Method Article

Test di neutralizzazione della riduzione della fluorescenza del virus dell'epatite E per misurare i titoli neutralizzanti degli anticorpi

DOI:

10.3791/69892

⸱

May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Non esiste un saggio standard di neutralizzazione virale disponibile per il virus dell'epatite E (HEV), un virus a RNA a filamento positivo non citopatico. Qui, viene descritto un test di neutralizzazione della riduzione della fluorescenza (FRNT) basato sulla quantificazione della proteina capside virale marcata con fluorescente per valutare l'efficacia degli anticorpi anti-HEV.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il saggio di neutralizzazione del virus misura il potenziale di neutralizzazione di un anticorpo o di una miscela di anticorpi contro il virus corrispondente. È una tecnica preziosa per valutare l'efficacia dei candidati vaccini e degli anticorpi neutralizzanti sviluppati contro il virus. Il test di neutralizzazione della riduzione della placca (PRNT) è un metodo popolare per valutare il titolo degli anticorpi neutralizzanti specifici per il virus. Tuttavia, la PRNT non è fattibile nel caso di virus non citopatici. Il virus dell'epatite E (HEV) è un virus a RNA monofilamento a senso positivo, appartenente alla famiglia Hepeviridae. È una delle principali cause di epatite virale acuta a livello mondiale. Non mostra alcun effetto citopatico nella coltura cellulare di mammiferi. Un vaccino contro l'HEV è disponibile in Cina. Tuttavia, vaccini o anticorpi terapeutici contro l'HEV non sono disponibili nella maggior parte del mondo. Diversi laboratori stanno lavorando su candidati vaccini contro l'HEV. Un test di neutralizzazione per misurare l'efficacia dei vaccini contro l'HEV sarà uno strumento molto utile per i ricercatori. Qui descriviamo un test di neutralizzazione della riduzione della fluorescenza (FRNT) per stimare il 50% di neutralizzazione (NT50) degli anticorpi anti-HEV. Neutralizzato con ORF2 anti-HEV, o HEV neutralizzato con IgG per coniglio, è stato utilizzato per infettare le cellule Huh7, seguito dalla colorazione immunofluorescente della proteina virale ORF2. Le cellule fluorescenti positive sono state quantificate nell'applicazione ImageJ, mentre NT50 è stato stimato in 2,1 x 103. Questo metodo può essere applicato per stimare il NT50 degli anticorpi anti-HEV presenti nei serai di topi immunizzati, nei seroli individuali recuperati con HEV e negli anticorpi anti-HEV prodotti in laboratorio.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il virus dell'epatite E (HEV) è un virus a RNA monocatenante a senso positivo che appartiene alla famiglia Hepeviridae 1,2. Di solito causa epatite acuta auto-limitante, ma può causare epatite cronica nei individuiimmunodepressi 3,4. Le donne in gravidanza sono ad alto rischio di sviluppare insufficienza epatica fulminante, con un tasso di mortalità che aumenta fino al 30%. L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha riportato circa 19,47 milioni di casi di epatite acuta E (AHE) e 3450 decessi causati dall'HEV a livello globalenel 20216. L'HEV si trasmette nei paesi in via di sviluppo principalmente attraverso alimenti e acqua contaminati, a causa di scarse condizioni igienico-sanitarie, mentre infezioni occupazionali sporadice nei paesi sviluppati sono associate al consumo di carne cruda o pococotta 6. L'HEV è classificato in otto genotipi. Il genotipo (g) 1- e g2- HEV infetta esclusivamente solo gli esseri umani. g3- e g4-HEV hanno una vasta gamma di ospiti come umani, conigli, suini, cinghiali e cervi. g5- e g6-HEV infettano i cinghiali selvatici mentre g7- e g8-HEV infettano i cammelli. Un singolo caso di trasmissione umana di g7-HEV è stato segnalato in Medio Oriente attraverso il consumo di carne di cammello elatte 7,8. L'infezione da HEV è più comune nei paesi a basso e medio reddito. Sono stati segnalati diversi focolai trasmessi dall'acqua in regioni endemiche del Sud e Sud-est asiatico, Africa e Messico, principalmente causati da g1- e meno frequentemente da infezione da g2-HEV. I casi di infezione sporadica occupazionale nei paesi sviluppati d'Europa e dell'Asia orientale sono causati principalmente dal g3-HEV 6,7.

Il genoma HEV è un RNA a catena più filamento da 7,2 kb che contiene un cappuccio di 7-metilguanina all'estremità 5′, tre fotogrammi di lettura aperti (ORF) seguiti da un'estremità poli-adenilata a 3'. ORF1 codifica la poliproteina non strutturale, composta da sette domini distinti: metiltransferasi (Met), dominio Y, proteasi cisteina simile a Papain (PCP), dominio V, macrodominio (dominio X), elicase (Hel) e RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRp). ORF2 codifica la proteina capside, responsabile dell'assemblaggio del capside virale. ORF3 codifica una fosfoproteina che agisce come viroporina e aiuta nell'uscitavirale 9. Un ulteriore sistema di lettura aperto, ORF4, è presente nel g1-HEV, che viene tradotto tramite un meccanismo indipendente dal cappuccio, utilizzando un elemento interno simile al sito di ingresso del ribosoma situato all'interno dell'ORF1. L'espressione di ORF4 è potenziata da composti endoplasmatici che inducono stress nel reticolo. ORF4 è stato proposto per promuovere l'assemblaggio complessivo di replicazioneg1-HEV 10.

Sebbene l'HEV non si replichi efficacemente in vitro, alcuni ceppi del virus, isolati da pazienti con epatite E, sono stati propagati con successo in epatociti, linea cellulare polmonare e linea cellulare epitelialedel colon 11. Tuttavia, è difficile propagare il virus in modo robusto nelle cellule coltivate. Il clone infettivo di cDNA di g1-HEV (ceppo Sar55) è stato utilizzato per studi in vitro, ma finora non sono state raggiunte una produzione e propagazione efficiente di ceppi g1-HEV in cellule coltivate. Alcuni ceppi g3- e g4-HEV crescono meglio nelle cellulecoltivate 12. Tuttavia, il virus purificato ottenuto da cellule trasfettate con l'RNA genomico HEV in vitro trascritto e cappato-p6 non è sufficiente per molteplici analisi. Inoltre, tutte le particelle di HEV prodotte da colture cellulari sono quasi-avvolte, il che influisce sulla loro infettività. Al contrario, l'HEV presente in alimenti e acqua contaminati non è avvolto ed è altamente contagioso. L'HEV presente nelle feci dei pazienti è non avvolto ed è la fonte comune di infezione naturale. Pertanto, l'uso di HEV purificato dalle feci del paziente garantisce un'infezione efficiente nel sistema di coltura cellulare dei mammiferi. I nostri studi precedenti hanno dimostrato l'affidabilità del g1-HEV purificato dalle feci del paziente nel quantificare la replicazione virale nelle cellule di epatoma umano (Huh7). Il virus purificato immagazzinato a -80 °C mantiene l'infettività per diversi anni ed è stato utilizzato in numerosi studi indipendenti per stimare la replicazionevirale 10,13,14,15. Questo studio ha progettato un test di neutralizzazione HEV utilizzando un g1-HEV purificato ottenuto da un paziente. Il virus è stato purificato, titolato, caratterizzato e conservato in aliquote a -80 °C per un uso futuro in saghi di neutralizzazione. Poiché l'HEV non è citopatico, il metodo tradizionale PRNT non è utile per stimare il potenziale di neutralizzazione virale degli anticorpi anti-HEV. Ci sono stati diversi tentativi di sviluppare saggi di neutralizzazione per HEV, tra cui un saggio di neutralizzazione basato su citometria di flusso, un saggio di neutralizzazione ELISA su kit antigenico per rilevare pORF2 secreto nei supernanti cellulari, un saggio di legame in vitro basato su ELISA e un saggio di neutralizzazione basato su fluorescenza 16,17,18,19,20. Un saggio basato su ELISA rileva indirettamente il legame degli anticorpi per valutare la neutralizzazione funzionale del virus, ma non può misurare l'infezione reale. Il metodo basato su citometria a flusso misura solitamente la percentuale di cellule infette che utilizzano uno pseudovirus. Il metodo di neutralizzazione basato su RT-PCR è più complesso rispetto al FRNT; Pertanto, le probabilità di errore nella gestione sono maggiori. D'altra parte, il metodo FRNT descritto qui è limitato dalla disponibilità di virus infettivi ad alto titolo e dalle capacità di imaging. Tuttavia, è un metodo efficiente per misurare NT50 degli anticorpi anti-HEV.

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Protocol

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È stata ottenuta l'approvazione del comitato etico istituzionale (IEC) per prelevare un campione fecale da un paziente infetto da HEV ricoverato al Dipartimento di Gastroenterologia dell'AIIMS di Nuova Delhi. Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti partecipanti allo studio. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Isolamento e quantificazione del virus

  1. Con consenso informato, ottenere il campione fecale da un paziente infetto da HEV per la purificazione del virus.
  2. Risospendere il campione fecale nella soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco a concentrazione finale del 10% (p/v) e centrifugare a 7800 x g per 1 ora a 4 °C.
    NOTA: Usare guanti quando si maneggia il campione fecale di HEV e pulire l'area di lavoro con il 70% di etanolo dopo il lavoro (eseguire tutti i passaggi all'interno di un armadietto di biosicurezza).
  3. Raccogli il sovrantantante e passalo attraverso un filtro da 0,45 μm.
  4. Aggiungere l'8% di PEG6000 preparato in 0,4 M di NaCl al soprandanante virale e incubare per 16 ore a 0 °C.
  5. Centrifuga il campione a 18.000 x g per 30 minuti a 4 °C.
  6. Rimuovere il sovrantantante e risospendere il proiettile in 40 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
  7. Concentrare la sospensione a un volume di 5 mL tramite filtrazione a flusso tangenziale (TFF) utilizzando una cartuccia a membrana da 30 kDa. Filtralo attraverso un filtro da 0,2 μm all'interno dell'armadio di biosicurezza, fare aliquote e conservarlo a -80 °C. Usa una quota per isolare l'RNA totale ed eseguire la RT-qPCR.
  8. Utilizzare diluizioni multiple del plasmide pSK-HEV2 [vettore pBluscript contenente cDNA di un clone infettivo di g1-HEV (Genbank ID: AF444002.1)] (1 ng a 0,000001 ng DNA/reazione a diluizione seriale 10x) per tracciare uno standard per la quantificazione dell'RNA virale.
  9. Traccia il grafico con la quantità di DNA pSK-HEV2 sull'asse X e i corrispondenti valori Ct sull'asse Y. Estrapolare la concentrazione di RNA virale dal grafico standard.
  10. Quantificare il livello di RNA genomico HEV dal grafico standard e calcolare il numero di copie genomiche del virus usando la seguente formula: Numero di copie = ng*(numero/mole) / basi *(ng/g)*(g/mole di basi).

2. Infezione delle cellule Huh7 con g1-HEV

  1. Prendi una fiaschetta T75 contenente celle Huh7. Controlla al microscopio se le cellule sono confluenti e sane.
  2. Rimuovere il materiale tramite aspiratore (eseguire tutti i passaggi nell'armadietto di biosicurezza). Aggiungi 10 mL di DPBS, fai girare e rimuovi.
  3. Aggiungi 1 mL di soluzione di tripsina allo 0,05%, assicurandoti che venga distribuita uniformemente sulla superficie.
  4. Incubare all'interno di un incubatore di CO2 per 30–60 secondi, finché le cellule non sono staccate al 90%.
  5. Aggiungere 5 mL di mezzo completo, distribuire uniformemente tutta la superficie del T75 e pipettare più volte per ottenere una popolazione unicellulare uniforme, priva di aggregati.
  6. Trasferire la sospensione della cella su un tubo conico da 50 mL, centrifugare a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  7. Aspirare il mezzo di coltura dal tubo conico all'interno dell'armadietto di biosicurezza.
  8. Aggiungere 5 mL di mezzo intero al tubo e sospendere le celle in una sospensione uniforme tramite una pipetatura delicata.
  9. Prendi 10 μL di sospensione a celle e mettili su un contracarrello di cella. Contare le celle in 4 quadranti, calcolare la media/mL.
  10. Seme 0,5 x 106 cellule/pozzo di una piastra a 6 pozzi in 2 mL di DMEM (integrato con FBS al 10%).
  11. Il giorno successivo, rimuovere il substrato, lavare 1 mL di DPBS e aggiungere 50 μL del virus g1-HEV (equivalente a 4,5 × 10copie genomichedel g1-HEV purificato) in 1 mL di mezzo senza siero (SFM).
  12. Incubare le cellule in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C per 1 ora.
  13. Lavare le cellule con 500 μL di DPBS, poi aggiungere 2 mL di mezzo intero (DMEM integrato con FBS al 2%).
  14. Incubare le cellule per 72 ore in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C.
  15. Prosegui per i test a valle.

3. Test RT-qPCR

  1. Rimuovere il materiale di crescita dalla piastra a 6 pozzi (dal passo 2.15) e lavare le cellule con 1 mL di DPBS.
  2. Aggiungi 1 mL di reagente TRI direttamente sulla piastra a 6 pozzi per lisare le celle. Pipetta il lisato su e giù più volte, poi trasferisci in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
    NOTA: Il reagente TRI è tossico se inalato, ingerito o se entra in contatto con la pelle. Usa guanti protettivi mentre usi il reagente ed evita di respirare vapori. Preferibilmente, da usare all'interno del cappuccio chimico. Tutti i materiali in plastica dovrebbero essere di grado privo di RNAse.
  3. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 5 minuti. Aggiungere 0,2 mL di cloroformio, chiudere saldamente il tubo, poi formare un vortice per 10–15 secondi (il cloroformio è pericoloso e tossico; maneggiato con i DPI adeguati). Incubare per 2–3 minuti.
  4. Centrifugare i campioni per 15 minuti a 12.000 × g a 4 °C. Trasferire la fase acquosa in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungi 0,5 mL di isopropanolo alla fase acquosa e mescola bene invertendo il tubo più volte.
  5. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
  6. Centrifugare per 10 minuti a 12.000 × g a 4 °C. Scartate il soprannatante.
  7. Risospendere il pellet in 1 mL di etanolo al 75%. Centrifugare per 5 minuti a 7500 × g a 4 °C. Scartate il soprannatante.
  8. Asciuga la pellet di RNA all'aria per 5–10 minuti.
  9. Risospendere la pellet in acqua priva di nucleasi (NFW) da 50 μL, incubare a 55 °C per 10 minuti, mescolare con il colpo manuale e misurare la concentrazione di RNA tramite spettrofotometria.
  10. Esegui RT-qPCR in un solo passaggio basato su sonde TaqMan utilizzando i seguenti Primer:
    g1-HEV FP: 5′TATACTCGAGGGTGCCGATCGGTCCC3′;
    g1-HEV RP: 5′TATACCATGGCATCTGGCAGCAAGCTCAG3′;
    sonda g1-HEV: 5′[FAM] TTGACGCCTGGGAGCGAATCACC [BHQ1]3′; Ribonucleasi P (RP) FP: 5′AGATTTGGACCTGCGAGCG3′;
    RP RP: 5′GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3′;
    Sonda RP: 5′[FAM]TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG[BHQ1]3′.
  11. Calcola la quantificazione relativa dell'RNA g1-HEV utilizzando il metodo 2−ΔΔCT .

4. Saggio di immunofluorescenza (IFA)

  1. Dividere le celle Huh7 come descritto nei passaggi precedenti.
  2. Posizionare il copricapo di vetro di grado microscopico in una piastra a 12 pozzi e seminare 0,2 ×10 6 cellule/pozzo in un mezzo completo da 1 mL (DMEM integrato con FBS al 10%).
  3. Infettare le cellule con 1,8 × 10copie genomiche del g1-HEV purificato in 500 μL SFM. Incubare le cellule in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C per 1 ora.
  4. Lavare le celle tre volte con 500 μL di DPBS.
  5. Aggiungi 2 mL di supporto completo (DMEM integrato con il 2% di FBS).
  6. Incubare le cellule per 72 ore in incubatrice al 5% CO2 , 37 °C.
  7. Lavare le cellule tre volte con 500 μL di DPBS, incubando per 5 minuti a temperatura ambiente tra un lavaggio e l'altro.
  8. Aggiungere 500 μL di PFA al 4% (Paraformaldeide) alle cellule e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Il PFA al 4% è dannoso se inalato, provoca irritazione della pelle e degli occhi e può provocare una reazione allergica cutanea. Per sicurezza, indossa guanti protettivi e protezione per gli occhi mentre usi il reagente ed evita di respirare vapori.
  9. Lavare le cellule con 500 μL di DPBS, tre volte per 5 minuti ciascuna, e incubare in DPBS per 30 minuti.
  10. Aggiungere 250 μL di soluzione bloccante (5% Siero Normale di Capra, 0,5% BSA, 0,3% Triton X-100 in DPBS) alle cellule e incubare per 1 ora a temperatura ambiente (RT).
  11. Rimuovere la soluzione bloccante, lavare una volta con 500 μL DPBS e incubare le cellule con 250 μL di anticorpo primario (DPBS, 0,3% Triton X-100, 5% BSA, 0,5% Siero Normale di Capra, diluizione 1:500 di anticorpo anti-ORF2 o IgG di coniglio), durante la notte a 4 °C.
  12. Lavare le celle con 500 μL di DPBS tre volte per 5 minuti ciascuna.
  13. Incubare le cellule con anticorpi secondari (DPBS, 0,3% Triton X-100, 5% BSA, 0,5% Siero Normale di Capra, diluizione 1:1000 dell'anticorpo anti-coniglio Alexa fluor 594) per 1 ora a RT.
  14. Lava le celle tre volte con DPBS per 5 minuti ciascuna. Aggiungere 10 μL di reagente antifade Prolong gold con soluzione DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo) al vetrino di vetro. Montare le celle contenenti il copertino, con le celle rivolte verso la soluzione DAPI su vetri di vetro, evitando bolle d'aria.
  15. Sigilla la copertura con la vernice per unghie.
  16. Acquisire immagini fluorescenti in un microscopio confocale con un obiettivo 60x.
  17. Imposta il microscopio per la visualizzazione e l'acquisizione del segnale fluorescente.
  18. Per prima cosa, focalizza i nuclei nel vetrino corrispondente alle cellule mock (non infette) a un ingrandimento di 60x. Regolare la tensione di soglia e il laser in modo che non sia visibile alcun segnale di fluorescenza di fondo. Controlla il vetrino di controllo colorato con anticorpi (rabbit IgG) e verifica che non sia visibile alcun segnale di fluorescenza di fondo.
  19. Visualizza vetrine di cellule infette da HEV senza alterare i parametri sopra indicati. Acquisire immagini in 1028 x 1028 pixel.

5. Test di neutralizzazione della riduzione della fluorescenza (FRNT)

  1. Neutralizzazione virale e infezione delle cellule Huh7
    1. Dividere le celle Huh7 come descritto nei passaggi precedenti. Posizionare il coperchio in una piastra a 12 pozzi e seminare 0,2 × 106 cellule/pozzo in un mezzo completo da 1 mL (DMEM + 10% FBS).
    2. Il giorno successivo, preparare una diluizione seriale di anticorpi a 10 volte (anti-ORF2 e IgG coniglio) in SFM con una concentrazione iniziale di anticorpo di 25 μg/mL in passi 1:10 fino a diluizione 1:10 5. Il volume finale della diluizione dovrebbe essere di 100 μL.
    3. Aggiungere 1,8 x 10 copiegenomiche equivalenti al g1-HEV purificato a ciascuna diluizione di anticorpi.
    4. Incubare la miscela di anticorpi e virus in incubatore al 5% di CO2 , 37 °C per 1 ora.
    5. Rimuovere la piastra a 12 pozzetti contenente le celle Huh7 (seminate il giorno precedente) e lavare le celle con 500 μL DPBS.
    6. Aggiungere la miscela anticorpi-virus alle cellule e posizionare la piastra in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C per 1 ora.
    7. Lava le celle con 500 μL DPBS.
    8. Aggiungere DMEM + 2% di substrati FBS alle cellule e incubare la piastra in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C per 72 ore.
    9. Esegui l'IFA come menzionato nella sezione 4 (dal passo 4.7 in su).
    10. Acquisire immagini fluorescenti di 5 campi casuali usando un obiettivo 10x in 1028 x 1028 pixel.
    11. Salva le immagini in formato JPEG/TIFF. Quantificare le macchie fluorescenti utilizzando l'analisi ImageJ come descritto di seguito.
    12. Per analizzare l'immagine in ImageJ, converti l'immagine RGB in un'immagine a 8 bit. Clicca sull'immagine > digita > 8-bit.
    13. Regola la soglia dell'immagine. Clicca su immagine > Regola > soglia. Seleziona il livello di soglia inferiore a 40 e quello superiore a 255.
    14. Per il conteggio, seleziona Analizza> Analizza le particelle. Seleziona i risultati di visualizzazione, cancella i risultati, riassumi, escludi ai bordi e ROI compositi. Deseleziona Aggiungi al manager, includi buchi e sovrapposizione. Premi Ok e apparirà il conteggio dei punti fluorescenti.
  2. Stima di NT50
    1. Calcola la percentuale di neutralizzazione di ogni diluizione usando la seguente formula:
      % Neutralizzazione= 100-[((cellule ORF2-positive in diluizione)⁄(ORF2-positive nel controllo del virus)) X 100]
    2. Calcola NT50 usando la seguente formula:
      log10(NT50) = log10D1+(50-N1 ⁄ N2-N1) X (log10D2-log10D1)
      Dove D1 = Diluizione a cui % di neutralizzazione è inferiore al 50
      D2 = Diluizione in cui % la neutralizzazione è superiore a 50
      N1= % Neutralizzazione sotto 50
      N2= % Neutralizzazione sopra 50
    3. Calcola l'antilog di Log10 NT50 usando la formula:
      NT50= 10log10(NT50)
    4. Traccia il grafico della (media±SD) di tutti i campi.

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Results

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Infezione delle cellule Huh7 con g1-HEV e caratterizzazione virale

Il g1-HEV è stato isolato da un campione fecale utilizzando una serie di passaggi, come illustrato (Figura 1A). Il numero di copie del genoma del g1-HEV purificato è stato stimato tramite RT-qPCR, seguito dallo stoccaggio a -80 °C. Per confermare l'infezione e la replicazione virale, le cellule Huh7 sono state infettate con 1,8 × 10copie geno...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRNT è un metodo basato su immunocolorazione per stimare il potenziale neutralizzante degli anticorpi. È stato utilizzato per stimare valori NT50 per anticorpi contro più virus, tra cui il virus della dengue (DENV), il Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) e il virus dell'encefalite giapponese (JEV)23,24,25. In questo metodo, il virus viene incubato con un anticorpo di prova (o siero), seguito d...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa ricerca è stata parzialmente finanziata da una sovvenzione del Biotechnology Industry Research Assistance Council, Dipartimento di Biotecnologia del Governo dell'India, assegnata a MS, S e BN. La ricerca nel laboratorio della SM è sostenuta da un fondo di soccorso del Translational Health Science and Technology Institute. SA è sostenuto da una posizione di Project Research Scientist finanziata dall'Indian Council of Medical Research, Governo dell'India. UB è sostenuta da una Senior Research Fellowship del Dipartimento di Biotecnologia del Governo dell'India.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microfuge tubesAxygenMCT-150-C
12-well cell culture dishCorning3512
37 degree incubator shakerThermo Scientific50163013
4′,6-diamidino-2-phenylindoleAbcamAB104139DAPI
50mL centrifuge tubeFalcon352070
6-well cell culture dishCorning3516
Alexa flour 594 secondary IgG AntibodyThermo ScientificA-11012
Anti-ORF2 antibodyGenscriptNACustom synthesized by Genscript and characterized in our laboratory14
Anti-rabbit IgG antibodyGenscriptNA
Bovine Serum AlbuminHIMEDIAMB083BSA
Confocal microscopeOlympusFV3000
DMEM, high glucoseHIMEDIAAL007A
Fetal Bovine SerumGIBCO16000-044FBS
ImageJ 1.54gImageJ.org (Wayne Rasband and contributors, NIH, USA)
Normal Goat SerumHIMEDIARM-10701
ParaformaldehydeHIMEDIAGRN3660PFA
Phosphate Buffer Saline pH 7.4HIMEDIATL1006PBS
Polyethyleneglycol 6000SIGMA81255PEG6000
SOLIScript 1-step Probe KitSOLIS BIODYNE08-57-00250
TRI reagentMolecular Research CentreTR118
Triton X100SIGMAX100
Trypsin-EDTAGIBCO25300-54

References

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