Il sequenziamento trascritomico identificò chemochine patogeniche a hub nelle placche aterosclerotiche

Sommario

Questo studio mira ad analizzare i meccanismi sottostanti dei fattori infiammatori associati alle placche aterosclerotiche (AP) utilizzando il sequenziamento dell'RNA. I risultati hanno identificato i geni chiave hub infiammatori CCL3, CCL4 e CXCL1 nell'AP. Queste chemiocine possono guidare l'aterosclerosi favorendo l'accumulo di macrofagi M0 e sopprimendo le cellule immunitarie protettive, rivelando potenziali bersagli terapeutici.

Abstract

La placca aterosclerotica (AP) è un tipo di malattia proliferativa infiammatoria del tessuto fibroso dopo la lesione delle cellule endoteliali e delle cellule muscolari lisce nella parete arteriosa, che può portare a diversi gradi di ostruzione del flusso sanguigno cardiovascolare e cerebrovascolare. Tuttavia, gli approcci terapeutici efficaci che mirano all'infiammazione finora hanno in gran parte fallito, suggerendo che rimangono necessarie ulteriori intuizioni. In questo studio si è volto analizzare i cambiamenti trascritomici correlati ai fattori infiammatori nell'AP utilizzando il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq). RNA-seq è stato eseguito su campioni di pazienti con AP (n = 11) e individui di controllo (n = 3). Geni differenzialmente espressi (DEG) sono stati identificati utilizzando Metascape, seguiti dall'analisi di arricchimento delle vie KEGG usando il pacchetto clusterProfiler nel software R, dall'analisi dell'infiltrazione immunitaria tramite CIBERSORT e dalla rete di interazione proteina-proteina (PPI) tramite database STRING. I geni hub all'interno della rete PPI sono stati identificati utilizzando il plugin CytoHubba. Sono stati identificati in totale 3713 DEG nel gruppo AP, inclusi 2097 geni a regolazione all'alto e 1616 a regolazione inferiore. I risultati hanno mostrato che i DEG erano principalmente arricchiti nelle vie immunitarie e infiammatorie. Tre fattori correlati all'infiammazione, CCL3, CCL4 e CXCL1, sono stati considerati come geni hub principali nel processo patologico dell'AP. L'analisi dell'infiltrazione immunitaria ha rivelato un microambiente distinto nell'AP, caratterizzato da un aumento significativo dei macrofagi M0 insieme a riduzioni delle cellule T CD8⁺, delle cellule NK attivate e dei mastociti a riposo all'interno dell'AP. In conclusione, questi risultati procedurali descrivono l'espressione differenziale di CCL3, CCL4 e CXCL1 e la loro associazione con una composizione cellulare immunitaria alterata nell'AP, evidenziando le tre chemiocine come potenziali candidate per ulteriori indagini meccanicistiche.

Introduzione

Le malattie cardiovascolari (CVD) rappresentano una seria minaccia per la salute umana in tutto^{il mondo.} Con l'intensificarsi della tendenza globale all'invecchiamento della popolazione, anche l'incidenza delle CVD è in aumento². Tra queste, la placca aterosclerotica (AP) è una delle principali cause della^{CVD 3}. L'AP è una malattia infiammatoria cronica, caratterizzata dall'accumulo graduale di lipidi nell'intimità delle arterie e dalla formazione di^placche. L'AP è la causa comune per eventi cardiovascolari e cerebrovascolari e coinvolge principalmente arterie grandi e medie, portando a ischemia e lesioni, ed è un fattore importante che causa malattie cardiovascolari e cerebrovascolari e la morte⁵. A causa della mancanza di sintomi evidenti nelle fasi iniziali, l'AP è solitamente avanzata al momento della diagnosi, con un alto tasso di^{mortalità 6}. Il trattamento per la PA si concentra sui fattori di rischio, inclusi fattori modificabili come bassa attività fisica, comportamento sedentario, fumo, problemi di salute^{mentale 7}, e obesità e diabete di tipo 2 dovuto a una dieta ricca di grassi, oltre a fattori non modificabili come geni, età e^{sesso 8}. Studi recenti hanno rilevato che la sindrome metabolica, l'omocisteinemia, l'iperuricemia e la resistenza pancreasica sono fattori di rischio importanti per l'insorgenza e lo sviluppo dell'aterosclerosi ^9,10.

Le teorie relative alla patogenesi dell'AP includono principalmente le teorie dell'infiltrazione lipidica, dell'infiammazione, della risposta allo stress ossidativo, dell'infezione e dell'interazione tra fattori genetici e^{ambientali 11,12}. Tra questi, l'infiammazione e lo stress ossidativo sono riconosciuti come la patogenesi centrale dell'AP e partecipano a tutti i processi, dalla comparsa allo sviluppo e al deterioramento dell'AP¹³. Il danno improvviso della placca instabile dell'AP, dell'attivazione piastrinica e della trombosi sono importanti patogenesi dell'infarto miocardico e dell'ictus^{emorragico 14}. Con ricerche continue, è stato scoperto che l'AP contiene non solo lipidi ma anche molte cellule^{infiammatorie 15}. Il fumo, l'ipertensione, i disturbi lipidici, l'iperinsulinemia, l'iperglicemia, l'alto acido urico e altri stimoli dannosi inducono i globuli bianchi e le cellule endoteliali a rilasciare continuamente molecole di adesione solubili e varie citochine, favorendo l'aderenza dei monociti alle cellule endoteliali vascolari. Le chemimochine accumulate portano inoltre alla migrazione dei monociti nello spazio subendoteliale e si differenziano in macrofagi, che poi fagocitano la lipoproteina ossidata a bassa densità (LDL) ricca di colesterolo all'interno del tessuto, trasformandosi così in cellule schiumose e avviando la formazione di striature^{lipidiche 16}. Il danno patologico precoce della SA, ovvero striature lipidiche, è composto principalmente da macrofagi e linfociti T, che rappresentano una tipica lesione^{infiammatoria 17}. Pertanto, varie cellule infiammatorie e i loro prodotti sono coinvolti nell'inizio e nella progressione di AP¹⁸. Tuttavia, il panorama infiammatorio della panglia astra è complesso e coinvolge molteplici fattori noti e potenzialmente sconosciuti. Gli approcci tradizionali dei geni candidati potrebbero non riuscire a cogliere l'intero spettro di fattori infiammatori.

Per affrontare questa limitazione, abbiamo utilizzato il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq), un metodo trascritomico ad alta produttività imparziale e senza pregiudizio. Questo approccio è particolarmente appropriato per studi che generano ipotesi in cui i principali fattori molecolari non sono predefiniti. A differenza dei metodi basati su gene candidati o microarray, RNA-seq offre un intervallo dinamico più ampio, una maggiore sensibilità e la capacità di rilevare nuovi trascrizioni senza un precedente probe^{design 19,20}. Queste caratteristiche lo rendono particolarmente adatto per scoprire firme legate all'infiammazione nell'AP, dove la base molecolare rimane incompletamente caratterizzata.

In questo studio, è stato eseguito RNA-seq per analizzare i meccanismi sottostanti dei fattori infiammatori associati all'AP. Sono stati utilizzati strumenti bioinformatici che utilizzano algoritmi diversi per selezionare una serie di DEG. Successivamente sono state condotte analisi di arricchimento (WGCNA, via KEGG, mcode, GSEA, analisi genica centrale) e analisi di interazione proteina-proteina (PPI) della rete. I risultati di questo studio contribuiscono a una migliore comprensione del meccanismo patologico molecolare alla base dell'AP infiammatorio e svolgono un ruolo importante nella ricerca di nuovi biomarcatori.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Popolare di Liaocheng (Numero di approvazione: 2023014) e ha rispettato i principi della Dichiarazione di Helsinki. È stato ottenuto il consenso informato da tutti i partecipanti. I moduli di consenso informato venivano firmati da tutti i pazienti o dalle loro famiglie.

Pazienti e campioni

Questo studio ha analizzato retrospettivamente 11 pazienti con grave stenosi dell'arteria carotide che hanno subito una endarterectomia carotide presso il Dipartimento di Neurochirurgia Vascolare del Liaocheng People's Hospital, provincia di Shandong, Cina, da gennaio 2023 a dicembre 2023. Questi pazienti sono stati arruolati nel gruppo AP. La diagnosi di stenosi dell'arteria carotide si basava su dati di imaging come la CTA o l'angiografia cerebrale. I criteri di inclusione per il gruppo AP erano: (1) età tra i 50 e gli 80 anni; (2) tomografia computerizzata/angiografia a sottrazione digitale ha confermato la stenosi dell'arteria carotide interna intracranica ≥70%; (3) punteggio pre-insetto, scala modificata ≤ 1; (4) il consenso informato ottenuto dal paziente o dal suo rappresentante legale. I criteri di esclusione erano: (1) malattie infiammatorie o immunitarie; (2) presenza di disturbi psichiatrici; (3) presenza di tumori maligni; (4) gravidanza, allattamento o possibilità di maternità. Età: I pazienti con gravi lesioni cerebrali traumatiche che hanno ricevuto donazione di organi nello stesso ospedale nello stesso periodo sono stati selezionati come gruppo di controllo (NA; Controllo normale, n = 3). I soggetti dei due gruppi sono stati abbinati per età, sesso e indice di massa corporea per eliminare i fattori di confusione. I criteri di inclusione per il gruppo di controllo erano: (1) età tra i 50 e gli 80 anni; (2) nessuna storia di malattia coronarica, stenosi carotide o altre malattie vascolari sistemiche; (3) il consenso informato ottenuto dal rappresentante legale del paziente. Campioni di intima e placca dell'arteria carotide sono stati prelevati dal gruppo AP durante l'endarterectomia carotide, mentre i campioni di intima aortica sono stati prelevati dal gruppo di controllo dopo la donazione di organi. I tessuti vascolari e della placca venivano conservati in serbatoi di azoto liquido per i test successivi. Le caratteristiche di base dei pazienti con AP sono mostrate nella Tabella 1.

Preparazione del campione

L'estrazione totale di RNA è stata estratta utilizzando il reagente TRIzol secondo le istruzioni del produttore. La concentrazione e la purezza dell'RNA sono state valutate utilizzando uno spettrofotometro Nanodrop ND-2000 a 260 nm e 280 nm (rapporto A260/A280 tra 1,8 e 2,0). L'integrità dell'RNA è stata valutata utilizzando elettroforesi gel al 2% di agarosio a 100 V per 30 minuti. I valori di integrità dell'RNA (RIN) sono stati ottenuti utilizzando il bioanalizzatore Agilent 2100 (per l'analisi a valle sono stati utilizzati campioni con RIN ≥ 7.0). Tutte le procedure di gestione del campione e di estrazione dell'RNA sono state eseguite a temperatura ambiente, salvo diversa specificazione. Il reagente di rifiuti di TRIzol è stato smaltito secondo le linee guida istituzionali per i rifiuti chimici pericolosi.

Sequenziamento dell'RNA

Dopo il trattamento con DNasi I dell'RNA totale, l'mRNA è stato arricchito utilizzando sfere magnetiche Oligo D (T) e poi frammentato in brevi frammenti a 94 °C per 5 minuti. I frammenti di mRNA risultanti fungevano da modello, con oligonucleotidi casuali come primer. Il cDNA del primo filamento è stato sintetizzato tramite il sistema di trascridasi inversa M-MuLV a 42 °C per 50 minuti, seguito dalla degradazione dei filamenti di RNA mediata da RNase H. La sintesi del secondo filamento è stata effettuata utilizzando dNTP all'interno del sistema DNA polimerasi I. Il cDNA a doppio filamento veniva purificato, le estremità riparate e dotata di una sporgenza "A" per facilitare la legatura degli adattatori. Le perle AMPure XP venivano utilizzate per selezionare frammenti di cDNA di 250-300 pb, che venivano poi amplificati tramite PCR. Successivamente, i prodotti amplificati venivano purificati per generare la libreria finale. Il sequenziamento delle librerie veniva eseguito sulla piattaforma Illumina HiSeq con lunghezza di lettura a estremità accoppiata di 150 bp. Per il controllo della qualità dei dati (QC), i dati grezzi contenenti sequenze di adattatore o basi di bassa qualità venivano filtrati tramite script interni. A causa di errori di sequenziamento che possono derivare dallo strumento, la qualità dei dati è stata valutata analizzando la distribuzione dei tassi di errore di sequenziamento (il tasso di errore <'1% era considerato accettabile). Inoltre, è stata determinata la distribuzione dei contenuti del GC. Tutte le procedure di sequenziamento venivano eseguite a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione. I reagenti contenenti sostanze chimiche pericolose (ad esempio, buffer DNasi I) venivano smaltiti secondo le linee guida istituzionali per la biosicurezza.

Soglie QC e risoluzione dei problemi

Sono stati utilizzati solo campioni con RIN ≥ 7.0 e librerie con dimensione dei frammenti 250–300 bp. Erano richiesti almeno 14 milioni di letture grezze per campione con Q30 ≥ 98%. La bassa resa della libreria è stata risolta aumentando i cicli PCR a 18, ma si preferiscono 15 cicli per mantenere i tassi di duplicati sotto il 15%.

Screening dei DEG

Abbiamo valutato la distribuzione dei livelli di espressione genica tra diversi campioni. È stata utilizzata una correlazione intercampionaria dei livelli di espressione genica per verificare l'affidabilità sperimentale e l'adeguatezza della selezione del campione. L'analisi a componente principale (PCA) è stata applicata per valutare le differenze tra gruppi e la riproducibilità intra-gruppo. I DEG sono stati identificati utilizzando il database online Metascape (http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1). I DEG erano definiti come quelli con |log₂(piega cambia) | > 1 e un valore p < 0,05, considerati statisticamente significativi. Tutte le analisi bioinformatiche venivano eseguite utilizzando parametri predefiniti salvo diversa specificazione. Come checkpoint di riproducibilità intermedia, sono stati generati grafici PCA per confermare che i campioni si raggruppassero per gruppo piuttosto che per lotto.

Analisi dell'arricchimento dell'Enciclopedia di Geni e Genomi di Kyoto (KEGG)

L'analisi KEGG (http://www.genome.jp/) è un approccio sistematico alla valutazione della funzione genica per la scoperta di vie regolatorie biologiche. Questo articolo ha ottenuto per la prima volta l'ID gene di conversione simbolica ufficiale del gene differenziale da org.Hs.eg (versione 3.12.0). L'analisi del percorso KEGG veniva eseguita utilizzando il pacchetto clusterProfiler nel software R (versione 4.2.0). Una p. < 0,05 è stata considerata statisticamente significativa. Un esito intermedio è stato la generazione di una lista classificata di vie arricchite con il corrispondente conteggio genico e i valori p corretti.

Analisi della rete PPI

Per costruire la rete PPI e il gene delle chiavi di schermo, è stato utilizzato il database STRING (versione 11.0, https://string-db.org/). Solo le interazioni con un punteggio composito superiore a 0,9 sono state mantenute come statisticamente significative. La rete è stata visualizzata e analizzata utilizzando Cytoscape (versione 3.10.1), uno strumento bioinformatico open-source progettato per esplorare le reti di interazione molecolare. I geni hub all'interno della rete PPI sono stati identificati utilizzando il plugin CytoHubba (versione 0.1).

Gene hub

I 20 geni chiave principali sono stati selezionati da CytoHubba Plugin. Il rosso indica alti livelli del gene. L'analisi bioinformatica dei geni hub da parte del database online Metascape (versione 3.5, http://metascape.org/gp/index) ha analizzato 20 geni hub precedenti. L'arricchimento genico è stato identificato nelle seguenti classi di ontologia: WGCNA, PCA, mcode, GSEA. Tutti i geni presenti nel genoma fungono da base di arricchimento. Sono stati selezionati gli elementi con p. < 0,05, conteggio minimo 3 e fattore di arricchimento > 1,5.

Metodo di analisi statistica

Per analizzare i dati veniva utilizzato il software statistico SPSS 25.0. I dati di conteggio sono stati espressi in frequenza o percentuale, e il confronto tra i gruppi è stato testato tramite il test del Chi-quadrato. I dati di misurazione erano coerenti con la deviazione media ± standard della distribuzione normale, e il test T è stato utilizzato per il confronto tra i gruppi. p. < 0,05 era considerata una differenza significativa.

Risultati

Analisi dei dati RNA-seq dei geni differenziali nelle placche aterosclerotiche

Solo campioni con RIN ≥ 7.0 sono stati utilizzati per la preparazione della biblioteca. Tutti e 14 i campioni (11 AP, 3 controllo) hanno superato questa soglia. Tutti i campioni erano sequenziati in un unico lotto; pertanto, non era necessario alcun aggiustamento dell'effetto batch. Sono state generate in media 16,8 milioni di letture grezze per campione; Dopo il filtraggio di qualità, sono state mantenute 16,5 milioni di letture pulite (98%), con il 91% mappato in modo univoco al genoma di riferimento umano (HG38). L'analisi dei DEG ha mostrato che vi sono stati 2097 geni regolati all'alto e 1616 sotto-regolati (|log2FC| >1, P <0,05) in pazienti con placche di aterosclerosi rispetto ai controlli sani (Figura 1A). La heatmap dei 20 geni differenzialmente espressi con aumento e ribasso è stata mostrata nella Figura 1B. Il sequenziamento del RNAseq trascrivomico ha rivelato correlazioni con i campioni (Figura 1C). La correlazione tra moduli genici co-espressi e fenotipi è stata analizzata da WGCNA (Figura 1D). L'analisi PCA ha mostrato una differenza significativa tra il gruppo NA e il gruppo AP (P.< 0,05) (Figura 1E).

Analisi di arricchimento KEGG dei geni differenziali

L'analisi di arricchimento delle vie KEGG utilizzando il pacchetto clusterProfiler nel software R (versione 4.2.0) è stata eseguita separatamente sui geni differenzialmente espressi al rialto e al basso nel gruppo patologico (Figura 2A,B). I risultati hanno mostrato che questi geni erano significativamente arricchiti in vie legate all'immunità e all'infiammazione, come la linea cellulare ematopoietica, l'artrite reumatoide, l'adesione focale, la segnalazione dell'integrina e la via di segnalazione delle chemochine.

Analisi GSEA

L'analisi GSEA ha mostrato che i geni principali nel gruppo sperimentale erano principalmente arricchiti nella parte superiore, mostrando una tendenza alla regolazione al rialzo (Figura 3A). I geni core nel gruppo di controllo erano principalmente arricchiti nella parte inferiore, mostrando una tendenza al ribasso (Figura 3B). In sintesi, i geni infiammatori sono stati regolati al rialto nel gruppo sperimentale (ASA) e al ribasso nel gruppo di controllo (NA).

Analisi delle reti PPI

Nella rete PPI analizzata utilizzando il database STRING (versione 11.0), i nodi che condividono lo stesso ID del cluster tendono a essere posizionati vicini tra loro. Come mostrato nella Figura 4A, questo raggruppamento ha rivelato che i geni corrispondenti sono principalmente coinvolti nella regolazione dell'attivazione cellulare, della risposta infiammatoria e dell'attivazione cellulare. La Figura 4B ha presentato la stessa rete colorata da p-valori, dove cluster contenenti più geni mostrano p-valori più significativi.

Identificazione dei geni hub e analisi dell'infiltrazione delle cellule immunitarie

I DEG sono stati selezionati per l'analisi mcode e i risultati dell'analisi sono stati mostrati principalmente correlati ai recettori dell'acetilcolina (Figura 5 e Tabella 2). L'analisi genica hub utilizzando il plugin CytoHubba in Cytoscape ha identificato i 20 geni hub principali, la maggior parte dei quali associata a immunità e infiammazione (Figura 6A, pannello sinistro). I primi 10 geni hub erano CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 e CCR5 (Figura 6A, pannello destro). L'intersezione dei geni hub con i geni del panel infiammatorio olink 92 ha rivelato 5 geni comuni, tra cui CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 e CCL4 (Figura 6B). L'analisi CIBERSORT ha rivelato differenze significative nell'infiltrazione delle cellule immunitarie tra il gruppo patologico e i controlli sani. Rispetto al gruppo di controllo, il gruppo affettivo ha mostrato una proporzione significativamente più alta di macrofagi M0 (p < 0,05) (Figura 6C). Al contrario, le proporzioni di cellule T CD8, cellule NK attivate e la maggior parte delle cellule a riposo erano significativamente inferiori nel gruppo patologico (p. < 0,05 per tutti) (Figura 6C).

Analisi funzionale dei geni hub

Abbiamo ulteriormente analizzato la funzione biologica del gene Hub utilizzando il database Metascape, rivelando che questi geni sono principalmente associati alla via di segnalazione mediata da citochine e alla segnalazione mediata dal calcio (Figura 7A e Tabella 3). Le firme di tipo cellulare sono state poi utilizzate per arricchire i fattori regolatori trascrizionali del gene hub, mostrando che i geni hub erano principalmente correlati alla cellula paneth simile al paneth intestinale 24W C11, al macrofagio C8 del cuore sviluppatore di cui e ai neurotipi del mesencefalo manno hmgl (Figura 7B). L'analisi dell'arricchimento della malattia nel database DisGeNET ha dimostrato che i geni hub erano associati a lesioni cutanee, infezioni da virus Epstein-Barr e encefalite tick-bome (Figura 7C). L'analisi di arricchimento delle caratteristiche tissutali del database PaGenBase ha mostrato che i geni hub erano principalmente arricchiti nella milza, nel sangue e nei polmoni (Figura 7D). Inoltre, l'analisi del database TRRUST ha scoperto che RELA e NFKB1 sono i principali fattori di trascrizione che regolano i geni hub (Figura 7E).

DISPONIBILITÀ DEI DATI:

La matrice di conteggio processata è fornita come file supplementari (File Supplementare 1 e File Supplementare 2). Tutti gli altri dati sono presentati integralmente nell'articolo. I dati grezzi di sequenziamento sono disponibili dall'autore corrispondente su richiesta ragionevole.

Figura 1: Analisi dei DEGs. (A) Placche sane e placche aterosclerotiche, mappa differenziale dei geni vulcanici, up-regulated 2097, down-regulated 1616 (|log2FC| > 1, P .< 0,05). (B) Mappa termica dei primi 20 geni differenzialmente espressi al rialzo e al ribasso. (C) Analisi di correlazione campionaria. (D)La correlazione tra moduli genici co-espressi e fenotipi è stata analizzata da WGCNA. (E) Analisi PCA (gruppo NA è stata significativamente diversa dal gruppo AP). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: analisi KEGG. L'analisi di arricchimento delle vie KEGG è stata effettuata separatamente sui geni espressi differenzialmente in modo aumentato (A) e sotto-regolato (B) nel gruppo della malattia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi GSEA. (A) L'analisi GSEA ha mostrato che i geni principali nel gruppo sperimentale erano principalmente arricchiti nella parte superiore, mostrando una tendenza alla regolazione al rialzo. (B) Nel gruppo di controllo, i geni core erano principalmente arricchiti nella parte inferiore e mostravano una tendenza al ribasso. In conclusione, i geni infiammatori sono stati aumentati nel gruppo sperimentale (AP) e ridotti nel gruppo di controllo (NA). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Diagramma della rete PPI. (A) Colorato per ID di cluster, dove i nodi che condividono lo stesso ID di cluster sono solitamente vicini tra loro. (B) Colorazione con valori P, dove gli elementi contenenti più geni hanno valori P più significativi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: analisi mcode dei DEG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Analisi genica dell'hub. (A) I primi 20 geni hub (pannello sinistro) e i primi 10 geni hub (pannello destro) ottenuti tramite metodo di calcolo dei gradi tramite il plugin CytoHubba in CytoScape, che sono principalmente associati a immunità e infiammazione. (B) L'intersezione dei geni hub e il pannello infiammatorio olink 92 geni identificati 5 geni di intersezione. (C) L'algoritmo CIBERSORT è stato utilizzato per confrontare l'abbondanza di infiltrazione di 22 sottoinsiemi di cellule immunitarie tra i gruppi AP e NA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Analisi bioinformatica dei geni hub. (A) Annotazione funzionale dei geni hub utilizzando il database Metascape. (B) Analisi di arricchimento dei regolatori trascrizionali associati ai geni hub basata sulle firme di tipo cellulare. (C) Analisi di arricchimento della malattia dei geni hub eseguita con il database DisGeNET. (D) Modelli di espressione specifici per tessuto dei geni hub identificati tramite il database PaGenBase. (E) Rete regolatoria trascrizionale di geni hub analizzata utilizzando il database TRRUST. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

MCODE	VAI	Descrizione	Log10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	Recettori altamente permeabili al calcio per l'acetilcolina nicotinica	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	Recettori presinaptici dell'acetilcolina nicotinica	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	Recettori postsinaptici postsinaptici dell'acetilcolina altamente permeabili al calcio	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	Canali di potassio a dominio di pori tandem	-10.3
MCODE_2	VAI:0030322	Stabilizzazione del potenziale di membrana	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	Fase 4 - potenziale della membrana a riposo	-9.7

Tabella 1: Le caratteristiche di base dei pazienti con AP

MCODE	VAI	Descrizione	Log10(P)
MCODE_1	VAI:0030322	Recettori altamente permeabili al calcio per l'acetilcolina nicotinica	-19.9
MCODE_1	R-HSA-5576886	Recettori presinaptici dell'acetilcolina nicotinica	-19.6
MCODE_1	R-HSA-1296346	Recettori postsinaptici postsinaptici dell'acetilcolina altamente permeabili al calcio	-16.7

Tabella 2: L'analisi di arricchimento MCODE dei DEG.

MCODE	VAI	Descrizione	Log10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	Recettori altamente permeabili al calcio per l'acetilcolina nicotinica	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	Recettori presinaptici dell'acetilcolina nicotinica	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	Recettori postsinaptici postsinaptici dell'acetilcolina altamente permeabili al calcio	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	Canali di potassio a dominio di pori tandem	-10.3
MCODE_2	VAI:0030322	Stabilizzazione del potenziale di membrana	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	Fase 4 - potenziale della membrana a riposo	-9.7

Tabella 3: L'analisi di arricchimento MCODE del gene hub.

File Supplementare 1: Controllo (n=3) Espressione genica.Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Pazienti (n=10) gene della tabella centrale.Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Con il continuo approfondimento della ricerca sull'AP, nuove citochine vengono costantemente rilevate nell'AP, e l'infiammazione è diventata un fattore importante nella genesi e nello sviluppo^{dell'AS 21,22}. L'attivazione dell'albumina può interrompere il legame tra le cellule endoteliali e la matrice intima vascolare e favorire la stacazione delle cellule endoteliali dall'intima vascolare. Lesione intima vascolare^{indotta 23,24}. L'infiammazione induce la modifica ossidativa dell'LDL-C, e l'LDL-C modificato a sua volta porta al processo infiammatorio all'interno dell'intima dell'arteria, accelerando così la formazione^{di AP 25}. Le placche instabili possono eventualmente rompersi e causare ACS tramite cause interne ed^{esterne 26}. Durante la rottura della placca, macrofagi, cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) e linfociti secernono fattori infiammatori come interleucina-1 leucocitaria-1 (IL-1), IL-6, fattore di adesione intervascolare-1 e fattore di adesione intercellulare-1. Contemporaneamente, l'espressione dell'integrina leucocitaria (CD11b/CD18), un recettore su monociti e granulociti, è^{aumentata 27,28}. Tuttavia, il meccanismo molecolare dell'infiammazione che porta alla formazione dell'AP resta da approfondire.

L'occorrenza e lo sviluppo dell'AP causata dall'infiammazione sono un corso complesso di azione multifattoriale, cambiamento multigenico e malattia a più stadi, particolarmente strettamente correlato all'espressione anomala di molti geni. In questo studio, l'analisi di RNA-Seq e bioinformatica ha rivelato che, tra tessuti di controllo sani e AP, il grafico vulcanico dei DEG mostrava 2097 geni regolati all'alto e 1616 sottoregolati. Ulteriori analisi di arricchimento KEGG dei DEG hanno dimostrato che i DEG erano principalmente arricchiti nelle vie immunitarie e infiammatorie. L'analisi genica hub ha identificato i primi 10 geni hub, costituiti da CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 e CCR5. L'intersezione dei geni hub con i geni del pannello infiammatorio olink 92 ha rivelato 5 geni comuni, tra cui CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 e CCL4. Questi risultati suggeriscono che i fattori correlati all'infiammazione CCL3, CCL4 e CXCL1 possano svolgere un ruolo cruciale nel processo patologico dell'AP. L'analisi dell'infiltrazione immunitaria ha rivelato un microambiente distinto caratterizzato da un aumento significativo dei macrofagi M0 insieme a riduzioni delle cellule T CD8⁺, delle cellule NK attivate e dei mastociti a riposo all'interno delle placche.

I macrofagi M0 rappresentano un pool non impegnato che può facilmente interiorizzare LDL ossidato e differenziarsi in cellule schiumogenesi, un evento caratteristico nell'aterogenesi^{precoce 29}. La proporzione elevata di macrofagi M0 osservata nel gruppo patologico indica un accumulo di queste cellule precursori all'interno del microambiente della placca. CCL4, prodotto principalmente da macrofagi attivati e cellule T, funge da stimolo persistente che sostiene l'attivazione dei macrofagi tramite la via di segnalazione NFκB, promuove l'espressione delle molecole di adesione e induce la metalloproteinasi matriciale-2 e -9, facilitando così la transizione dei macrofagi M0 verso uno stato pro-aterogenico e compromettendo direttamente la stabilità della^{placca 30}. La proporzione ridotta di cellule T CD8⁺ può riflettere la soppressione mediata da CCL3 dei sottoinsiemi ateroprotettivi di cellule T. Komissarov et al. hanno dimostrato che la migrazione delle cellule T nelle placche aterosclerotiche umane avviene prevalentemente tramite l'asse CCR5-CCL3³¹. Inoltre, Döring et ^al.32 hanno scoperto una via non canonica per cui CCL17 segnala attraverso CCR8 per indurre l'espressione di CCL3, che a sua volta sopprime la differenziazione regolatoria delle cellule T; l'ablazione genetica di CCL3 nelle cellule T CD4⁺ ha aumentato i valori di FoxP3⁺ Treg e limitato l'aterosclerosi, mentre l'amministrazione di CCL3 ha aggravato la malattia e limitato la differenziazione Treg. Questo cambiamento probabilmente riduce le cellule T regolatorie CD8⁺ ateroprotettive, promuovendo al contempo le cellule T effettrici patogene, con conseguente diminuzione netta della proporzione di cellule T CD8⁺ osservata nella nostra analisi. Le riduzioni delle cellule NK attivate e dei mastociti a riposo probabilmente riflettono alterazioni nello stato di attivazione piuttosto che una perdita assoluta di queste popolazioni. Bonaccorsi et ^al.33 hanno riportato che le placche carotidii sintomatiche mostrano un aumento dell'infiltrazione delle cellule NK e della produzione di IFN-γ, collegando direttamente l'attivazione delle cellule NK all'instabilità clinica della placca. Per i mastocitici, Wezel et ^al.34 hanno dimostrato che le chemiocine rilasciate dai mastociti attivati, in particolare CXCL1, inducono il reclutamento di neutrofili tramite l'asse CXCL1/CXCR2, aggravando così la risposta infiammatoria in corso e favorendo la progressione e la destabilizzazione della placca. Pertanto, la diminuzione della proporzione di cellule NK attivate e di mastociti a riposo probabilmente riflette la loro attivazione, degranulazione o esaurimento all'interno del contesto della placca infiammatoria, piuttosto che una vera deplezione numerica.

Ci sono diverse limitazioni in questo studio. Innanzitutto, questo studio si basa esclusivamente sul sequenziamento del trascrivoma ed è limitato dalla piccola dimensione del campione. Oltre alla dimensione limitata del campione, vanno notate alcune limitazioni tecniche del protocollo RNA-seq. L'RNA-seq in blocco maschera l'eterogeneità cellulare; sono necessari approcci a singola cella per risolvere l'espressione specifica per tipo di cellula di CCL3, CCL4 e CXCL1. La deconvoluzione immunitaria computazionale (CIBERSORT) fornisce solo stime, non misurazioni dirette. L'abbondanza di RNA non sempre corrisponde ai livelli proteici; è richiesta una validazione ortogonale. Studi futuri dovrebbero affrontare queste limitazioni utilizzando la trascrittomica unicellulare, coorti più grandi e indipendenti, e la validazione delle proteine ortogonali.

In conclusione, i risultati presenti hanno sottolineato l'importante ruolo dei fattori infiammatori nel processo fisiopatologico dell'AP. Inoltre, abbiamo identificato i geni hub CCL3, CCL4 e CXCL1, che potrebbero formare una rete chemochine coordinata che alimenta l'aterosclerosi promuovendo l'accumulo di macrofagi M0, sopprimendo i sottoinsiemi protettivi delle cellule T e alterando gli stati di attivazione delle cellule NK e dei mastocitici. Nel complesso, questi risultati evidenziano le tre chemiocine come regolatori critici del microambiente immunitario della placca e potenziali bersagli terapeutici.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
TRIZOL	Invitrogen	15596026CN	Estrazione di RNA
Nanodrop ND-2000 spettrofotometro	Thermo Fisher Scientific	ND2000	Rilevamento della concentrazione di RNA
Bioanalizzatore Agilent 2100	Agilent	G2939BA	Controllo qualità dell'RNA
Illumina HiSeq TM 2000	Illumina	HiSeq 2000	Sequenziamento trascritomico
Sfere magnetiche Oligo D (T)	New England Biolabs	S1550S	Arricchimento dell'RNA