Profilazione fitochimica, cromatografia gassistica–analisi di spettrometria di massa e attività in vivo della mantalia di Terminalia nei ratti

Sommario

Qui presentiamo un protocollo che integra analisi fitochimica, cromatografia gassografica–caratterizzazione di spettrometria di massa e saghi validati in vivo per valutare le attività antinfiammatorie, analgesiche e antipiretiche di Terminalia mantaly, fornendo un quadro riproducibile per la valutazione farmacologica delle piante medicinali.

Abstract

I farmaci sintetici per infiammazione, dolore e febbre sono efficaci ma spesso causano effetti avversi, aumentando l'interesse per alternative terapeutiche di origine vegetale. Terminalia mantaly H. Perrier, tradizionalmente utilizzata nella medicina africana, ha una validazione scientifica limitata. Questo studio presenta un protocollo sperimentale integrato che combina screening fitochimico, analisi quantitativa di composti fenolici e flavonoidi, caratterizzazione della cromatografia gassosa–spettrometria di massa (GC-MS) e test farmacologici in vivo per valutare il potenziale terapeutico dell'estratto metanolico di T. mantaly. Lo screening fitochimico ha confermato la presenza di molteplici classi bioattive, e l'analisi GC–MS ha identificato venti costituenti, tra cui acidi grassi, fitosteroli, tocoferoli e altri composti bioattivi con proprietà note come antinfiammatori e antiossidanti. La valutazione farmacologica in vivo nei ratti ha dimostrato un'attività antinfiammatoria dosodependente nel modello di edema delle zampe indotto dalla carragenina, un prolungamento significativo della latenza da sospensione dal dolore nell'analisi a immersione della coda e una riduzione della piressia indotta dal lievito. A dosi più elevate, l'estratto ha mostrato effetti paragonabili a farmaci standard come diclofenac e paracetamolo. Le valutazioni di tossicità acuta e citotossicità hanno indicato un profilo di sicurezza favorevole all'interno dell'intervallo di dosaggio testato. Insieme, questi risultati convalidano l'uso etnomedicinale di T. mantaly e dimostrano un quadro sperimentale riproducibile per collegare la composizione fitochimica all'attività farmacologica. Il protocollo fornisce un riferimento metodologico pratico per i ricercatori che studiano le piante medicinali e supporta lo sviluppo di agenti di origine vegetale per la gestione di condizioni infiammatorie e febbrili.

Introduzione

Infiammazione, dolore e febbre sono processi patologici interconnessi che sono alla base di una vasta gamma di malattie acute e croniche. Sebbene farmaci sintetici come agenti antinfiammatori non steroidei, corticosteroidi e paracetamolo rimangano la base della terapia, il loro uso a lungo termine è spesso associato a irritazioni gastrointestinali, complicazioni renali, epatotossicità e altri effetti avversi¹. Queste limitazioni hanno stimolato un crescente interesse per le piante medicinali come alternative più sicure e sostenibili per la gestione di condizioni infiammatorie e febbrili. I prodotti naturali sono ben riconosciuti per la loro ricca diversità di molecole bioattive, molte delle quali rappresentano pianti per lo sviluppo moderno di farmaci. In questo contesto, T. mantaly, membro della famiglia Combretaceae, ha attirato l'attenzione per il suo uso etnomedicinale nei sistemi tradizionali africani per il trattamento di infezioni, disturbi gastrointestinali e disturbi^{infiammatori 2,3}. Nonostante la sua rilevanza tradizionale, gli studi farmacologici sistematici che ne convalidano il potenziale terapeutico rimangono limitati. In particolare, vi è una carenza di indagini complete che integrino lo screening fitochimico, valutazioni biologiche in vivo e metodi avanzati di profilazione chimica, come GC–MS. Affrontare questa lacuna è cruciale per sostenere scientificamente le sue applicazioni folcloristiche e identificare potenziali composti piofili per l'uso^{farmaceutico 4}. Nel presente studio, l'estratto metanolico di T. mantaly è stato sottoposto a una valutazione fitochimica e farmacologica dettagliata. L'analisi preliminare ha confermato la presenza di metaboliti chiave, tra cui fenolici, flavonoidi, tannini, saponine e terpenoidi, tutti noti per contribuire a effetti antinfiammatori, analgesici e^{antiossidanti 5}. I test quantitativi hanno inoltre rivelato che l'estratto conteneva livelli sostanziali di composti fenolici e flavonoidi, con valori comparabili agli standard di riferimento, suggerendo un forte potenziale antiossidante.

Sono stati utilizzati modelli animali perché le risposte farmacologiche valutate coinvolgono vie infiammatorie, neurali e termoregolatorie integrate che non possono essere riprodotte in vitro. I saggi in vivo fornivano chiare evidenze farmacologiche di bioattività. Le proprietà antinfiammatorie (edema delle zampe indotto dal carragenano), analgesiche (immersione della coda) e antipiretiche (piressia indotta dal lievito) sono state testate nei ratti, dimostrando un'attività antinfiammatoria dipendente dalla dose simile a quella del diclofenaco sodio a dosi più elevate. Analogamente, l'estratto ha aumentato le latenze di immersione della coda nei ratti, confermandone l'efficacia analgesica, mentre i modelli di piressia indotta dal lievito hanno mostrato effetti antipiretici marcati, molto simili a quelli del^{paracetamolo 6}. La profilazione chimica tramite analisi GC–MS ha fornito approfondimenti sulla sua composizione bioattiva. Sono stati identificati in totale 20 composti, tra cui 3,5-diidrossi-6-metil-2,3-diidro-4H-piran-4-uno, acido linoleico, γ-sitosterolo, squalene e vitamina E. Questi composti sono ben documentati per le loro proprietà antiossidanti, antinfiammatorie e cardioprotettive, a supporto degli esiti farmacologici^{osservati 7,8}. È importante sottolineare che le valutazioni della tossicità hanno rivelato effetti citotossici trascurabili, sottolineandone la sicurezza alle dosi testate. Nel complesso, questo studio colma una lacuna critica fornendo sia prove fitochimiche che farmacologiche sul valore medicinale di T. mantaly. I risultati non solo confermano le sue applicazioni tradizionali, ma ne evidenziano anche il potenziale come fonte naturale di composti piombo per sviluppare nuove terapie contro l'infiammazione e i disturbi correlati. I modelli sperimentali utilizzati in questo studio riflettono principalmente risposte infiammatorie acute e nocicettive e quindi forniscono evidenze farmacologiche preliminari piuttosto che un'indicazione diretta di efficacia terapeutica cronica.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida internazionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e hanno rispettato le raccomandazioni OCSE. Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) dell'Università Bahauddin Zakariya, Multan. (Approvazione n. 3 /UREC/2025). Furono fatti tutti gli sforzi per minimizzare la sofferenza animale e ridurre il numero di animali utilizzati.

1. Preparazione dell'estratto metanolico intero di T. mantaly (TMWM)

1. Raccogli steli, radici e foglie fresche di T. mantaly, autentica il materiale vegetale e deposita un esemplare voucher in un erbario riconosciuto.
   NOTA: Il materiale vegetale utilizzato in questo studio è stato raccolto dal Punjab Nursery, Mattital Road, Multan, il 12 novembre 2023. Le coordinate geografiche del sito di raccolta sono 30.2236° N, 71.4755° E. L'impianto è stato autenticato tassonomicamente dal tassonomo Prof. Dr. Zafar Ullah Zafar, professore di botanica presso la Bahauddin Zakariya University di Multan, e un campione voucher (www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-2434420) furono depositati nell'erbario della Bahauddin Zakariya University di Multan. La pianta è stata raccolta dal suo habitat naturale in condizioni ambientali adeguate, e il sito di raccolta è stato documentato con fotografie.
2. Lavare il materiale vegetale con acqua del rubinetto, seguita da acqua distillata per rimuovere i contaminanti, quindi asciugare all'ombra a 25–30 °C per 7–10 giorni fino a raggiungere un peso costante.
3. Macinare il materiale essiccato fino a ottenere polvere grossollana e pesare 500 g usando una bilanza analitica. Trasferisci la polvere in un contenitore di vetro pulito e aggiungi 2,5 L di metanolo.
4. Maceratizzare la miscela a temperatura ambiente per 72 ore con agitazioni intermittenti ogni 6–8 ore. Filtra attraverso la carta filtro Whatman No.1.
5. Concentrare il filtrato a pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante a 39 °C, poi conservare l'estratto essiccato in contenitori ermetiche a temperatura ambiente fino all'uso.
   ATTENZIONE: Il metanolo è tossico e infiammabile. Esegui la maneggezione all'interno di una cappa fumaria indossando guanti e occhiali protettivi. Smaltire i rifiuti solventi secondo le linee guida istituzionali per la sicurezza chimica.
   NOTA: L'estratto essiccato può essere conservato in contenitori ermetici a temperatura ambiente per diverse settimane prima di ulteriori analisi.

2. Stima del contenuto fenolico totale (metodo Folin–Ciocalteu)

1. Preparare la soluzione di stocco di acido gallico (100 μg/mL) sciogliendo 10 mg di acido gallico in 100 mL di metanolo e preparare diluizioni seriali da 1 a 10 μg/mL.
2. Sciogliere estratto da 10 mg in 10 mL di metanolo per ottenere una soluzione da 1 mg/mL. Trasferire 0,5 mL di ogni standard o campione nelle provette.
3. Aggiungi 2,5 mL di reagente Folin–Ciocalteu diluito 1:1 con acqua, poi aggiungi 2,0 mL di soluzione di carbonato di sodio al 7,5%. Mescola e incuba a 25 ± 2 °C per 30 minuti.
4. Misura l'assorbenza a 765 nm rispetto a un reagente a vuoto e calcola il contenuto fenolico totale in mg di equivalenti di acido gallico per g estratto.

3. Stima del contenuto totale di flavonoidi (metodo del cloruro di alluminio)

1. Preparare una soluzione di stock di rutina (1000 μg/mL) sciogliendo la rutina nel metanolo, poi preparare diluizioni seriali nell'intervallo di 10–80 μg/mL.
2. Trasferire 0,5 mL della soluzione standard o estratta in provette e aggiungere 1,5 mL di metanolo, 0,1 mL di soluzione di cloruro di alluminio al 10% (AlCl₃), 0,1 mL di soluzione di acetato di potassio da 1 M e 2,8 mL di acqua distillata.
3. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti e misurare l'assorbenza a 415 nm. Esprime i risultati come mg di equivalenti di rutina per g^{estratto 9}.

4. Cromatografia dei gas–spettrometria di massa (GC–MS)

1. Sciogliere estratto da 10 mg in 1 mL di metanolo di grado HPLC e filtrare attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm in una fiala GC.
2. Eseguire analisi utilizzando un GC Agilent 7890B abbinato a un 5977A MS dotato di colonna capillare HP-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). Usa elio come gas portante a 1,0 mL/min con la temperatura dell'iniettore a 250 °C.
3. Mantenere la temperatura della sorgente ionica a 230 °C e la temperatura del quadrupolo a 150 °C. Programma il forno da 60 °C (2 min di mantenimento) a 180 °C a 10 °C/min e poi a 280 °C a 5 °C/min con una tenuta finale di 10 min.
4. Iniettare 1 μL dell'estratto filtrato in modalità split (10:1) e registrare cromatogrammi su un intervallo m/z di 40–600. Fai un solvente a vuoto prima dell'iniezione del campione.
5. Identificare i composti confrontando gli spettri con la libreria spettrale di massa del NIST e confermare le identità utilizzando la normalizzazione del tempo di ritenzione e dell'area di picco.

5. Attività antinfiammatoria (edema delle zampe indotto dalla carragenina)

1. Usa ratti Wistar albini sani che pesano 180–220 g e acclimatati per 7 giorni. Animali veloci durante la notte prima dell'esperimento con libero accesso all'acqua.
2. Dividere casualmente gli animali in cinque gruppi (n = 5 per gruppo). Somministrare soluzione fisiologica normale ai controlli; somministrare per via orale 100, 200 e 300 mg/kg ai gruppi di trattamento; e somministrare diclofenaco di sodio (40 mg/kg, sottocutaneo) al gruppo standard.
3. Dopo 1 ora, iniettare 0,1 mL di carragenino appena preparato all'1% nella regione subplantare della zampa posteriore destra.
4. Misura lo spessore della zampa a 0, 1, 2, 3 e 4 h usando una pinza vernier digitale e calcola l'aumento rispetto alla linea di base.
5. Determinare la percentuale di inibizione dell'edema rispetto al gruppo^{di controllo 10}.
   ATTENZIONE: La polvere di carragenina può causare irritazione. Evitare inalazioni e contatti cutanei e smaltire i rifiuti biologici secondo le procedure di biosicurezza istituzionale.

6. Attività analgesica (test di immersione della coda)

1. Usa ratti Wistar Albini acclimatati mantenuti in un ciclo di 12 ore luce/scure con libero accesso a cibo e acqua.
2. Dividere gli animali in cinque gruppi (n = 5). Somministrare acqua distillata ai gruppi di controllo, estrarre per via orale a 100, 200 e 300 mg/kg ai gruppi di trattamento e paracetamolo (20 mg/kg) al gruppo standard.
3. Mantieni il bagno d'acqua a 55 ± 1 °C. Immergi 1–2 cm della coda distale e registra la latenza di ritiro di base usando un tempo di taglio di 15 secondi.
4. Ripeti le misurazioni a 30, 60, 90 e 120 minuti dopo il trattamento, assicurandoti che la stessa porzione della coda venga immersa ogni volta.
5. Calcola la percentuale di aumento della latenza ed esprimi i risultati come media ± SD.

7. Attività antipiretica

1. Usa ratti acclimatati e registra la temperatura rettale normale usando un termometro digitale lubrificato.
2. Prepara una sospensione di lievito al 20% in acqua distillata e inietta sottocutaneamente a 10 mL/kg nel dorso per indurre la piressia.
3. Dopo 18 ore, misura nuovamente la temperatura rettale ed escludi gli animali che non mostrano almeno un aumento di 0,5 °C.
4. Dividere casualmente i ratti febbrili in cinque gruppi (n = 5 per gruppo). Somministrare soluzione salina normale al gruppo di controllo, estratto vegetale per via orale a 100, 200 e 300 mg/kg ai gruppi di trattamento, e paracetamolo (150 mg/kg) al gruppo standard.
5. Misurare la temperatura rettale a 0, 1, 2 e 3 ore dopo il trattamento e calcolare la riduzione rispetto al valore di base¹¹.
   ATTENZIONE: Le sospensioni di lievito di birra sono materiali biologici e devono essere maneggiate seguendo le precauzioni standard di biosicurezza. Smaltire i materiali in sospensione inutilizzati e contaminati come rifiuti biologici.
   NOTA: Dopo l'iniezione del lievito, gli animali possono essere rimessi in gabbie e mantenuti in condizioni standard fino alla misurazione della temperatura.

8. Studi sulla tossicità acuta

1. Condotte lo studio secondo la linea guida 423 dell'Organizzazione per la Cooperazione e lo Sviluppo Economico (OCSE) utilizzando ratti Wistar albini sani di entrambi i sessi che pesano tra 180 e 220 g.
2. Gli animali digiunano durante la notte prima della dosizzazione e li dividono casualmente in gruppi (n = 5 per gruppo).
3. Somministrare una singola dose orale di 5 g/kg di peso corporeo dell'estratto agli animali trattati e acqua distillata (1 mL/kg) agli animali di controllo.
4. Osserva gli animali continuamente per le prime 4 ore dopo la dose, periodicamente durante le prime 24 ore e quotidianamente per 14 giorni.
   NOTA: I criteri di osservazione includono cambiamenti nelle condizioni della pelle e del pelo, negli occhi e nelle mucose, nel pattern respiratorio, nella salivazione, nei tremori, nelle convulsioni, nell'attività locomotoria e nelle risposte comportamentali generali.
5. Registra i segni clinici di tossicità, mortalità e peso corporeo al Giorno 0, Giorno 7 e Giorno 14.
6. Valutare la sicurezza in base al tasso di sopravvivenza e ai cambiamenti comportamentali o fisici^{osservati 12}.
   NOTA: Il punteggio comportamentale include il monitoraggio della postura, dell'andatura, del livello di attività, del comportamento di cura personale, della risposta a stimoli esterni e dei segni di letargia o iperattività.

9. Analisi statistica

1. Compilare tutti i dati sperimentali ed esprimere i risultati come media ± deviazione standard con n = 5 animali per gruppo.
2. Inserisci i dati nel software GraphPad Prism in formato colonna.
3. Valutare la normalità dei dati utilizzando il test di Shapiro–Wilk prima di applicare l'analisi comparativa.
4. Esegui analisi statistiche utilizzando il software GraphPad Prism selezionando: Analizza → ANOVA unidirezionale → confronti multipli di Tukey.
5. Eseguire un'analisi unidirezionale della varianza seguita dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey per determinare la significatività statistica tra i gruppi.
6. Consideriamo differenze statisticamente significative a p < 0,05.

Risultati

Gli approcci sperimentali descritti in questo studio hanno generato dati riproducibili in vitro e in vivo che hanno permesso di valutare sia la composizione fitochimica sia le attività farmacologiche dell'estratto metanolico di T. mantaly. Tutte le misurazioni sperimentali sono state effettuate in repliche e i risultati sono presentati come media ± deviazione standard (SD). La significatività statistica tra i gruppi è stata determinata utilizzando ANOVA unidirezionale seguita dal test post hoc di Tukey, con p &l...

Discussione

In questo studio, è stata utilizzata una combinazione di caratterizzazione fitochimica e modelli farmacologici in vivo stabiliti per valutare il potenziale antinfiammatorio, analgesico e antipiretico dell'estratto metanolico di T. mantaly. I modelli sperimentali impiegati sono ampiamente utilizzati nella ricerca sui prodotti naturali e forniscono un quadro pratico per la valutazione preliminare dell'attività biologica.

I tempi di ritenzione riproducib...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ratti Wistar albini	Casa degli animali istituzionali	N/A	Animali sperimentali
Cloruro di alluminio	Sigma-Aldrich	237051	Saggio dei flavonoidi
Brewer' Lievito s	Sigma-Aldrich	YSC2	Induzione da pirexia
Carrageenan	Sigma-Aldrich	C1013	Induzione dell'edema della zampa
Centrifuga	Eppendorf	5810R	Elaborazione del campione
Diclofenaco sodio	Sigma-Aldrich	D6899	Standard antinfiammatorio
Termometro rettale digitale	Omron	MC-246	Misurazione della temperatura rettale
Pinza vernier digitale	Mitutoyo	500-196-30	Misurazione dello spessore della zampa
Acqua distillata	Interno	N/A	Solvente
Folin– Reagente ciocalteu	Sigma-Aldrich	F9252	Saggio fenolico
Acido gallico	Sigma-Aldrich	G7384	Norma fenolica
GC–MS sistema	Tecnologie Agilent	7890B– 5977A	Profilazione fitochimica
GraphPad Prism	GraphPad Software	Versione 8.0	Software di analisi statistica
Metanolo (grado HPLC)	Merck	106009	Solvente per estrazione
Ago a gavage orale	Instech	FTP-20-38	Somministrazione orale
Paracetamolo	Sigma-Aldrich	P0300000	Norma analgesica e antipiretica
Acetato di potassio	Merck	104820	Saggio dei flavonoidi
Evaporatore rotativo	Bü chi	R-200	Concentrazione dell'estratto
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143	Norma flavonoide
Carbonato di sodio	Merck	106392	Saggio fenolico
UV– Spettrofotometro visibile	Shimadzu	UV-1800	Misurazione dell'assorbanza
Bagno d'acqua (termostatico)	Memmert	WNB14	Test di immersione della coda