta con 500 μL di acqua ultra-pura per rimuovere l'eccesso di colloidi d'oro, poi aggiungere 200 μL di DPBS.
  9. Nel software di imaging, si crea la configurazione ottica per il fluorofero (della sonda anticorpale), includendo la giusta dicroica, lunghezza d'onda di eccitazione laser e densità di potenza, tempo di integrazione della fotocamera, filtro di emissione e binning dei pixel della fotocamera (se applicabile). Si raccomanda una dimensione di pixel di 150-160 nm per ottenere una risoluzione ottimale.
  10. Crea una configurazione ottica per una fase di fotosbiancamento. Si raccomanda una potenza laser di 380 W/cm 2 o superiore con un tempo di integrazione della fotocamera di 1 s.
    NOTA: Lo sbiancamento fotoelettrico durante l'acquisizione aiuta a minimizzare la sovrapposizione tra i singoli eventi di legame degli anticorpi fluorescenti. La luce raccolta può essere diretta attraverso un filtro a emissione con lunghezza d'onda non corrispondente per evitare la saturazione della telecamera.
  11. Regola l'angolo laser per stabilire l'illuminazione TIRF. Utilizzando l'illuminazione del campo chiaro, identifica una cella per mSAL. Assicurarsi che almeno 5 colloidi dorati siano visibili all'interno del ROI per correggere la deriva dello stadio durante la ricostruzione dell'immagine. Confermare l'autofluorescenza dei colloidi dorati alla densità di potenza del laser d'immagini.
  12. Imposta i parametri di immagini: intervallo non illuminativo (NII), numero di fotogrammi e frequenza del passaggio di fotosbiancamento (se necessario) nel software di acquisizione dell'immagine. Per la mSAL di CD81 su cellule U2OS e Jurkat T con anticorpi CD81, le impostazioni ottimali erano un NII di 5 s, 2.000 fotogrammi totali e un passaggio di fotosbiancamento ogni 5° fotogramma.
    NOTA: Questi parametri devono essere ottimizzati per ogni proteina di interesse, per l'anticorpo utilizzato per l'mSAL e per il tipo cellulare. Consulta il passo 3 per maggiori dettagli sull'ottimizzazione. Il numero ottimale di frame può variare sia tra il bersaglio degli anticorpi sia tra il tipo cellulare. Per nuovi sistemi bersaglio, si consiglia di catturare 2.000-3.000 fotogrammi come punto di partenza. I NII estendono la durata dell'acquisizione delle immagini. Ad esempio, un'acquisizione mSAL di 3.000 frame con un NII di 20 s comporta ~17 h di tempo di acquisizione.
  13. Preparare il tampone di imaging diluendo l'anticorpo CD81 a una concentrazione di 1 μg/mL in 200 μL del 5% di BSA (p/v) in DPBS. Per il mSAL di CD81, la concentrazione finale di anticorpi è stata di 0,5 nM per le cellule T di Jurkat e 2 nM per le cellule U2OS.
    NOTA: La concentrazione di anticorpi dipende dall'abbondanza locale del substrato e dall'affinità dell'anticorpo. È fondamentale ottimizzare le concentrazioni di anticorpi per ogni bersaglio proteico, ogni anticorpo utilizzato per l'imaging e ogni tipo cellulare. Consulta il passo 3.1 per maggiori dettagli sull'ottimizzazione.
  14. Aggiungi il buffer di imaging preparato al pozzo e inizia l'acquisizione.

3. Ottimizzazione dei parametri di imaging

NOTA: i parametri di imaging del mSAL sono influenzati dall'espressione proteica, dalla sua organizzazione locale e dalla scelta dell'anticorpo utilizzato per l'imaging. L'obiettivo dell'ottimizzazione dei parametri di imaging è identificare la concentrazione di anticorpi e l'NII che producono eventi a singola molecola risolti spazialmente, mantenendo densità sufficientemente elevate da massimizzare il campionamento dell'epitopo.

  1. Concentrazione di anticorpi
    1. Diluire l'anticorpo a 0,5 nM per le cellule Jurkat e 2 nM per le cellule U2OS in 200 μL di BSA al 5% (p/v) in DPBS e aggiungere la soluzione di anticorpi al pozzo. Per una marcatura ottimale a singolo anticorpo, si utilizza una concentrazione di anticorpi pari o vicina alla costante di dissociazione di equilibrio (Kd); se Kd è sconosciuto, si consiglia di iniziare da 1 nM.
    2. Utilizzare la funzione live-view nel software di imaging configurato per mSAL per monitorare il legame degli anticorpi.
    3. Regolare l'angolo TIRF e i parametri di imaging per ottenere un rapporto segnale-rumore (SNR) di ≥ 3.
      NOTA: Un angolo ottimale del TIRF migliora il SNR limitando la fluorescenza fuori fuoco dovuta agli anticorpi diffusi nel buffer di imaging. Una densità di potenza laser di 100-200 W/cm2 e un tempo di integrazione della telecamera di 50 ms possono essere utilizzati all'inizio. Se il SNR è basso, aumentare gradualmente la potenza del laser e/o il tempo di integrazione della telecamera e monitorare le variazioni del SNR fino a raggiungere un valore ottimale.
    4. Configura i parametri di imaging nel software di acquisizione dell'immagine per ottenere almeno un'acquisizione di 10 fotogrammi con un NII di 5 s (vedi passo 2.12).
      NOTA: Un NII da 5 s è consigliato come punto di partenza. Dovrebbe essere eseguita una scansione NII per identificare la NII ottimale per un nuovo sistema anticorpi-bersaglio (passo 3.2).
    5. Inizia l'acquisizione. Valuta la scarsità delle localizzazioni a singola molecola del film registrato.
      NOTA: I passaggi dettagliati per ottenere la densità di localizzazione sono descritti in una precedentepubblicazione 24. Una densità di localizzazione di singola molecola tra 0,02 e 0,15 eventi/μm 2 si è rivelata ottimale per mSAL.
    6. Se vengono osservati immediatamente dopo l'aggiunta del tampone di imaging o si accumulano localizzazioni di singole molecole nel tempo con il progredire della registrazione, si interrompe l'acquisizione. Riduci la concentrazione di anticorpi di due volte e ripeti l'acquisizione su un nuovo campione. Ripetere questo processo di riduzione della concentrazione di anticorpi di due volte e rivalutare il numero di eventi per unità di area fino a raggiungere la densità desiderata di localizzazione di singola molecola.
      NOTA: Gli eventi sovrapposti si manifestano come molteplici punti grandi che diventano più luminosi o più grandi al momento del legame di un nuovo anticorpo all'interno del limite di diffrazione del primo anticorpo.
    7. Se la densità di eventi è scarsa, aumentare la concentrazione di anticorpi nel buffer di imaging di 2 volte e ripetere l'acquisizione su un nuovo campione. Ripetere questo processo di aumento della concentrazione di anticorpi di 2 volte e rivalutazione del numero di eventi di legame per unità di area fino a raggiungere la densità desiderata di localizzazione di singola molecola.
      NOTA: Si raccomanda di utilizzare un campione nuovo per ogni prova di ottimizzazione della concentrazione per evitare potenziali interferenze da anticorpi pre-legati nelle successive valutazioni di densità di localizzazione.
  2. Ottimizzazione NII
    1. Configura i parametri di imaging nel software di acquisizione per ottenere un'acquisizione di 50 fotogrammi (vedi passo 2.12). Imposta il NII a 0 (senza ritardo).
    2. Prepara il buffer di imaging alla concentrazione ottimizzata di anticorpi del passaggio 3.1 e aggiungilo al po' campione. Inizia l'acquisizione.
    3. Ripeti i passaggi 3.2.1-3.2.2, regolando i NII a 1, 3, 5, 10 o 20 secondi. Effettua ogni acquisizione su un nuovo campione.
    4. Valuta la densità e la scarsità delle localizzazioni a singola molecola del film registrato (vedi passaggi 3.1.5-3.1.7). Il NII più basso con la densità ottimale di eventi di singola molecola è determinato come NII ottimale.
      NOTA: La concentrazione di anticorpi potrebbe dover essere ulteriormente ottimizzata per raggiungere la densità ottimale di localizzazione di singola molecola per il corrispondente NII. Fai riferimento al passo 3.1. Rapporti precedenti mostrano che i NII più lunghi (10-20 s) erano più selettivi verso eventi di legame ad alta densità, ma l'estensione del NII oltre i 20 s non ha prodotto un miglioramentoaggiuntivo 23,24. Se si verificano eventi di legame sovrapposti spazialmente durante l'acquisizione dell'immagine, si introduce una fase di fotosbiancamento a intervalli sufficienti a rimuovere la fluorescenza dagli anticorpi legati. Ad esempio, se si verificano eventi sovrapposti entro il quinto fotogramma, applica fotosbiancamento ogni cinque fotogramma. L'apparizione di eventi spazialmente sovrapposti è descritta nella NOTA del passo 3.1.6.

4. Analisi dei dati

NOTA: la ricostruzione dell'immagine mSAL utilizza il software gratuito NIH, Fiji29, con il plugin ThunderSTORM30 . Fiji versione v1.54r e ThunderSTORM versione 1.3 furono utilizzate in questo protocollo. Un'analisi dettagliata delle immagini è stata descritta in un precedente protocollo 24. In questa sezione, illustriamo il flusso di lavoro di analisi utilizzato specificamente per mSAL. L'analisi presentata in questo protocollo utilizzava una fotocamera Prime95B sCMOS (numero di serie A18B203004) con fotoelettroni per A/D di 0,98 e il livello di base della fotocamera di 100. La dimensione del pixel di imaging impostata a 147 nm.

  1. Imposta i parametri per la ricostruzione nella finestra di Analisi Run. I parametri utilizzati per le ricostruzioni dell'immagine CD81 mSAL sono descritti di seguito. La funzione Anteprima dovrebbe essere utilizzata per valutare gli eventi di legame a singola molecola rilevati nel frame selezionato prima di eseguire l'analisi completa.
    Filtraggio delle immagini:
    Filtro: Filtro a wavelet (B-spline)
    Ordine B-Spline: 2
    Scala B-Spline: 4
    Localizzazione approssimativa delle molecole:
    Metodo: Massimo locale
    Soglia di intensità di picco: std(Onda.F1)
    Connettività: 8-quartiere
    Localizzazione sub-pixel delle molecole:
    Metodo: PSF: Gaussiana integrata
    Raggio di raggio di adattamento [px]: 2
    Metodo di adattamento: Massima verosimiglianza
    Sigma iniziale [px]: 0,75
    Analisi dell'adattamento multi-emettitore: non selezionato
    Visualizzazione dei risultati:
    Metodo: Gaussiana normalizzata
    Ingrandimento: 7,3
    Frequenza di aggiornamento [frame]: 50
    Incertezza laterale: 20
    NOTA: I parametri di pre-filtraggio sono utilizzati per migliorare la rilevazione a singolo emettitore sul fondo. Servono come punti di partenza ma dovrebbero essere ottimizzati per ogni dataset. I parametri approssimati di localizzazione e metodo di rilevamento sono utilizzati per gli eventi di legame a singola molecola. L'uso di massimi di intensità locale con connettività a 8 vicini dimostra di fornire prestazioniaffidabili 31. Il metodo gaussiano integrato con adattamento a massima verosimiglianza è stato scelto poiché ampiamente utilizzato e fornisce una approssimazione affidabile della funzione di diffusione puntuale (PSF) nelle applicazioni di imaging a singolamolecola 32,33,34,35. Il metodo di visualizzazione utilizzato in questo protocollo è Normalized Gaussian. Gli utenti possono selezionare il metodo di visualizzazione che meglio si adatta ai loro dati. L'ingrandimento è stato impostato per produrre una dimensione ricostruita del pixel di 20 nm, appropriata per la precisione di localizzazione attesa ottenuta con l'etichettatura basata su anticorpi, dove l'errore di collegamento è dell'ordine di ~10 nm. Il fattore di ingrandimento di 7,3 è stato calcolato dividendo la dimensione del pixel limitato dalla diffrazione per la dimensione del pixel ricostruito desiderato (147 nm / 20 nm = 7,3). La frequenza di aggiornamento determina quanto spesso l'immagine ricostruita viene aggiornata durante l'elaborazione, ma non influenza il risultato finale. L'incertezza laterale è impostata a 20 (ma non forzata) in modo che la ricostruzione incorpori le incertezze di localizzazione calcolate. Per ulteriori dettagli sulle opzioni disponibili, consulta la Guida Utente30 di ThunderSTORM o clicca sul punto interrogativo accanto al campo di input.
  2. Inizia l'analisi ThunderSTORM con un sigma iniziale di 1,6 pixel e un raggio di adattamento di 3. Affina i parametri secondo necessità. Non è stato utilizzato il raccordo multiemettitore, poiché le densità di eventi sono state mantenute non sovrapposte nelle immagini limitate dalla diffrazione.
  3. Clicca su Ok per eseguire la ricostruzione. Una volta completato, la finestra dei risultati si aprirà automaticamente.
  4. Usa la funzione Plot histogramma per trovare il sigma picco. Converti questo valore (nm) in pixel dividendo per la dimensione dei pixel dei dati grezzi, poi riesegui l'analisi ThunderSTORM usando il nuovo valore per sigma iniziale e il raggio di adattamento impostato a un intero vicino a 3x sigma30 iniziale.
  5. Determinare la correzione di deriva usando il marcatore fiduciarioselezionato 24.
  6. Esegui la ricostruzione dell'immagine su tutto il campo visivo e applica la correzione di deriva calcolata.
  7. Per la post-elaborazione dell'immagine, clicca sulla scheda Filtro della finestra dei risultati. Applica filtri per rimuovere eventi poco localizzati. Nei risultati visualizzati per CD81, sono stati rimossi gli eventi con sigma superiore a 200 nm e incertezza superiore a 20 nm. Utilizzare la funzione Plot histogram per esaminare la distribuzione sigma e determinare un cutoff appropriato.
    NOTA: Le localizzazioni a singole molecole con alti valori sigma derivano tipicamente da fluorofori deboli con basso conteggio di fotoni o da emettitori sovrapposti. Sono state rimosse anche le localizzazioni con un'incertezza superiore a 20 nm, poiché un'incertezza superiore alla dimensione finale del pixel indica scarsa accuratezza di localizzazione. Per ulteriori indicazioni sui parametri di filtraggio, consultare la Guida Utente30 di ThunderSTORM.
  8. Salva la tabella dei risultati con i dati di localizzazione di singola molecola per le analisi a valle selezionando Esporta. Il file esportato sarà in .csv formato di file e sarà chiamato mSAL.csv in questo protocollo. Salva l'immagine Gaussiana Normalizzata risultante.

5. Analisi del cluster

NOTA: Durante la sondaggio dell'epitopo, gli anticorpi interagiscono con i loro bersagli previsti (interazioni specifiche) così come con molecole fuori bersaglio (interazioni aspecifiche). Poiché mSAL si basa sulla rilevazione cumulativa di singoli eventi di legame anticorpo-antigene, alcune interazioni non specifiche contribuiscono inevitabilmente alla ricostruzione dell'immagine. Le interazioni anticorpi-epitopi mostrano impronte cinetiche distinte che possono, in linea di principio, distinguere il legame specifico da quello non specifico, dove eventi specifici e non specifici sono differenziati per la loro densità di interazione locale, piuttosto che per la permanenza di una singola molecola moltiplicata per36. Qui, viene descritta un'analisi basata sulla densità di clustering spaziale di applicazioni con rumore (DBSCAN)37 per rimuovere eventi a bassa densità, mantenendo eventi ad alta densità che sono più propensi a riflettere specifici legame di anticorpi. Inoltre, il clustering basato sulla densità può fornire anche approfondimenti quantitativi sull'organizzazione spaziale nanoscala delle proteine, in particolare quelle note per organizzarsi naturalmente in cluster, come CD81 in microdomini arricchiti datetraspanina 38,39,40,41,42. L'analisi DBSCAN fornita è stata eseguita utilizzando MATLAB 2025a. Per gli utenti senza accesso a MATLAB, è consigliato eseguire analisi DBSCAN simili con alternative open source come Python o R 43,44,45. Il codice utilizzato in questo protocollo può essere ottenuto da: https://github.com/nrams12/DBSCAN_SAL_Clusterer/tree/main.

  1. Esecuzione del codice
    1. Scarica il file MATLAB dal link GitHub sopra.
    2. Avvia MATLAB e apri il codice. Sulle righe 37 e 38, imposta il numero minimo di punti (minPTS) ed epsilon per i parametri di clustering. Sono stati utilizzati i seguenti parametri:
      Cellule T Jurkat:
      minPTS: 7
      Epsilon: 60
      Celle U2OS:
      minPTS: 7
      Epsilon: 80
      NOTA: Vedi il passaggio 5.2 per ulteriori dettagli sull'ottimizzazione di questi parametri.
    3. Imposta il percorso file nel software MATLAB sulla cartella che contiene il file mSAL.csv ricostruito.
    4. Esegui il codice cliccando su Esegui. Il codice inviterà l'utente a selezionare un file. Seleziona il file mSAL.csv e clicca su Apri.
    5. I dati clusterizzati vengono automaticamente salvati nella cartella chiamata MATLAB Data nel percorso file designato all'interno del codice. Apri questo file in ThunderSTORM cliccando su Plugin > ThunderSTORM > Importa/Esporta > Importa.
    6. Salva l'immagine risultante della microscopia di localizzazione a singola molecola.
  2. Ottimizzazione degli input di clustering
    NOTA: I due parametri di input per l'algoritmo DBSCAN sono il minPTS ed epsilon. Epsilon definisce il raggio attorno a un punto per stabilire il suo vicinato, mentre minPTS specifica il numero minimo di punti all'interno di quel vicinato necessari per formare una regione densa. I punti che soddisfano questo requisito di densità sono classificati come punti nucleo, e i loro intorni vengono aggiunti ricorsivamente al cluster. I punti che non soddisfano il requisito di densità ma si trovano nel vicinato di un punto nucleoso sono etichettati come punti di confine, mentre tutti i punti rimanenti sono considerati punti di rumore.
    1. Esegui l'analisi utilizzando gli input descritti sopra (passo 5.1.2) come punto di partenza. Scegli un valore minPTS che sia superiore al numero di localizzazioni del rumore ma inferiore al numero di localizzazioni sulla cella. Dopo aver selezionato minPTS, si aggiusta l'epsilon in modo che questo numero di localizzazioni possa essere catturato all'interno del raggio di vicinato per le regioni rappresentative on-cell.
      NOTA: minPTS ed epsilon possono essere regolati indipendentemente l'uno dall'altro. Un approccio pratico per selezionare questi parametri è prima esaminare il diagramma di scatter dei punti di rumore fuori dalla cella e confrontarli con il numero di localizzazioni osservate all'interno di aree di dimensioni simili sulla cella.
    2. Valuta la finestra etichettata come Figura 2 che mostra i dati raggruppati. Se i dati mantengono clusters sulla cellula contenente il fenotipo atteso con localizzazioni minime al di fuori della cellula, gli input di clustering sono adeguati.
      NOTA: I dati clusterizzati dovrebbero mantenere la struttura dei dati acquisiti tramite mSAL. Se i cluster appaiono piccoli, localizzati solo nelle regioni ad altissima densità dei dati originali, e escludono un numero significativo di eventi di legame che corrispondono al fenotipo atteso, i parametri di clustering potrebbero essere troppo restrittivi. Se il legame aspecifico fuori dalla cella non è sufficientemente ridotto con cluster grandi, i parametri di clustering potrebbero essere troppo inclusivi.
    3. Se i parametri di clustering sono troppo restrittivi, diminuire il minPTS e aumentare l'epsilon per includere più punti nei dati clusterizzati. Se i parametri di clustering sono troppo inclusivi, aumentare il minPTS e diminuire l'epsilon.
    4. Dopo aver regolato minPTS ed epsilon, rieseguire il codice. Ripeti i passaggi 5.2.2-5.2.3 fino a raggiungere il clustering ottimale.

6. Validazione del legame degli anticorpi al suo target

NOTA: Per proteine di membrana senza morfologia ben definita, validare l'accuratezza delle strutture risolte può essere una sfida. Per convalidare la specificità degli anticorpi, gli utenti possono esprimere una fusione di proteine fluorescenti (FP) della proteina bersaglio. Come primo controllo, la colorazione convenzionale a immunofluorescenza può essere eseguita sulle cellule che esprimono la fusione FP. Per una validazione più precisa nella valutazione di nuovi anticorpi, può essere eseguito mSAL sulle cellule che esprimono FP per confermare che gli eventi di legame localizzati corrispondono al bersaglio marcato fluorescente. Qui, come esempio, viene descritto un protocollo per la trasfettazione delle celle U2OS con CD81-mStayGold, che consente la conferma che le localizzazioni mSAL di CD81 corrispondono al CD81 marcato FP sulla superficie della cella. Gli utenti possono sostituire qualsiasi proteina fluorescente adatta, a condizione che la sua emissione non si sovrapponi al canale di fluorescenza dell'anticorpo convalidato.

  1. Seed le cellule U2OS in una camera a 8 pozzi e crescono fino a ~70% di confluenza. Mantenere le cellule in 200 μL di mezzo di crescita completo (DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% (v/v), 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di estreptomicina).
  2. Combinare 100 ng del costrutto di DNA che codifica la proteina con un reporter fluorescente con 5 μL di Lipofectamina 2000. Vortice per 30 secondi e incuba per 30 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Questo studio ha utilizzato CD81 fuso a mStayGold. Sono state impiegate tecniche standard di clonazione molecolare per generare plasmidi di DNA, anche se queste non sono descritte in questo protocollo. Il DNA: I rapporti di lipofectamina forniti sono ottimizzati per le cellule seminate in vetri a 8 pozzi e potrebbero necessitare di aggiustamenti secondo le istruzioni del produttore per altri formati di campione.
  3. Aggiungi 5 μL di soluzione di DNA/Lipofectamina alle cellule. Incubare il vetrino della camera per 4 ore a 37 °C, integrato con il 5% diCO2 in un ambiente umido.
  4. Sostituisci il substrato con un mezzo di crescita completo già riscaldato. Incubare per > 8 ore a 37 °C integrato con il 5% di CO2 in un ambiente umido per consentire livelli rilevabili di espressione proteica.
  5. Valutare i livelli di espressione di fluorescenza sulle cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza o un imager. Si raccomanda un'efficienza di trasfezione di ≥ 30%. Se i livelli di espressione fluorescente sono subottimali, ottimizzare il rapporto DNA: Lipofectamina secondo le linee guida del produttore.
    NOTA: Le cellule a espressione transitoria devono essere utilizzate per la validazione degli anticorpi entro 24-48 ore dalla trasfezione.
  6. Per riparare le cellule, si prega di seguire i passaggi 1.2.8-1.2.13.
  7. Conservare i campioni fissi in 200 μL di DPBS con 5 mM azide di sodio fino alla prontezza per l'imaging. I campioni possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 1 mese.
    ATTENZIONE: L'azida di sodio è estremamente tossica e può essere fatale se ingerita. Indossa DPI appropriati quando maneggia questo reagente. In caso di contatto con la pelle, lava immediatamente accuratamente l'area interessata con acqua e sapone. Smaltire il reagente secondo le linee guida dell'istituzione dell'utente e tutte le normative locali, statali e federali applicabili.
  8. Segui i passaggi 2.1-2.12 per montare il microscopio e montare il campione. Identifica una cellula che esprime la proteina di interesse usando il segnale di fluorescenza.
  9. Per riferimento, cattura un'immagine TIRF della cellula. Se viene utilizzata una proteina fluorescente nello stesso canale di imaging dell'anticorpo mSAL, esegui fotosbiancamento della proteina fluorescente. Per photobleach la proteina, utilizzare la massima potenza laser per > 10 minuti finché non viene osservato alcun segnale.
  10. Aggiungi il buffer di imaging preparato al pozzo e inizia l'immagini. L'analisi deve essere completata come descritto in precedenza (passo 4).
  11. Apri sia l'immagine ricostruita che l'immagine TIRF della proteina fluorescente acquisita prima dell'acquisizione dell'mSAL. Valuta le posizioni di legame degli anticorpi mSAL confrontando l'aspetto e le localizzazioni della proteina espressa, rappresentata nell'immagine TIRF limitata dalla diffrazione, con l'immagine mSAL.

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Risultati

La tecnica mSAL descritta in questo protocollo consente la visualizzazione di singoli eventi di legame di anticorpi ai rispettivi bersagli proteici di membrana plasmatica, produendo una mappa a super-risoluzione della distribuzione delle proteine di membrana. CD81 è usato qui come esempio rappresentativo, anche se l'approccio è facilmente adattabile ad altre proteine di membrana.

L'immobilizzazione delle cellule T di Jurkat con sufficiente distanza tra le cell...

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Discussione

L'organizzazione delle proteine della membrana plasmatica svolge un ruolo fondamentale nella regolazione della funzione cellulare. Le tecniche convenzionali di microscopia a fluorescenza sono limitate dal limite di diffrazione della luce, che ne maschera l'organizzazione su scala nanometrica. SMLM supera questa limitazione raggiungendo risoluzioni spaziali di 10-20nm 47, permettendo la caratterizzazione dei loro assemblaggi in scalananometrica

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Dichiarazioni

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute of General Medical Sciences dei National Institutes of Health sotto il Premio Numero R35GM146786 e dal College of Liberal Arts and Sciences dell'Università dell'Illinois Chicago. Il contenuto è esclusivamente di responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anticorpo anti-CD81 Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificMA5-44132Anticorpi per imaging
Centrifuga da bancoEppendorf5424
Albumina sierica bovinaMilliporeSigmaA7906-100G
Vetro a coperchio camerato, 8 pozziCellvisC8-1-N
Media DMEMThermo Fisher Scientific11960069
Soluzione salina tamponata a fosfato di DulbeccoThermo Fisher Scientific14190-144
Siero bovino fetaleMilliporeSigmaF0926-500ML
Glutaraldeide, 10 %Scienze della microscopia elettronica16120
Colloidi d'oro, 100 nmTed Pella15711 e meno; 20Marcatore fiduciario
Olio per immersione Laboratori Cargille16245
Microscopio rovesciato  equipaggiato con modulo TIRFStrumenti NikonEclipse Ti2-EMicroscopio
Linea cellulare Jurkat E6.1MilliporeSigma88042803-1VLCelle di sospensione
Lancio laser, 6 lineeOxxiusL6CC-CS8-1511Laser di eccitazione
Lipofectamina 2000Thermo Fisher Scientific11668019Reagente di trasfezione
Tubo a microcentrifuga, 1,5 mL VWR89000-028
Software per l'imaging microscopicoStrumenti NikonRicerca Avanzata NIS-ElementsSoftware per l'acquisizione delle immagini
Objective, 100x/1.49 CFI APO TIRF & nbsp;Strumenti NikonMRD01991Obiettivo del microscopio
Paraformaldeide, 16%Scienze della microscopia elettronica15710
Penicillina-StreptomicinaThermo Fisher Scientific15140-122Antibiotici
Soluzione di poli-L-lisina, 0,01% MilliporeSigmaP4707-50ML
Fotocamera Prime 95B sCMOSSoluzioni Teledyne Vision01-PRIME-95B-R-M-16-CFotocamera
Supporti RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093Mezzi per celle di sospensione
Azida di sodioThermo Fisher Scientific19038-1000
Boridriduro di sodioMilliporeSigma213462-25G
Fiaschette di coltura T25Thermo Fisher Scientific169900
Microsfere TetraSpeckMarcatore fiduciario
Piatto di coltura tissutale, 100 mm Corning353003
Linea cellulare U2OSATCCHTB-96Cellule aderenti

Riferimenti

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