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Articolo di ricerca

Il decotto di Gegen Qinlian attenua la colite ulcerosa inibendo la PANoptosi: uno studio multi-omico e sperimentale

207 visualizzazioni

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DOI:

10.3791/69858

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22 maggio 2026

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1College of Clinical Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Gynaecology, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou University, 4College of Basic Medical Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5College of Health and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 6State Key Laboratory of Oral Diseases, National Center for Stomatology, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Traditional Chinese Medicine, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 7Department of Stomatology, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo che integra l'analisi multi-omica con la validazione in vivo per indagare come la Decoction di Gegen Qinlian allevia la colite ulcerosa regolando i bersagli correlati alla PANoptosi e le vie di segnalazione infiammatorie.

Abstract

Presentiamo un protocollo integrato di bioinformatica e farmacologia di rete per chiarire i meccanismi terapeutici del Decocto di Gegen Qinlian (GQD) nella colite ulcerosa (UC), con particolare attenzione alla regolazione correlata alla PANoptosi. Questo protocollo è progettato per identificare sistematicamente potenziali composti bioattivi, bersagli terapeutici, vie di segnalazione e meccanismi immunologici attraverso l'estrazione multi-database e l'analisi trascritomica. I profili di espressione genica delle coorti di UC, inclusi GSE87466 e GSE92415 dal database GEO, vengono analizzati utilizzando analisi di espressione differenziale e analisi pesata della rete di coespressione genica per identificare geni correlati alla malattia. I target candidati della GQD vengono raccolti da database farmacologici pubblici e intersecati con geni associati a UC- e PANoptosi per determinare i target terapeutici principali. Vengono quindi eseguite la costruzione di reti di interazione proteina-proteina, analisi di arricchimento e modellazione della rete composto-bersaglio-percorso per rivelare la base molecolare dell'attività GQD. Inoltre, l'analisi dell'infiltrazione immunitaria è stata incorporata per esplorare la relazione tra geni chiave e il microambiente immunitario intestinale. L'aggancio molecolare viene inoltre utilizzato per valutare il potenziale di legame tra i principali composti attivi e i bersagli dell'hub. Questo protocollo fornisce un quadro sistematico e riproducibile per indagare come la GQD allevia la colite ulcerale modulando la PANoptosi e le vie infiammatorie correlate, e può servire come utile riferimento per studi meccanicistici su altre formule della medicina tradizionale cinese in malattie infiammatorie complesse.

Introduzione

La colite ulcerosa (CU), una delle principali forme di malattia infiammatoria intestinale, è un disturbo infiammatorio cronico recidivante che coinvolge principalmente la mucosa del colono e che tipicamente inizia nel retto con un'estensione prossimale continua. La sua patogenesi è complessa e comporta un'attivazione immunitaria mucosale aberrante, disfunzione della barriera epiteliale, perturbazioni microbiche e interazioni sregolate tra ospite e ambiente, imponendo insieme un onere sanitario globalesostanziale e in crescita 1,2. L'infiammazione mucosa persistente non solo causa sintomi ricorrenti come dolore addominale, diarrea ed ematochezia, ma aumenta anche il rischio a lungo termine di cancro colorettale associato alla colite, in particolare nei pazienti con malattia estesa e di lungadata 3,4.

La gestione farmacologica attuale della UC si basa principalmente su 5-aminosalicilati, corticosteroidi, immunomodulatori, biologici e agenti a piccole molecole, a seconda della gravità della malattia e della rispostaterapeutica 5. Sebbene queste strategie abbiano migliorato gli esiti clinici, una parte considerevole dei pazienti sperimenta ancora non risposta primaria, perdita secondaria di risposta, intolleranza, dipendenza da steroidi o eventi avversi correlati al trattamento, evidenziando la necessità di opzioni terapeutiche più sicure e orientateai meccanismi 6. Pertanto, identificare programmi molecolari a monte che regolano contemporaneamente la lesione epiteliale e la disregolazione immunitaria intestinale è di notevole importanza traslazionale.

Studi recenti hanno dimostrato che la morte cellulare programmata disregolata è profondamente coinvolta nella patogenesi della CU. Oltre all'apoptosi classica, la piroptosi e la necroptosi sono state tutte implicate nella distruzione della barriera epiteliale e nell'amplificazione dell'infiammazionemucosa. La PANoptosi, una via di morte cellulare programmata infiammatoria recentemente definita che integra caratteristiche chiave di pirotosi, apoptosi e necroptosi, è emersa come un quadro meccanicistico particolarmente rilevante per le malattie infiammatoriecroniche 8. Questo processo è coordinato da complessi multiproteici di PANoptosomi e coinvolge mediatori centrali come ZBP1, RIPK1/RIPK3, CASP8 e molecole correlate all'inflammasom, inclusa NLRP3, in modo dipendente dalcontesto 9. È importante sottolineare che le evidenze accumulate indicano che la PANoptosi è attivata nella colite ulcerosa e può favorire danni epiteliali intestinali, rottura delle barriere e squilibri immunitari, contribuendo così alla progressione dellamalattia 10,11,12. Questi risultati suggeriscono che la PANoptosi non sia semplicemente una conseguenza a valle dell'infiammazione, ma possa rappresentare un nodo meccanicisticamente attivo che collega la lesione epiteliale all'amplificazione immunitaria mucosa.

La Decoction Gegen Qinlian (GQD), una prescrizione classica registrata per la prima volta in Shang Han Lun, consiste in Pueraria lobata, Scutellaria baicalensis, Coptis chinensis e Glycyrrhiza uralensis. È da tempo impiegato nella medicina tradizionale cinese per la diarrea e i disturbi infiammatori intestinali. Studi farmacologici moderni hanno dimostrato che la GQD può alleviare la colite sperimentale sopprimendo le risposte infiammatorie, ripristinando l'integrità della barriera intestinale, rimodellando il microbiota intestinale e modulando l'omeostasi immunitaria, inclusa la segnalazione e l'attività inflammatomica correlata a Th17/Treg 13,14. Queste azioni multitarget rendono GQD un candidato plausibile per intervenire nei processi patologici correlati alla PANoptosi in UC15. Tuttavia, nonostante le crescenti evidenze della sua efficacia anti-colitica, resta incerto se la GQD eserciti effetti terapeutici attraverso la regolazione coordinata delle reti molecolari associate alla PANoptosi.

Attualmente, rimangono due grandi lacune. Innanzitutto, gli studi esistenti sui meccanismi della morte cellulare della CU si sono concentrati principalmente su vie isolate come apoptosi, piroptosi o ferroptosi, mentre il ruolo integrato della PANoptosi nella mediazione degli effetti terapeutici delle formule erboristiche non è stato sufficientementechiarito 7,10,11. In secondo luogo, sebbene la farmacologia di rete sia ben adatta a caratterizzare la natura "multi-componente-multibersaglio-multi-via" delle formule tradizionali, le previsioni basate solo su database composti-bersagli possono mancare di specificità del contesto della malattia e richiedere priorità trascritomica e validazione sperimentale per migliorare la plausibilità biologica e l'affidabilitàtraslazionale 16,17,18,19 . Pertanto, una strategia integrata che combini trascrittomica della malattia, farmacologia di rete e verifica in vivo potrebbe fornire un quadro più rigoroso per chiarire il meccanismo della GQD nella UC.

Rispetto agli approcci basati esclusivamente sull'osservazione istopatologica, saggi molecolari a via singola o solo farmacologia di rete basata su database, il flusso di lavoro attuale è più adatto a questa domanda perché consente la validazione incrociata tra segnali trascrittomici nel contesto della malattia, la previsione formula-bersaglio e la verifica biologica in un modello sperimentale di colite. Le rilevazioni istologiche o molecolari da sole possono cogliere solo dimensioni limitate della patologia delle UC, mentre la farmacologia di rete da sola può mancare di sufficiente specificità della malattia e supporto sperimentale. Integrando la priorità trascristomica con la validazione in vivo, questo flusso di lavoro migliora la plausibilità biologica dell'identificazione dei bersagli e fornisce un quadro più coerente per collegare l'intervento GQD ai meccanismi associati alla PANoptosi nella UC.

Questo protocollo è particolarmente adatto per studi meccanicistici che mirano a valutare come interventi multicomponenti regolano lesioni epiteliali, risposte infiammatorie e vie correlate alla PANoptosi nella CUC sperimentale. È particolarmente utile quando l'obiettivo è collegare la previsione computazionale alla validazione biologica a livello animale in un flusso di lavoro standardizzato. Tuttavia, non è inteso a sostituire gli approcci diagnostici clinici, né affronta in modo completo tutte le dimensioni della patogenesi della CU, come l'eterogeneità a lungo termine del paziente, le interazioni causali a livello di microbioma o la mappatura immunitaria a singola cellula e a risoluzione spaziale. Pertanto, il suo ambito è meglio definito come un quadro preclinico riproducibile per la valutazione orientata ai meccanismi e terapeutica.

Abbiamo quindi ipotizzato che la GQD migliori la colicota ulcerale modulando le reti di segnalazione correlate alla PANoptosi, attenuando così la lesione epiteliale intestinale e riprogrammando il microambiente infiammatorio. Per testare questa ipotesi, abbiamo integrato l'analisi trascrivomica della UC con la farmacologia di rete per identificare bersagli terapeutici condivisi e vie chiave della GQD, con particolare attenzione ai regolatori associati alla PANoptosi. Abbiamo inoltre validato i meccanismi previsti in un modello di colite murina indotto da dextrano solfato di sodio (DSS). Combinando la priorità computazionale dei bersagli con la verifica biologica, questo studio mirava a fornire una spiegazione più rilevante per la malattia e meccanicisticamente fondata sugli effetti anti-UC della GQD, e a fornire nuove evidenze a sostegno della PANoptosi come potenziale asse terapeutico nell'UC.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte secondo le linee guida istituzionali e approvate prima dell'inizio dello studio dal Comitato Etico dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (Approvazione n. 2022-126). Per le analisi bioinformatiche sono stati utilizzati solo dataset GEO e GWAS disponibili pubblicamente; Pertanto, non è stato richiesto alcun consenso informato aggiuntivo o approvazione etica per la componente computazionale di questo studio. Tutte le procedure che coinvolgevano sostanze chimiche pericolose, campioni biologici e rifiuti animali venivano eseguite in conformità con le normative istituzionali sulla sicurezza dei laboratori e le procedure istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti pericolosi.

Acquisizione e preelaborazione dei dataset GEO

I dataset trascrivomici umani relativi alla colite ulcerosa (UC) sono stati recuperati dal database GEO utilizzando la parola chiave "colite ulcerosa". Dopo aver selezionato dataset di profilazione dell'espressione con gruppi di controllo UC e sani chiaramente definiti e una dimensione del campione sufficiente, sono stati selezionati GSE8746620 eGSE92415 21, entrambi generati sulla piattaforma GPL13158, come coorte di formazione. Questi dataset contenevano rispettivamente 87 campioni di UC e 21 controlli sani, e rispettivamente 53 campioni di UC e 21 controlli sani. Per la validazione esterna, GSE8747322 (106 campioni di UC e 21 controlli sani) e GSE1687923 (48 campioni di UC e 12 controlli sani; sono state incluse le piattaforme GPL570). I file grezzi o a matrice serie venivano scaricati e importati in R per la pre-elaborazione. Gli identificatori delle sonde venivano convertiti in simboli genici secondo i corrispondenti file di annotazione della piattaforma. Quando più sonde erano mappate allo stesso simbolo genico, il valore medio di espressione veniva mantenuto. I campioni privi di informazioni chiare sui gruppi sono stati esclusi prima dell'analisi a valle. I due dataset di addestramento sono stati uniti tramite simboli genici comuni. I valori di espressione venivano trasformati log2 quando necessario, normalizzati utilizzando una procedura standard di normalizzazione tra array e corretti per gli effetti batch tramite un metodo di aggiustamento batch dopo aver definito l'origine del dataset come variabile batch. L'analisi dei componenti principali e l'ispezione con boxplot venivano utilizzate prima e dopo la normalizzazione/correzione batch come checkpoint di controllo qualità. La pre-elaborazione di successo è stata definita da una migliore sovrapposizione delle distribuzioni campionarie tra i dataset e dall'attenuazione del clustering guidato dal dataset. Un totale di 902 geni correlati alla PANoptosi è stato raccolto dalla letteratura pubblicata e utilizzato come insieme genico di riferimento per l'analisi integrativa.

Identificazione dei geni espressi differenzialmente e costruzione della rete WGCNA

La matrice di addestramento unita è stata analizzata in R utilizzando un flusso di lavoro a espressione differenziale. Geni con |log2 volte cambiati| ≥ 0,585 e P < 0,05 aggiustati sono stati definiti come geni differenzialmente espressi (DEG). Sono stati generati grafici vulcanici e heatmap come output intermedi per confermare che i criteri di filtraggio hanno prodotto differenze di espressione biologicamente interpretabili tra i gruppi UC e di controllo. Per l'analisi ponderata della rete di coespressione genica (WGCNA), i geni sono stati classificati per varianza tra i campioni e il 25% più variabile dei geni è stato trattenuto come input. Un albero di clustering dei campioni è stato esaminato per identificare potenziali campioni di valore agonnici; Non sono stati mantenuti valori anomali evidenti per la costruzione della rete, a meno che la rimozione non fosse giustificata da criteri di controllo qualità. Una potenza di soglia morbida veniva selezionata in base all'indice di adattamento a topologia senza scala, e la potenza minima che raggiungeva una rete approssimativamente libera di scala veniva utilizzata per costruire la matrice di adiacenza. La matrice di adiacenza è stata poi trasformata in una matrice di sovrapposizione topologica, e il clustering gerarchico è stato eseguito utilizzando dissimilarità basata su TOM. I moduli sono stati identificati utilizzando il taglio dinamico degli alberi con una dimensione minima di 100 geni. Moduli strettamente correlati venivano fusi quando la loro correlazione autogenica superava il criterio di fusione preimpostato. Sono stati calcolati autogeni dei moduli, significatività dei moduli e valori di significatività genica per identificare i moduli più fortemente associati al fenotipo UC. Un passaggio WGCNA riuscito è stato definito dalla separazione stabile dei moduli, dimensioni biologicamente plausibili dei moduli e uno o più moduli che mostrano una chiara correlazione con lo stato della malattia.

Identificazione dei target candidati in GQD

Composti candidati e bersagli corrispondenti ai quattro componenti erboristici della Decocção Gegen Qinlian (GQD) - Pueraria lobata, Scutellaria baicalensis, Coptis chinensis e Glycyrrhiza uralenis - sono stati raccolti da TCMSP24 eBATMAN-TCM 25. Le soglie di screening sono state stabilite come segue: biodisponibilità orale ≥ 30% e somiglianza farmacologica ≥ 0,18 per i record derivati da un database; il punteggio di fiducia ≥ 0,84 e P < aggiustato a 0,05 per i record derivati da un altro database. Ulteriori composti sono stati integrati da un database di medicinali erboristici quando i registri rilevanti non sono stati raccolti nella ricerca iniziale. Le stringhe canoniche SMILES di composti trattenuti sono state inviate a una piattaforma di valutazione ADME online. I composti sono stati mantenuti quando hanno mostrato un elevato assorbimento gastrointestinale e hanno soddisfatto almeno due regole di somiglianza farmacologica tra Lipinski, Ghose, Veber, Egan e Muegge. I target presunti sono stati poi previsti utilizzando una piattaforma di predizione bersaglio-predittiva con probabilità > 0,1 e standardizzati ai simboli genici ufficiali tramite un database di annotazione proteica. I composti duplicati e i bersagli duplicati sono stati rimossi dopo la fusione del database. Il risultato atteso di questo passaggio era un dataset GQD composto-target non ridondante, adatto all'analisi di sovrapposizione.

Identificazione di geni sovrapposti e performance dell'analisi funzionale

I potenziali bersagli terapeutici sono stati definiti come l'intersezione tra bersagli correlati alla GQD, geni correlati alla UC identificati dall'espressione differenziale e WGCNA, e il set genico correlato alla PANoptosis. Le relazioni di sovrapposizione sono state visualizzate utilizzando un diagramma di Venn. I geni intersecanti sono stati poi sottoposti a un database di interazioni proteina-proteina (PPI) e sono state mantenute coppie di interazione con punteggio di confidenza ≥ 0,4. La rete PPI risultante veniva esportata e visualizzata su una piattaforma di analisi di rete. Un passaggio PPI riuscito era definito dalla presenza di una rete connessa contenente la maggior parte dei geni intersecanti, piuttosto che solo nodi isolati. L'analisi di arricchimento funzionale, inclusa l'analisi Gene Ontology (GO) e la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), è stata eseguita in R con q < 0,05 come soglia di significatività. Sono stati esclusi termini o percorsi che non rispettavano questa soglia. I processi biologici arricchiti e le vie di segnalazione sono stati riassunti per dedurre il potenziale meccanismo attraverso cui la GQD potrebbe regolare la UC. Sono stati generati grafici a barre e diagrammi a bolle come output intermedi per verificare se i risultati dell'arricchimento fossero dominati da vie legate all'infiammazione, immunità o lesioni epiteliali, come ci si aspettava dal contesto biologico.

Analisi dei modelli di espressione, localizzazione cromosomica e correlazioni

I livelli di espressione dei geni condivisi sono stati confrontati tra gruppi di UC e di controllo utilizzando un flusso di lavoro standard di visualizzazione di espressione differenziale in R. Sono stati generati boxplot e heatmap, e P < 0,05 è stata considerata statisticamente significativa. Solo geni con direzione di espressione interpretabile e comportamento coerente all'interno della coorte di addestramento sono stati mantenuti per una successiva valutazione meccanicistica. La localizzazione cromosomica dei geni core selezionati è stata mappata dopo aver formattato i file di annotazione genica nella struttura di input richiesta, e le posizioni genomiche sono state visualizzate tramite un flusso di lavoro di graficazione a cromosomi circolari. Le matrici di correlazione tra i geni core sono state poi calcolate utilizzando l'analisi di correlazione a coppie. Il risultato atteso di questo passaggio è stato l'identificazione di coppie di geni che mostrano schemi di espressione coordinati in grado di supportare una regolazione condivisa o un'interazione funzionale.

Costruzione e valutazione di modelli di apprendimento automatico

Lo sviluppo del modello diagnostico è stato effettuato utilizzando la coorte di addestramento unita (GSE87466 + GSE92415), mentre GSE16879 e GSE87473 sono stati utilizzati come dataset di validazione esterni indipendenti. Dodici algoritmi di apprendimento automatico - Lasso, Ridge, Stepglm, XGBoost, Random Forest, Enet, plsRglm, GBM, NaiveBayes, LDA, glmBoost e SVM - sono stati utilizzati per generare 113 combinazioni dimodelli 26. Una validazione incrociata dieci volte è stata applicata all'interno della coorte di formazione. In ogni fold, l'addestramento del modello, la selezione delle caratteristiche e la stima delle prestazioni venivano condotti utilizzando la stessa logica di partizionamento di addestramento/test per evitare la fuga di informazioni. Le prestazioni del modello sono state valutate principalmente dall'area sotto la curva caratteristica operativa del ricevitore (AUC). Il modello ottimale è stato definito come quello con la media AUC più alta tra i dataset di addestramento e validazione, piuttosto che come l'AUC di addestramento più alto da solo. I modelli che mostravano un AUC di addestramento molto elevato ma scarse prestazioni di validazione esterna non sono stati mantenuti. Sono state generate curve ROC per ogni modello conservato e un nomogramma è stato costruito a partire dai biomarcatori selezionati finali. Un passaggio di modellazione di successo è stato definito da prestazioni stabili di validazione incrociata e dalla conservazione della capacità discriminativa nei dataset esterni.

Prestazioni della GSVA e dell'espressione genica centrale del profilo

L'Analisi della Variazione del Set Genico (GSVA) è stata eseguita per confrontare l'arricchimento delle vie tra gruppi ad alta espressione e bassa espressione definiti dal valore mediano di espressione di ciascun gene centrale. P < 0,05 è stato utilizzato come soglia per differenze significative di percorso. I percorsi che non rispettavano questa soglia sono stati esclusi dall'interpretazione. Sono state generate mappe di calore e grafici di correlazione per illustrare l'attività dei percorsi e i modelli di co-espressione. Il successo intermedio di questa fase è stato indicato da profili di arricchimento coerenti con una disregolazione infiammatoria, immunitaria o metabolica rilevante per la CU.

Analisi del paesaggio immunitario e costruzione della rete ceRNA

La composizione delle cellule immunitarie è stata stimata utilizzando un algoritmo di deconvoluzione con 1.000 permutazioni. I campioni che non rispettavano il criterio di significatività della deconvoluzione interna sono stati esclusi dall'analisi successiva di correlazione immunitaria. Per completare questa analisi, è stata utilizzata anche l'analisi di arricchimento del set genico a campione singolo (ssGSEA) per valutare i modelli di infiltrazione immunitaria. Sono state quindi calcolate e visualizzate le correlazioni tra le frazioni delle cellule immunitarie ed espressione genica centrale. Per la costruzione della rete ceRNA, i miRNA che mirano agli mRNA core sono stati identificati da database di interazione pubblici e successivamente sono stati screenjati lncRNA candidati che interagiscono con questi miRNA. Sono state mantenute solo le interazioni supportate da record di previsione o annotazione del database. La rete regolatoria mRNA-miRNA-lncRNA è stata visualizzata su una piattaforma di analisi di rete. L'output atteso di questo passaggio era una rete ceRNA strutturata con regolatori a monte biologicamente plausibili collegati ai geni centrali.

Prestazioni dell'analisi a cella singola

Il dataset a cella singola GSE214695 veniva importato in R e convertito in oggetti a cella singola utilizzando un flusso di lavoro standard di analisi a cella singola. Il controllo di qualità veniva effettuato filtrando le cellule secondo metriche standard, incluse celle a basse caratteristiche, potenziali gocce vuote e celle con scarsa qualità del trascritto. Le cellule che hanno superato il controllo qualità sono state normalizzate e i 2.000 geni più variabili sono stati selezionati per l'analisi dei componenti principali. I componenti principali che contribuiscono a varianza biologica significativa sono stati mantenuti per il clustering non supervisionato, e UMAP è stato utilizzato per la visualizzazione bidimensionale. I geni marcatori di cluster sono stati identificati tramite analisi di espressione differenziale tra i cluster. L'annotazione di tipo di cella veniva poi eseguita tramite classificazione basata su riferimenti e le annotazioni venivano incrociate con l'espressione canonica dei marcatori quando possibile. Un passaggio di successo a singola cellula è stato definito dalla chiara separazione delle principali popolazioni cellulari sul grafico UMAP, dai geni marcatori interpretabili per ogni cluster27 e dall'annotazione coerente dei principali tipi di cellule immunitarie e stromali rilevanti per la CU.

Prestazioni dell'analisi di randomizzazione mendeliana

È stata effettuata una randomizzazione mendeliana (MR) su due campioni per valutare possibili relazioni causali tra espressione genica centrale e suscettibilità alla CU. Variabili strumentali sono state estratte dai dataset di locus di tratti quantitativi di espressione, e sono state utilizzate statistiche sintetiche di studio di associazione genomica a livello genomico UC come dataset di esito. Gli SNP sono stati selezionati secondo criteri standard di controllo qualità della RM, inclusa la rilevanza per il tratto di esposizione e la rimozione di varianti ambigue o duplicate quando richiesto dall'armonizzazione. Il metodo ponderato per l'inversa della varianza è stato utilizzato come stimatore causale primario. Il test Q di Cochran è stato applicato per valutare l'eterogeneità. Le analisi MR-Egger e MR-PRESSO sono state utilizzate come analisi di sensibilità per valutare e, quando necessario, correggere la pleiotropia orizzontale. Un passaggio di risonanza magnetica riuscito è stato definito da un'armonizzazione valida dello strumento, assenza di eterogeneità o pleiotropiamaggiore e stime direzionalmente coerenti tra metodi RM complementari.

Prestazioni dell'aggancio molecolare di composti candidati

Le strutture tridimensionali delle proteine target sono state ottenute dalla Protein Data Bank, mentre le strutture dei liganti sono state ottenute da un database pubblico di piccole molecole. Prima dell'aggancio, proteine e liganti venivano preprocessati rimuovendo molecole d'acqua quando opportuno, aggiungendo idrogeni, definendo i tipi di atomi e convertendo i formati di file necessari per l'aggancio. L'aggancio è stato quindi eseguito utilizzando un flusso di lavoro di aggancio molecolare, e sono state calcolate le energie di legame per ogni coppia ligando-bersaglio. Affinità di legame inferiori a -5 kcal/mol sono state interpretate come legame favorevole, mentre valori inferiori a -7 kcal/mol sono stati interpretati come un legame relativamente forte. Le heatmap di attracco sono state tracciate per confrontare i pattern di legatura globale tra i bersagli. Le conformazioni di primo grado sono state visualizzate in tre dimensioni per ispezionare i legami a idrogeno, le interazioni idrofobiche e la vicinanza ai residui. Il completamento con successo di questo passaggio è stato definito da file di output di docking stabili, pose plausibili di ligando all'interno della regione di legame target e energie di legame coerenti con la priorità dei candidati.

Prestazioni della validazione sperimentale in vivo

Preparazione GQD

Il GQD è stato preparato con quattro erbe medicinali tradizionali cinesi nelle seguenti proporzioni grezze di farmaci: 24 g di Puerariae Lobatae Radix (Gegen), 9 g di Scutellariae Radix (Huangqin), 9 g di Coptidis Rhizoma (Huanglian) e 6 g di Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (Gancao). I dettagli dei materiali botanici e delle loro fonti sono forniti nella Tabella dei Materiali. Le erbe venivano macinate fino a diventare polvere fine, mescolate accuratamente e immerse in 390 mL di acqua distillata per 1 ora. La miscela è stata decoctata due volte. Per la prima decottura, le erbe sono state bollite a fuoco alto e poi fatte sobbollire a fuoco basso per 30 minuti. Dopo la filtrazione tramite garza, i residui venivano ribolli con un volume d'acqua dieci volte maggiore. I due filtrati sono stati combinati e concentrati in un bagno d'acqua fino a raggiungere una concentrazione finale di droga grezza di 5 g/mL. L'estratto veniva poi filtrato, raffreddato e conservato a 4 °C fino all'utilizzo.

Istituzione del modello murino UC indotto dal DSS

Diciotto maschi di topi BALB/c (8 settimane) sono stati utilizzati in questo studio, e tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato Etico dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (Approvazione n. 2022-126). I dettagli sulla fonte animale sono forniti nella Tabella dei Materiali. I topi sono stati ospitati in condizioni specifiche prive di patogeni a 20–22 °C e umidità del 55% in un ciclo di 12 ore chiaro/buio. Dopo un periodo di acclimatazione di 1 settimana, gli animali sono stati divisi casualmente in tre gruppi (n = 6 per gruppo): NC, UC e GQD. Il gruppo NC ha ricevuto acqua potabile sterile durante tutto l'esperimento, mentre i gruppi UC e GQD sono stati somministrati 1,5% (w/v) di dextrano solfato di sodio (MW 36-50 kDa) in acqua potabile per 5 giorni consecutivi, seguiti da 2 giorni di acqua normale. Questo ciclo è stato ripetuto tre volte per stabilire la colite cronica. Durante il periodo di intervento, i gruppi NC e CU sono stati trattati due volte al giorno con 200 μL di sodio carboximetilcellulosa allo 0,5%, mentre il gruppo GQD ha ricevuto GQD tramite gavage orale due volte al giorno.

La prescrizione clinica di GQD consisteva in 24 g di Gegen, 9 g di Huangqin, 9 g di Huanglian e 6 g di Gancao, corrispondenti a una quantità totale di farmaco greggio di 48 g al giorno per gli adulti. Assumendo un peso corporeo standard adulto di 60 kg, la dose equivalente per adulti era di 0,8 g/kg/giorno. Basandosi sul coefficiente di conversione convenzionale da uomo a topo di 1:12, la corrispondente dose equivalente al topo era di 9,6 g/kg/giorno. Secondo il rapporto preimpostato tra bassi, medi e alti dosi di 1:2:4, le dosi calcolate erano rispettivamente 9,6, 19,2 e 38,4 g/kg/giorno. Considerando la gravità e la persistenza dell'infiammazione del colon nel modello ripetuto di colite indotta dal DSS, è stato scelto il regime ad alta dose per garantire un adeguato intervento farmacologico durante la convalida in vivo. Per supportare un'esposizione farmacologica sufficiente durante la fase infiammatoria attiva, la dose giornaliera totale di 38,4 g/kg/giorno è stata suddivisa in due somministrazioni uguali. Durante tutto l'esperimento, il peso corporeo, la consistenza delle feci e il sanguinamento rettale sono stati monitorati quotidianamente. Al termine del protocollo, i topi sono stati eutanasiati e sono stati prelevati tessuti del colon per analisi successive.

Valutazione del peso corporeo e dell'indice di attività malattiosa

Il peso corporeo veniva registrato quotidianamente ed espresso come percentuale del peso corporeo iniziale al Giorno 0. La gravità della malattia è stata valutata utilizzando l'indice di attività della malattia (DAI), che includeva tre parametri: perdita di peso corporeo, consistenza delle feci e sanguinamento rettale. Ogni parametro è stato valutato indipendentemente su una scala da 0 a 4 in base alla gravità delle manifestazioni cliniche, con punteggi più alti che indicano un'attività malata più grave. Il DAI finale è stato calcolato come la media dei tre punteggi individuali, ottenendo un punteggio totale che variava da 0 a 4. In breve, un punteggio di 0 non ha indicato anomalie, mentre punteggi da 1 a 4 hanno riflettuto una perdita di peso progressivamente maggiore, una consistenza fecale più flaccida e sanguinamenti rettali più gravi. I criteri dettagliati di valutazione sono presentati nella Tabella 1.

Prestazioni della colorazione H&E e calcolare l'indice di attività istologica

Per la valutazione istologica, i tessuti del colon sono stati fissati con paraformaldeide al 4%, disidratati tramite etanolo graduato, incorporati nella paraffina e sezionati a uno spessore di 4 μm. Le sezioni sono state deparaffinizzate, reidratate, colorate con ematossilina, controcolorate con eosina, disidratate, pulite e montate. Le immagini istologiche venivano osservate con un microscopio a campo chiaro e scansionate con un sistema di scansione di vetrine. Le informazioni specifiche sull'equipaggiamento sono elencate nella Tabella dei Materiali. La lesione istopatologica è stata valutata in base a tre parametri, tra cui la deplezione delle cellule del calice, il danno architettonico della cripta e l'infiltrazione delle cellule infiammatorie. Ogni parametro è stato valutato in base al grado di lesione tissutale e la somma dei tre punteggi dei parametri è stata definita come indice di attività istologica (HAI), che va da 0 a 10, come riassunto nella Tabella 2. Per la quantificazione delle celle goblet, sono stati analizzati cinque campi non sovrapposti selezionati casualmente per sezione con un ingrandimento del 400×. Il numero di cellule calice per campo veniva contato manualmente in modo cieco, e il conteggio medio per campo veniva calcolato per ogni sezione colonica rappresentativa.

Prestazioni della colorazione immunoistochimica

Dopo la deparaffinizzazione e la reidratazione, le sezioni tissutali sono state sottoposte al prelievo antigenico con tripsina allo 0,1% a 37 °C per 30 minuti, seguita da incubazione con perossido di idrogeno al 3% per bloccare l'attività endogena della perossidasi. Le sezioni sono state poi incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari del coniglio contro STAT3 (1:200, HUABIO, ET1605-45), TIMP1 (1:1000, Proteintech, 26847-1-AP), SPHK2 (1:500, Proteintech, 17096-1-AP) e HSPA5 (1:1000, Cell Signaling Technology, #3177), diluiti in 1% di BSA. I dettagli sugli anticorpi e sulle loro fonti sono forniti nella Tabella dei Materiali. Dopo il lavaggio con PBS, le sezioni sono state incubate con il corrispondente anticorpo secondario (1:2000) a temperatura ambiente per 1,5 ore. L'immunoreattività è stata visualizzata utilizzando un reagente di rilevamento cromogenico, e i nuclei sono stati controcolorati con ematossilina. L'analisi quantitativa delle immagini è stata effettuata utilizzando software di analisi delle immagini elencato nella Tabella dei Materiali.

Prestazioni dell'analisi qRT-PCR

L'RNA totale è stato estratto utilizzando un reagente di estrazione di RNA a base di fenolo e trascritto inversamente utilizzando un kit di sintesi di cDNA a primo filamento. La trascrizione inversa è stata eseguita a 25 °C per 10 minuti, 55 °C per 15 minuti e 85 °C per 5 minuti. Successivamente è stata eseguita la qRT-PCR utilizzando un sistema PCR in tempo reale e un mix SYBR Green qPCR. Le condizioni di amplificazione erano le seguenti: denaturazione iniziale a 95 °C per 60 secondi, seguita da 40 cicli a 95 °C per 15 secondi, 60 °C per 15 secondi e 72 °C per 45 secondi. Le sequenze di innesco sono state progettate utilizzando software di progettazione di primer e sono elencate nella Tabella 3. Il GAPDH è stato utilizzato come riferimento interno e i livelli relativi di espressione dell'mRNA sono stati calcolati utilizzando il metodo 2^-ΔΔCt . Ogni campione è stato analizzato in triplice e ogni esperimento è stato ripetuto almeno tre volte. I dettagli dei reagenti, degli strumenti e del software sono forniti nella Tabella dei Materiali.

Prestazioni dell'analisi del western blot

I tessuti del colon sono stati omogeneizzati in un tampone di lisi contenente inibitore proteasi su ghiaccio e lisati accuratamente per 2 ore. Le concentrazioni proteiche sono state determinate utilizzando un kit di analisi proteica. Quantità uguali di proteine venivano miscelate con il tampone di carico, denaturate prima dell'elettroforesi, separate dal 10% di SDS-PAGE e trasferite sulle membrane PVDF a 100 V per 1 ora. Dopo il blocco con latte scremato al 5% per 1 ora a temperatura ambiente, le membrane sono state incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari del coniglio contro STAT3 (1:200, HUABIO, ET1605-45), TIMP1 (1:1000, Proteintech, 26847-1-AP), SPHK2 (1:500, Proteintech, 17096-1-AP), HSPA5 (1:1000, Cell Signaling Technology, #3177) e GAPDH alla corrispondente diluizione operativa. Dopo il lavaggio con TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20; pH 7,4), le membrane sono state incubate con il corrispondente anticorpo secondario (1:5000) a temperatura ambiente per 1 ora. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un reagente di rilevamento chemiluminescente. Le intensità delle bande sono state analizzate tramite software di analisi delle immagini e i livelli di espressione delle proteine target sono stati normalizzati in GAPDH. I pesi molecolari attesi delle proteine rilevate erano di circa 88 kDa per STAT3, 21 kDa per TIMP1, 28 kDa per SPHK2, 70 kDa per HSPA5 e 36 kDa per GAPDH. I dettagli degli anticorpi, membrane, reagenti e software sono forniti nella Tabella dei Materiali. Nomi specifici dei prodotti, produttori, numeri di catalogo, modelli di strumenti e dettagli software sono forniti nella Tabella dei Materiali, mentre descrizioni generiche sono usate nel testo principale per migliorare la neutralità e l'applicabilità generale.

Prestazioni dell'analisi statistica

I dati sono presentati come media ± deviazione standard. I test statistici venivano eseguiti utilizzando software statistico. Per confronti multi-gruppo è stato utilizzato un ANOVA unidirezionale seguito dal test post hoc di Tukey. Un valore P ≤ 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Risultati

Acquisizione di dataset GEO e identificazione genica correlata all'UC

Per indagare i cambiamenti nell'espressione genica nella UC, sono stati ottenuti due dataset trascrittomici - GSE87466 e GSE92415 - utilizzando "colite ulcerosa" come termine di ricerca, con criteri di selezione che includono il tipo di dataset, l'annotazione chiara malattia/controllo e una dimensione del campione sufficiente. Questi dataset comprendevano 140 casi di CU e 42...

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Discussione

La colite ulcerosa (UC) è una condizione infiammatoria intestinale cronica e idiopatica che colpisce principalmente la mucosa del colono, caratterizzata da infiammazione persistente o episodica. La malattia riduce significativamente la qualità della vita del paziente e aumenta il rischio di sviluppare carcinoma colorettale. Sebbene la sua prevalenza globale stia aumentando costantemente, l'eziologia precisa e i meccanismi sottostanti rimangono solo parzialmente compresi. Le opzioni di tr...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano inoltre il database GEO per l'accesso aperto ai dati e i revisori per i loro commenti costruttivi.

FINANZIAMENTO: Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81973684, 82174358), dalla Natural Science Foundation della provincia del Sichuan (2023NSFSC1760, 2025ZNSFSC1834), dal Progetto Speciale sulla Ricerca sulla Medicina Tradizionale Cinese dell'Amministrazione Provinciale di Medicina Tradizionale Cinese del Sichuan (2023MS365, 2020JC0094) e dal Joint Innovation Fund della Health Commission di Chengdu e dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (WXLH202402019, WXLH202403012, WXLH202501238, WXLH202501201).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Puerariae Lobatae RadixSichuan Neautus Medicina Tradizionale Cinese Co., Ltd.NTC-001Materiale erboristico per la preparazione del GQD
Scutellariae RadixSichuan Neautus Medicina Tradizionale Cinese Co., Ltd.NTC-002Materiale erboristico per la preparazione del GQD
Rizoma di coptidisSichuan Neautus Medicina Tradizionale Cinese Co., Ltd.NTC-003Materiale erboristico per la preparazione del GQD
Glycyrrhizae Radix et RhizomaSichuan Neautus Medicina Tradizionale Cinese Co., Ltd.NTC-004Materiale erboristico per la preparazione del GQD
Topi BALB/c, maschio, 8 settimaneBeijing HFK Bioscience Co., Ltd.N/AAnimali sperimentali
Dextrano solfato di sodio (DSS), MW 36-50 kDaMP Biomedici160110Reagente che induce la colite
Carbossidilcellulosa di sodioSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAC5678Veicolo per il gavage orale
ParaformaldeideSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA158127Fissativo tissutale
EmatossilinaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAH9627Colorazione nucleare
EosinaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAE4009Controcolorazione per istologia
Microscopio a campo chiaroNikonEclipse 80iOsservazione istologica
Sistema di scansione delle diapositive3DHISTECH Ltd.Panoramic 250Acquisizione digitale di immagini intere a diapositive
TripsinaGibco, Carlsbad, CA, USA25200-056Reagente per il recupero dell'antigene
Perossido di idrogenoSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAH1009Blocco dell'attività endogena della perossidasi
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAA7906Diluente anticorpale / reagente bloccante
Anticorpo primario Anti-STAT3, coniglioTecnologia di segnalazione cellulare9139Anticorpo primario per IHC/WB
Anticorpo primario anti-TIMP1, coniglioAbcamab211925Anticorpo primario per IHC/WB
Anticorpo primario anti-SPHK2, coniglioAbcamab187030Anticorpo primario per IHC/WB
Anticorpo primario anti-HSPA5, coniglioTecnologia di segnalazione cellulare3177Anticorpo primario per IHC/WB
Anticorpo primario anti-GAPDH, coniglioAbcamab9485Controllo del caricamento per WB
Anticorpo secondario anti-coniglio di capraYeasen Biotechnology33201Anticorpo secondario per IHC/WB
Reagente di rilevamento cromogenicoBeyotime Biotechnology [Shanghai] Co., Ltd., Shanghai, CinaP0202Sviluppo del segnale per l'immunoistochimica
Software di analisi delle immaginiCibernetica dei MediaImage-Pro Plus 7.0Quantificazione della colorazione e dell'intensità della banda
Reagente di estrazione di RNA a base di fenoloInvitrogenReagente Trizol 15596026Estrazione totale di RNA
Kit di sintesi del cDNA a primo filamentoBeyotime BiotechnologyDRR047ATrascrizione inversa
Sistema PCR in tempo realeBiosistemi applicatiABI Prism 7300Amplificazione quantitativa per PCR
SYBR Mix verde qPCRBeyotime BiotechnologyDRR420AReagente di rilevamento qPCR
Software per la progettazione dei primerPremier Biosoft International, Palo Alto, CA, USAPrimer 5.0Progettazione del primer
Buffer di lisi RIPABeyotime BiotechnologyP0013BReagente per l'estrazione proteica
Inibitore della proteasi (PMSF)Beyotime BiotechnologyST506Protezione proteica durante la lisi
Kit per il test proteico BCABeyotime BiotechnologyP0010Quantificazione delle proteine
Membrana PVDFMerck MilliporeIPVH00010Membrana di trasferimento proteico
Reagente / sistema di rilevamento chemiluminescenteThermo Fisher Scientific32106Rilevamento del segnale per western blot
Software statisticoIBMSPSS 23.0Analisi statistica

Riferimenti

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