Saggi di clonalità basati sul sequenziamento di nuova generazione: validazione clinica per il monitoraggio della malattia residua minima nel mieloma multiplo

Sommario

Questo studio ha valutato un nuovo saggio per la clonalità di BCR/TCR basato sul sequenziamento di nuova generazione (NGS) (OriMIRACLE LTM) per il rilevamento della malattia residua minima (MRD) nelle neoplasie linfoidi, inclusi il mieloma multiplo (MM). Utilizzando linee cellulari e strisci clinici, lo studio ha dimostrato una >Tasso di rilevamento del 90% e concordanza dell'81,36% con la citometria a flusso. Il test offre un'elevata sensibilità, predice la ricaduta e supporta le decisioni terapeutiche.

Abstract

Il rilevamento della malattia residua minima (MRD) è fondamentale per la gestione delle neoplasie linfoidi. Questo studio presenta OriMIRACLE LTM, un nuovo saggio basato sul sequenziamento di nuova generazione (NGS) per l'analisi della clonalità del recettore delle cellule B (BCR) e del recettor delle cellule T (TCR) finalizzato al rilevamento della MRD. Abbiamo convalidato il saggio utilizzando linee cellulari e campioni clinici, inclusi strisci residui, provenienti da pazienti affetti da mieloma multiplo (MM). Il saggio di clonalità BCR/TCR ha dimostrato un tasso di rilevamento positivo superiore al 90% nelle neoplasie linfoidi. Gli studi di convalida nei pazienti con MM hanno mostrato una concordanza dell'81,36% (48/59) tra citometria a flusso multicolore (MFC) e valutazione della risposta clinica nel rilevamento delle cellule tumorali. In particolare, il 61,11% (11/18) dei pazienti con MM risultati positivi alla MRD sia mediante NGS che mediante MFC ha presentato progressione della malattia o recidiva. I pazienti con MRD rilevata esclusivamente mediante NGS hanno mostrato tassi più bassi di risposta clinica completa, e alcuni pazienti con MM inizialmente responsivi hanno avuto una recidiva dopo l'interruzione del trattamento. Questi risultati indicano che questo saggio basato su NGS offre un rilevamento altamente sensibile e specifico della MRD nelle neoplasie linfoidi, anche nei campioni di striscio residuo derivati da pazienti con MM. Il metodo presenta vantaggi rispetto alla MFC e si rivela utile per il monitoraggio della MRD. In conclusione, le evidenze attuali supportano l'uso dell'NGS come strumento complementare alla MFC, in particolare nei pazienti MFC⁻/NGS⁺, poiché l'NGS consente una stratificazione del rischio più approfondita. Tuttavia, la soglia ottimale per l'intervento dovrà essere definita da studi prospettici.

Introduzione

Il mieloma multiplo (MM) è una neoplasia ematologica caratterizzata dalla proliferazione di cellule plasmatiche clonali anomale nel midollo osseo¹. In Cina, nel 2022 si sono verificati circa 22.450 nuovi casi di MM e 17.360 decessi correlati². Nonostante i notevoli progressi nella terapia del MM negli ultimi dieci anni, che hanno notevolmente prolungato la sopravvivenza mediana dei pazienti, la maggior parte dei pazienti alla fine sperimenta una ricaduta^3,4. Questo marcato aumento sottolinea la necessità fondamentale di un monitoraggio preciso della remissione, della predizione precoce delle ricadute e di interventi terapeutici tempestivi.

L'evidenza clinica ha fermamente stabilito il significato prognostico dello stato di malattia residua minima (MRD) nelle neoplasie ematologiche^5,6,7. Riconoscendone l'importanza, il gruppo di lavoro internazionale sul mieloma (IMWG) ha incluso la valutazione della MRD nei propri criteri di valutazione della risposta nel 2016⁸. I metodi attuali per la valutazione della MRD nel midollo osseo comprendono la reazione a catena della polimerasi con oligonucleotidi specifici per alleli (ASO-PCR), la PCR digitale (dPCR), la citometria a flusso multiparametrica (MFC) e i saggi di sequenziamento di nuova generazione (NGS)⁸. Sebbene l'ASO-PCR offra un rilevamento sensibile, è un metodo lungo e difficile da standardizzare a causa della necessità di primer specifici per ciascun paziente^9,10. Analogamente, la dPCR è limitata dal suo design specifico per alleli^10,11. La MFC ha svolto un ruolo fondamentale nel rilevamento della MRD¹², fornendo informazioni rapide a livello cellulare, ma incontra difficoltà in termini di standardizzazione e riproducibilità.

Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) rappresenta un approccio riproducibile e altamente sensibile che elimina la necessità di primer specifici per il paziente. Consente l'identificazione e la quantificazione affidabili di riarrangiamenti unici degli immunoglobulini nelle neoplasie ematologiche¹³. La Food and Drug Administration (FDA) ha approvato ClonoSEQ di Adaptive Biotechnologies per il test di malattia residua minima (MRD) in pazienti affetti da leucemia linfoblastica acuta (ALL), mieloma multiplo (MM) e leucemia linfocitica cronica (CLL)^14,15,16. Numerose linee guida cliniche internazionali includono ormai il NGS come metodo raccomandato per il monitoraggio della MRD. Le Linee guida cinesi per la diagnosi e il trattamento del mieloma multiplo (aggiornate al 2020) raccomandano inoltre la valutazione della MRD nei pazienti con mieloma multiplo mediante metodi quali la citometria a flusso di nuova generazione (NGF) e il NGS¹⁷.

Per quanto ne sappiamo, la tecnologia NGS non è il metodo preferito per il rilevamento dell'MRD nelle malattie linfoidi nella pratica clinica a causa dei costi e dei tempi richiesti. Quando i risultati della MFC sono negativi, spesso è necessaria un'ulteriore aspirazione del midollo osseo per rilevare l'MRD. Questa procedura aggiuntiva può comportare notevoli oneri fisici e psicologici per i pazienti, limitandone potenzialmente l'applicazione clinica diffusa.

In questo studio, abbiamo sviluppato, caratterizzato e validato le prestazioni di un saggio di clonalità dei recettori delle cellule B o T (BCR/TCR) basato sul sequenziamento di nuova generazione (NGS) (OriMIRACLE LTM). Gli obiettivi principali di questo studio sono stati la validazione della sensibilità e della specificità di questo saggio per il monitoraggio della malattia residua minima (MRD) nelle neoplasie linfoidi, anche quando si utilizzano campioni da striscio residuo. Questo metodo può utilizzare direttamente gli strisci di midollo osseo residui rimasti dopo la diagnosi di routine, superando così le limitazioni intrinseche dei campioni su striscio. Anche quando il DNA negli strisci è frammentato a causa della fissazione, della colorazione e dello stoccaggio a lungo termine, presente in quantità estremamente ridotte o parzialmente degradato, è possibile ottenere profili affidabili del repertorio immunitario grazie a un'estrazione ottimizzata degli acidi nucleici e all'amplificazione PCR multiplex. Il metodo consente un monitoraggio clonale ad alta sensibilità, con una sensibilità compresa tra 10⁻⁵ e 10⁻⁶, superando il limite inferiore di rilevamento della citometria a flusso convenzionale per la MRD. Questo lavoro evidenzia il potenziale della valutazione della clonalità BCR/TCR basata su NGS nel migliorare il monitoraggio della MRD e nel guidare le decisioni terapeutiche nei pazienti con mieloma multiplo (MM), affrontando potenzialmente le attuali limitazioni nella pratica clinica.

Protocollo

Lo studio è stato condotto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki ed approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Affiliato N. 1 dell'Università Medica di Gannan (numero di approvazione etica: 22SC-2023011201). A tutti i partecipanti è stato richiesto un consenso informato scritto prima della loro inclusione nello studio.

Selezione del campione
Campioni clinici sono stati ottenuti da 40 pazienti diagnosticati con varie neoplasie ematologiche, inclusi ALL, MM, CLL e linfoma. Inoltre, sono stati raccolti campioni appaiati di fase cronica e fase blastica da pazienti con leucemia mieloide cronica. I campioni sono stati ottenuti dal Primo Ospedale Affiliato dell'Università Medica di Gannan, Jiangxi, Cina, tra dicembre 2016 e agosto 2022. Questi campioni derivavano da aspirati midollari (BMA) o da sangue periferico. Sono state inoltre utilizzate quattro linee cellulari di neoplasie linfoidi: le linee B-ALL REH e NALM6, la linea T-ALL Jurkat e la linea di linfoma H9, tutte ottenute dalla American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA).

Per lo studio di validazione analitica, è stato incluso un sottoinsieme di strisci clinici appaiati di midollo osseo residuo raccolti prima e dopo il trattamento da 30 pazienti con mieloma multiplo (MM) newly diagnosed o in recidiva. I saggi di citometria a flusso (MFC) sono stati eseguiti su campioni di aspirato midollare (BMA) nei corrispondenti momenti temporali utilizzando una citometria a flusso a 4 colori.

I campioni sono stati colorati con sei diverse combinazioni di anticorpi a 4 colori (diluizioni secondo le istruzioni del produttore): CD38/CD56/CD45/CD19, CD38/CD138/CD45/CD34, CD38/CD117/CD45/CD33, CD38/CD22/CD45/CD20, CD38/CD9/CD45/HLA-DR e K/L/CD45/CD38. La colorazione è stata eseguita per 30 min a 4 °C al buio, seguita da due lavaggi con PBS (centrifugazione a 500 × g per 5 min a 4 °C). Nei laboratori di immunematologia, la positività alla MFC-MRD nel midollo osseo è attualmente definita utilizzando una soglia di 10^-4 (1 cellula su 10.000). La qualità dell'acquisizione mediante citometria a flusso è stata verificata visualizzando lo scatter anteriore/laterale e confermando almeno 10.000 eventi CD45⁺ per tubo.

Rilevamento della clonalità e monitoraggio della MRD mediante saggio di clonalità basato su NGS
Il DNA genomico (gDNA) è stato estratto da 200 µL di aspirato midollare (BMA), sangue periferico o intero striscio residuo (riedicolato in 200 µL di PBS) utilizzando il kit corrispondente seguendo le istruzioni del produttore. Era richiesta una concentrazione minima di gDNA di 20 ng/µL e un rendimento totale ≥ 1 µg. È stato verificato un rapporto A260/A280 compreso tra 1,8 e 2,0. Questo saggio amplifica il gDNA mediante PCR multiplex locus-specifica con primer, seguita dall'aggiunta di un codice a barre specifico della reazione alla sequenza recettoriale amplificata per l'identificazione del campione. Il DNA amplificato con codice a barre viene quindi aggregato per preparare librerie di sequenziamento, che vengono sottoposte a NGS utilizzando la piattaforma Illumina. Sono stati verificati una dimensione finale della libreria di 350–450 bp e una concentrazione ≥ 5 nM mediante Bioanalyzer. I dati di sequenziamento vengono elaborati utilizzando pipeline bioinformatiche personalizzate e rigorosi controlli di qualità. Le letture vengono assegnate a BCR o TCR riarrangiati per ciascun campione e aggregate in sequenze recettoriali clonali. Queste sequenze vengono quindi valutate per il loro potenziale legato alla malattia e per l'idoneità al successivo monitoraggio. Per essere considerata idonea, una sequenza deve costituire almeno il 10% di tutte le sequenze di BCR nel locus specifico e dimostrare una sufficiente unicità. Nell'analizzare una sequenza per il monitoraggio della MRD, la sua unicità viene determinata confrontandola con un database completo del repertorio di cellule B o T, come il database ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www.imgt.org). La frequenza della sequenza all'interno di questo database viene utilizzata per valutarne la specificità. Una volta identificate le sequenze appropriate legate alla malattia, queste vengono confrontate con campioni successivi per monitorare la MRD. I campioni vengono classificati come MRD-positivi (+) se vengono trovati riscontri della sequenza, o MRD-negativi (-) se non vengono rilevati riscontri. Viene quantificata la concentrazione di ciascuna sequenza monitorata, consentendo il calcolo del numero consensuale di cellule maligne e di cellule nucleate totali a livello del campione. Il rapporto tra questi valori fornisce una stima della frequenza delle cellule tumorali all'interno di un campione, offrendo informazioni preziose sull'evoluzione della malattia o sulla remissione. Una sequenza clonale è stata considerata valida per il monitoraggio se sono state rilevate almeno 50 letture di supporto e la sequenza costituiva ≥10% del repertorio totale di BCR/TCR alla diagnosi.

Tutti i campioni di origine umana sono stati manipolati come materiali biologicamente pericolosi all'interno di un armadio di sicurezza biologica di Classe II (BSC) utilizzando dispositivi di protezione individuale (DPI). I materiali monouso contaminati sono stati sterilizzati in autoclave (121 °C, 20 min) prima dello smaltimento; i rifiuti liquidi sono stati trattati con candeggina al 10%.

Studi sulla precisione e sensibilità
Il limite di rilevazione (LOD) è stato determinato utilizzando campioni clinici e linee cellulari in un contesto di DNA genomico (gDNA) di sangue periferico proveniente da donatori sani. Per stabilire la linearità del rilevamento, il gDNA di linee cellulari è stato aggiunto in modo controllato al DNA normale per creare una serie di frequenze clonali che coprissero diversi ordini di grandezza. In particolare, le cellule maligne sono state aggiunte a partire da 10 cellule, seguite da diluizioni seriali di 10 volte: 10, 100, 1.000 e 10.000 cellule. Il LOD è stato calcolato come il numero atteso di cellule maligne in ingresso al quale la curva probit interpolata raggiungeva una probabilità di rilevazione del 95%. La coerenza tra le frequenze osservate e quelle attese è stata analizzata mediante regressione lineare. Questi parametri forniscono una base solida per la stima del livello di malattia residua minima (MRD) a livello del campione negli studi successivi di valutazione. Questa versione migliorata mantiene il tono accademico, migliorando al contempo chiarezza e concisione, e assicura l'uso corretto della terminologia scientifica nel rispetto delle convenzioni della scrittura scientifica nel campo delle scienze della vita e della medicina.

Analisi statistica
È stato considerato statisticamente significativo un valore di p bilaterale < 0,05. La linearità è stata valutata e calcolata utilizzando il coefficiente di correlazione di Pearson (r) in GraphPad Prism. L'analisi statistica è stata eseguita con il linguaggio R (versione 3.6.1). Il calcolo della sopravvivenza libera da progressione (PFS) inizia nel momento in cui il paziente raggiunge una risposta completa (CR), una risposta parziale (PR) o una risposta parziale molto buona (VGPR), e prosegue fino al verificarsi di malattia progressiva (PD) o alla morte per qualsiasi causa. La curva di Kaplan-Meier è stata utilizzata per analizzare la sopravvivenza, e il test del log-rank è stato impiegato per confrontare le differenze di sopravvivenza tra sottogruppi. L'analisi di Cox è stata condotta mediante analisi univariata e multivariata.

Risultati

Elaborazione, linearità e precisione della rilevazione della clonalità
I saggi di clonalità BCR/TCR si basavano su due round di PCR multiplex seguiti da sequenziamento NGS (Figura 1). I saggi di clonalità BCR erano in grado di identificare riarrangiamenti di IGH (VH-DH-JH o DH-JH), IGK (Vκ-Jκ, Vκ-Kde e intronRSS-Kde) e IGL (Vλ-Jλ), nonché traslocazioni BCL1-IGH e BCL2-IGH, utilizzando reazioni separate o una singola reazione mista ottimizzata. I saggi di clonalità TCR potevano rilevare riarrangiamenti di TCRB (Vβ-Dβ-Jβ) e TCRG (Vγ–Jγ). La clonalità BCR delle neoplasie linfoidi B mostrava un tasso di rilevazione del 93,94%, mentre la clonalità TCR delle neoplasie linfoidi T mostrava un tasso di rilevazione del 90,91% (Tabella 1).

La linearità è stata dimostrata in un ampio intervallo di quantità di campione in ingresso (0,2 µg, 2 µg e 20 µg) in base ai risultati dei test su linee cellulari, che coprono diversi ordini di grandezza. Per stabilire la linearità, cellule maligne sono state aggiunte in modo controllato a DNA genomico normale mediante diluizioni seriali di 10 volte (10, 100, 1.000 e 10.000 cellule). La linearità è stata osservata con pendenze stimate comprese tra 0,93 e 1,06 su frequenze clonali che andavano da 1 a 10^-6 (Figura 2A). Il limite di rilevabilità (LOD) è stato stimato tra 1 e 2 cellule maligne sia nei saggi di clonalità BCR che TCR (Figura 2B). Inoltre, i saggi di clonalità BCR/TCR sono stati in grado di rilevare la clonalità nel linfoma utilizzando campioni tissutali (BMA) e il corrispondente sangue periferico (Tabella Supplementare 1).

Pazienti e campioni utilizzati per la validazione del rilevamento della MRD
La validazione del rilevamento della MRD ha incluso un totale di 29 pazienti con MM, di cui uno escluso a causa di danni al campione. La popolazione dello studio era composta dal 65,52% (19/29) di maschi e dal 34,48% (10/29) di femmine, con un'età mediana di 65 anni (intervallo 33–82) (Tabella 2). Tra il gruppo di studio, il 31,03% (9/29) dei pazienti è stato classificato ad alto rischio, il 24,14% (7/29) a rischio standard e il 37,93% (11/29) a basso rischio secondo i criteri IMWG¹⁸. Le fasi del sistema internazionale di stadiazione rivisto del mieloma multiplo (R-ISS) I, II e III rappresentavano rispettivamente il 10,34% (3/29), il 48,28% (14/29) e il 20,69% (6/29) dei pazienti¹⁹.

Confronto tra i saggi NGS e MFC
È stato effettuato un confronto diretto a coppie per valutare l'accuratezza quantitativa dei saggi OriMIRACLE LTM e MFC. I risultati hanno mostrato un'accuratezza quantitativa simile nell'intervallo testato, in particolare a frequenze di MRD superiori a 10⁻⁴, con un valore di correlazione di Pearson R pari a 0,73 (Figura 3). Le cellule tumorali sono state rilevate sia con il saggio MFC che con quello NGS in 59 campioni provenienti da 29 pazienti con MM, e la coerenza ha raggiunto l'81,36% (48/59). Questa coerenza riflette la presenza di cellule tumorali rilevabili in diversi momenti temporali, piuttosto che una reale concordanza tra i due metodi. Tra i campioni, il 62,07% (18/29) è risultato MRD+ in entrambi i saggi NGS e MFC, un paziente è risultato MRD− con entrambi i metodi, mentre 11 pazienti sono risultati MRD+ con il saggio NGS ma MRD− con il saggio MFC. Tra i pazienti con risultati di rilevamento discordanti, tre presentavano una frequenza di rilevamento inferiore a 10^-4, mentre otto avevano una frequenza di rilevamento compresa tra 10^-2–10^-4 (Figura 3). L'estrazione del DNA da campioni residui di striscio di midollo osseo viene effettuata per ottenere la massima quantità possibile di DNA. Per il rilevamento della clonalità prima del trattamento, è stata testata una quantità media di DNA in ingresso pari a 91,95 ng (fino a 100,0 ng). Per i successivi test di MRD, è stata estratta una quantità media di 1623,39 ng di DNA (con un intervallo compreso tra 50,1–17400,0 ng) (Tabella Supplementare 2). I risultati hanno mostrato che l'NGS è in grado di rilevare la MRD anche quando il campione residuo è insufficiente, mentre il MFC non è riuscito a rilevare la MRD in alcuni casi.

Validità clinica del rilevamento della MRD mediante saggio NGS per l'intervallo principale
Le sequenze clonali sono state rilevate al basale in tutti i pazienti con MM, seguite dalla valutazione della MRD (Figura 4). In diciotto pazienti la presenza di MRD è stata confermata mediante rilevamento NGS e MFC. Tra i pazienti risultati MRD+ sia con MFC che con NGS, il 61,11% (11/18) ha successivamente presentato progressione della malattia (PD) o recidiva. Il 38,89% (7/18) dei pazienti ha raggiunto una malattia stabile (SD) o una risposta parziale (PR) durante lo studio. Tra i pazienti risultati MRD+ con NGS ma MRD− con MFC, il 36,36% (4/11) non è riuscito a raggiungere una risposta completa clinica (CR) alla più recente valutazione clinica (Tabella Supplementare 2). Inoltre, tra tutti i pazienti la cui risposta clinica era stata CR, il 37,50% (3/8) ha presentato recidiva dopo l'interruzione del trattamento. Abbiamo inoltre esaminato le caratteristiche cliniche primarie e i risultati MFC in relazione all'esito del PFS (Figura Supplementare 1). Le analisi univariata e multivariata del PFS hanno rivelato che non erano significativamente correlati. In questo studio, non è stata osservata una differenza significativa nel PFS analizzando esclusivamente i risultati di MRD ottenuti con MFC.

DISPONIBILITÀ DEI DATI
A causa di restrizioni relative alla privacy dei pazienti e delle politiche istituzionali, i dati grezzi non sono disponibili pubblicamente. Un riassunto dei dati raccolti è fornito nel File Supplementare 1.

Figura 1: Il saggio di clonalità BCR/TCR prevedeva una PCR multiplex seguita da NGS. La PCR del primo round ha amplificato la regione CDR3 dei geni dei recettori immunitari riarrangiati utilizzando primer specifici per locus e indici specifici per campione, mentre gli adattatori per NGS sono stati aggiunti durante la PCR del secondo round. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: La linearità della rilevazione della clonalità è stata valutata aggiungendo gDNA di linee cellulari a gDNA normale in un intervallo di frequenze clonali. (A) Linearità dei saggi di clonalità di BCR e TCR. (B) Limite di rilevazione (LOD) stimato utilizzando campioni clinici e linee cellulari aggiunte a gDNA di sangue periferico di donatori sani. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Confronto a coppie delle misurazioni della frequenza di MRD tra MFC e il saggio NGS per la MRD. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: La dinamica della MRD nei pazienti con MM e i diversi stati clinici dei pazienti. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tipi di campione		N.	Tipo di malattia	Clonotipo dominante
Linee cellulari	REH	1	B-ALL	IGH, IGK
	NALM6	2	B-ALL	IGH, IGK
	Jurkat	3	T-ALL	TCRB, TCRG
	H9	4	Linfoma	TCRB, TCRG
Malignità linfoidi cliniche a cellule B		5	B-ALL	IGH
		6	B-ALL	IGL
		7	B-ALL	IGH
		8	B-ALL	Non rilevato
		9	CLL	IGH, IGK
		10	CLL	IGH, IGK
		11	CP-CML	IGH
		12	BP-CML	IGH
		13	MM	IGK
		14	MM	IGH, IGK
		15	MM	IGK
		16	MM	IGH
		17	MM	IGH
		18	MM	IGK
		19	MM	IGH
		20	MM	IGH, IGK
		21	MM	IGH, IGK
		22	MM	IGH
		23	Linfoma	IGH, IGK
		24	Linfoma	IGH, IGK, IGL
		25	Linfoma	IGH, IGK, IGL
		26	Linfoma	IGH, IGK, IGL
		27	Linfoma	IGH
		28	Linfoma	IGH
		29	Linfoma	IGH, IGK, IGL
		30	Linfoma	IGH, IGK
		31	Linfoma	IGH, IGK
		32	Linfoma	IGH, IGK, IGL
		33	Linfoma	IGK
		34	Linfoma	IGH
		35	Linfoma	Non rilevato
Malignità linfoidi cliniche a cellule T		36	Linfoma	TCGR
		37	Linfoma	TCRB, TCRG
		38	Linfoma	TCRB, TCRG
		39	Linfoma	TCRB, TCRG
		40	Linfoma	TCRB, TCRG
		41	Linfoma	TCRB, TCRG
		42	Linfoma	TCRB, TCRG
		43	Linfoma	TCRB, TCRG
		44	Linfoma	Non rilevato

Tabella 1: Rilevamento della clonalità mediante saggi di clonalità BCR/TCR in 4 linee cellulari e 40 campioni clinici. B-ALL: leucemia linfocitica acuta B; T-ALL: leucemia linfocitica acuta T; CP-CML: leucemia mieloide cronica in fase cronica; BP-CML: leucemia mieloide cronica in fase blastica; CLL: leucemia linfocitica cronica; MM: mieloma multiplo.

Caratteristica	Totale (N = 29)
Età mediana, anni (intervallo)	65 (33-82)
Sesso, n (%)
Maschio	19 (65,52)
Femmina	10 (34,48)
Tipo di catena pesante, n (%)
IgG	14 (48,28)
IgA	7 (24,14)
IgE	1 (3,45)
Tipo di catena leggera, n (%)
k	19 (65,52)
λ	8 (27,59)
Anomalie citogenetiche, n (%)
del17p	2 (6,90)
del13q14	9 (31,03)
guadagno/amplificazione 1q21	12 (41,38)
t (4;14)	2 (6,90)
Nessuna anomalia	9 (31,03)
Stadio ISS, n (%)
I	4 (13,79)
II	13 (44,83)
III	12 (41,38)
Stadio R-ISS, n (%)
I	3 (10,34)
II	14 (48,28)
III	6 (20,69)
Dati mancanti	6 (20,69)
IMWG, n (%)
Alto rischio	9 (31,03)
Rischio standard	7 (24,14)
Basso rischio	11 (37,93)
Dati mancanti	2 (6,90)

Tabella 2: Caratteristiche basali dei 29 pazienti con MM arruolati in questo studio. k: kappa; λ: Lambda; DS: Durie-Salmon; ISS: sistema internazionale di stadiazione; R-ISS: sistema internazionale di stadiazione rivisto; IMWG: gruppo di lavoro internazionale per il mieloma

Figura supplementare 1: Analisi della sopravvivenza basata su caratteristiche cliniche e risultati della MFC. (A) Analisi univariata e multivariata della PFS. (B) Curva di Kaplan-Meier con il risultato della MFC. (C) Curva di Kaplan-Meier con il risultato della NGS. Cliccare qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 1: Rilevamento della clonalità del linfoma mediante saggi di clonalità BCR/TCR in campioni di tessuto e sangue periferico abbinato. NHL: linfoma non-Hodgkin; HGBL: linfoma a cellule B di alto grado; FL: linfoma follicolare; DLBCL: linfoma diffuso a grandi cellule B; ITLPD-GI: disturbi linfoproliferativi T indolenti del tratto gastrointestinale. Cliccare qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 2: Risultati della rilevazione della MRD basati su saggi MFC e NGS. ND: non rilevato; Risposta parziale: PR; Risposta completa: CR; Malattia stabile: SD; Risposta parziale molto buona: VGPR. Cliccare qui per scaricare il file.

File Supplementare 1: Sintesi dei dati grezzi raccolti in questo studio. Cliccare qui per scaricare il file.

Discussione

Negli ultimi anni si sono registrati notevoli miglioramenti nei risultati clinici delle neoplasie linfoidi, stimolando la ricerca di marcatori alternativi in grado di prevedere precocemente gli esiti di sopravvivenza e accelerare la valutazione di nuove terapie²⁰. Una metanalisi completa che ha coinvolto 8.098 pazienti ha confermato nuovamente il forte valore prognostico della negatività della MRD nel migliorare la sopravvivenza a lungo termine nei pazienti con mieloma multiplo²¹. Inoltre, le riarrangiamenti clonali di BCR e TCR si sono affermati come marcatori fondamentali per la diagnosi e il monitoraggio della MRD, guidando le decisioni terapeutiche nelle neoplasie del sistema linfatico²².

Sempre più evidenze sostengono la superiorità della valutazione della clonalità di BCR/TCR basata sul NGS rispetto ai saggi basati su MFC e PCR, in particolare quando sono disponibili campioni di DNA in quantità sufficiente. Il NGS offre una sensibilità maggiore e una standardizzazione più semplice^{10,23,24,25,26} ed è stato identificato come un forte fattore prognostico sia per la sopravvivenza libera da progressione (PFS) sia per la sopravvivenza globale all’inizio della terapia di mantenimento²⁷.
In questo studio, abbiamo sviluppato un saggio basato sul NGS, che dimostra un tasso di rilevamento positivo superiore al 90% sia per la clonalità di BCR sia per quella di TCR nelle neoplasie linfoidi. Il limite di rilevamento (LOD) del saggio è stimato tra 1 e 2 cellule maligne sia per il saggio di clonalità di BCR sia per quello di TCR, paragonabile all’elevata sensibilità del clonoSEQ Assay con un LOD di 1,903 cellule maligne¹⁶. È stata osservata una linearità con pendenze stimate comprese tra 0,93 e 1,06 su frequenze clonali da 1 a 10^-6, indicando una forte proporzionalità tra le frequenze clonali osservate e quelle attese. Dopo aver stabilito metodi di rilevamento standardizzati e completato la validazione in laboratorio, abbiamo effettuato una validazione clinica per garantire l’idoneità del saggio al monitoraggio clinico della MRD.

Questo studio ha rivelato una concordanza dell'81,36% (48/59) tra il saggio basato su NGS e il MFC. Entrambi i metodi hanno dimostrato una sensibilità del 100% nell'identificazione delle cellule tumorali nei casi appena diagnosticati o recidivati. Per il monitoraggio post-trattamento, non è stata riscontrata una correlazione significativa tra lo stato di MRD valutato mediante MFC e la PFS, probabilmente a causa della dimensione limitata del campione. Di conseguenza, abbiamo condotto un'analisi completa di tutti i casi.

Tra i 18 pazienti identificati come positivi alla MRD con entrambi i metodi, i risultati della MRD erano in accordo con le valutazioni della risposta clinica. Nove di questi pazienti hanno presentato progressione della malattia (PD) o recidiva, quattro hanno raggiunto una malattia stabile (SD), quattro una risposta parziale (PR) e uno è deceduto. Questo suggerisce che nei pazienti risultati positivi alla MRD con entrambi i metodi, la progressione della malattia o la recidiva vengono quasi invariabilmente osservate. Questi dati indicano che la positività alla MRD nei test NGS e MFC riflette prevalentemente un'efficacia limitata o una prognosi sfavorevole in questi pazienti. Dei 11 pazienti risultati positivi alla MRD con NGS ma negativi con MFC, il 36,36% non ha raggiunto una risposta completa (CR). Questi risultati evidenziano la capacità dell'NGS di rilevare la MRD a frequenze comprese tra 10^-2 e 10^-6, anche con campioni residui limitati, mentre l'MFC non è riuscito a rilevare la MRD in alcuni casi. Questo conferma ulteriormente la maggiore sensibilità e specificità dell'NGS rispetto all'MFC nel rilevamento della MRD.

Ricerche precedenti hanno dimostrato che lo stato di MRD valutato mediante citofluorimetria a flusso (MFC) è un forte predittore di sopravvivenza libera da progressione (PFS) e di sopravvivenza globale nei pazienti con mieloma multiplo (MM), sottolineando l'importanza del monitoraggio dell'MRD nell'indirizzare le decisioni terapeutiche e nel valutare la prognosi dopo trapianto autologo di cellule staminali²⁸. I risultati qui presentati evidenziano ulteriormente il valore dei saggi NGS, come illustrato da due casi (pazienti 11 e 14) in cui i pazienti risultavano negativi all'MRD mediante MFC ma positivi all'MRD mediante NGS. È fondamentale osservare che l'interruzione del trattamento in tali casi potrebbe comportare un rischio di recidiva, sottolineando la necessità di una valutazione accurata della risposta al trattamento quando si osservano risultati discordanti per l'MRD.

Questo studio elimina la dipendenza dei metodi NGS e MFC da aspirati midollari freschi o cellule congelate e, per la prima volta, convalida sistematicamente che strisci midollari residui, anche colorati, rimasti dopo una diagnosi di routine possono costituire un materiale iniziale affidabile per il rilevamento dell'MRD ad alta sensibilità. Questo intervento affronta direttamente le seguenti lacune cliniche e metodologiche: (1) evita la necessità di prelevare grandi volumi di liquido midollare per il monitoraggio dell'MRD, specialmente in pazienti anziani o in quelli con difficoltà di campionamento; (2) consente l'analisi retrospettiva di strisci archiviati, sfruttando così le risorse patologiche esistenti per stabilire evidenze prognostiche basate sull'MRD in coorti storiche; e (3) con una sensibilità di rilevamento di 10^-5-10^-6, risulta nettamente superiore rispetto alla MFC convenzionale (tipicamente 10^-4-10^-5) ed evita i falsi negativi causati da problemi di qualità del campione nella MFC, fornendo uno strumento di valutazione dell'MRD basato sul DNA e tracciabile per l'uso clinico.

Sono stati identificati diversi passaggi critici per garantire il successo e l'affidabilità del saggio. La raschiatura delicata dei residui di striscio seguita dall'immediata applicazione del tampone era essenziale per ottenere un rendimento adeguato di DNA genomico. Era richiesta una quantità precisa di DNA in ingresso (100 ng per reazione, entro ±10%) per evitare la perdita di alleli o un'amplificazione distorta. Il pooling equimolare dei prodotti marcati con barcode (2 nM) ha contribuito a una profondità di sequenziamento uniforme, e l'applicazione costante di soglie bioinformatiche (frequenza clonale ≥10% alla diagnosi e ≤5% di discrepanze per il tracciamento) ha aiutato a prevenire chiamate false positive di MRD. Inoltre, sono state introdotte diverse modifiche al protocollo standard per affrontare problemi sperimentali comuni. Quando la concentrazione finale della libreria risultava inferiore a 5 nM, si aggiungeva con cautela un secondo ciclo di PCR con 2–4 cicli aggiuntivi per evitare distorsioni da sovra-amplificazione. Per i campioni in cui il tracciamento clonale falliva a causa di un numero eccessivo di discrepanze (>5%), si aggiornava il database di riferimento IMGT e la tolleranza alle discrepanze veniva temporaneamente allentata all'8% per analisi esplorative, anche se il valore standard del 5% rimaneva la soglia di riferimento per le segnalazioni cliniche. Se la profondità di sequenziamento scendeva al di sotto di 50.000 letture per campione, si procedeva a un nuovo pooling e a una nuova sequenziazione senza ripetere il passaggio di PCR.

Nel complesso, questa validazione nel mondo reale dimostra che i campioni residui di striscio del midollo osseo forniscono risultati di test costanti e affidabili in diversi contesti terapeutici. In aree economicamente svantaggiate dove la biopsia del midollo osseo e la MFC vengono eseguite abitualmente al posto del NGS, i risultati suggeriscono che il NGS può essere preso in considerazione per ulteriori valutazioni molecolari qualora i risultati iniziali siano negativi. L'utilizzo di campioni residui è appropriato in tali situazioni, poiché elimina la necessità di ripetute aspirazioni del midollo osseo, riducendo così il carico per il paziente.

Mentre il nostro studio in corso nel mondo reale mira ad ampliare la dimensione del campione per ulteriori analisi, riconosciamo diverse limitazioni. Possono verificarsi falsi negativi, in particolare quando il contenuto di DNA estratto è insufficiente, come osservato nel secondo rilevamento di MRD per il paziente 10. Inoltre, la proporzione di cloni rilevati mediante NGS è influenzata dalla quantificazione cellulare, con possibile sovrastima delle proporzioni cellulari di MRD. La validazione si concentra principalmente su campioni di midollo osseo. Tuttavia, il significato a lungo termine dell'MRD mediante NGS risiede in controlli ripetuti dopo il trattamento, nei quali il sangue periferico potrebbe risultare più adatto. La validazione su campioni di sangue periferico non è ancora stata effettuata. Data la limitata numerosità dei campioni per la validazione clinica, il reclutamento casuale dei pazienti e le diverse strategie terapeutiche adottate in questo studio nel mondo reale, è risultato difficile raccogliere campioni consecutivi di MRD. Di conseguenza, ci siamo concentrati sulla valutazione del significato delle risposte precoci all'MRD in relazione alla successiva progressione, senza poter dimostrare l'impatto dello stato persistente di MRD sugli esiti a lungo termine. Inoltre, l'NGF non è stato incluso nell'analisi comparativa. Sebbene NGS e MFC convenzionale siano stati confrontati sistematicamente, l'NGF, essendo uno dei due metodi per l'MRD raccomandati dall'IMWG (l'altro è l'NGS), avrebbe potuto fornire ulteriori informazioni sulle prestazioni del saggio. Inoltre, la dimensione del campione è relativamente ridotta (n = 40) e la coorte è eterogenea, comprendendo diverse neoplasie ematologiche. Sono necessari futuri studi multicentrici su larga scala, che includano l'NGF e si concentrino su una singola neoplasia, come il mieloma multiplo, per confermare ed estendere le nostre conclusioni.

Dopo aver accuratamente caratterizzato e validato le prestazioni del saggio di clonalità BCR/TCR basato su NGS, abbiamo dimostrato che esso ha un potenziale come metodo altamente sensibile, accurato e pratico per quantificare e monitorare la malattia residua minima (MRD) in campioni di striscio di midollo osseo residuo provenienti da pazienti con mieloma multiplo (MM).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anti-CD19	Abcam	AB134114	Diluizione secondo le istruzioni del produttore
Anti-CD20	Abcam	AB64088	Diluizione secondo le istruzioni del produttore
Anti-CD22	Abcam	AB32123	Diluizione secondo le istruzioni del produttore
Anti-CD33	Abcam	AB134115	Diluizione secondo le istruzioni del produttore
Anti-CD34	Abcam	AB81289	Diluizione secondo le istruzioni del produttore
Anti-CD38	Abcam	AB183326	Diluizione secondo le istruzioni del produttore
Anti-CD45	Abcam	AB40763	Diluizione secondo le istruzioni del produttore
Anti-CD56	Abcam	AB75813	Diluizione secondo le istruzioni del produttore
Anti-CD9	Abcam	AB2215	Diluizione secondo le istruzioni del produttore
Anti-HLA-DR	Abcam	AB20181	Diluizione secondo le istruzioni del produttore
GraphPad Prism	GraphPad	https://www.graphpad.com/
Illumina NovaSeq 6000	Illumina	NovaSeq 6000	https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html
Database ImMunoGeneTics (IMGT)	Database ImMunoGeneTics (IMGT)	http://www.imgt.org/
Linee cellulari di neoplasie linfoidi	ATCC	https://www.atcc.org/	Linee B-ALL REH e NALM6, linea T-ALL Jurkat e linea di linfoma H9 (DSMZ)
Citometria a flusso multiparametrica	BECKMAN COULTER	CytoFLEX
Saggio OriMIRACLE LTM	Origimed Co., Ltd., Shanghai, Cina
Linguaggio R	Fondazione R per il Calcolo Statistico	versione 3.6.1