Test di neutralizzazione della riduzione della fluorescenza del virus dell'epatite E per misurare i titoli neutralizzanti degli anticorpi

Summary

Non esiste un saggio standard di neutralizzazione virale disponibile per il virus dell'epatite E (HEV), un virus a RNA a filamento positivo non citopatico. Qui, viene descritto un test di neutralizzazione della riduzione della fluorescenza (FRNT) basato sulla quantificazione della proteina capside virale marcata con fluorescente per valutare l'efficacia degli anticorpi anti-HEV.

Abstract

Il saggio di neutralizzazione del virus misura il potenziale di neutralizzazione di un anticorpo o di una miscela di anticorpi contro il virus corrispondente. È una tecnica preziosa per valutare l'efficacia dei candidati vaccini e degli anticorpi neutralizzanti sviluppati contro il virus. Il test di neutralizzazione della riduzione della placca (PRNT) è un metodo popolare per valutare il titolo degli anticorpi neutralizzanti specifici per il virus. Tuttavia, la PRNT non è fattibile nel caso di virus non citopatici. Il virus dell'epatite E (HEV) è un virus a RNA monofilamento a senso positivo, appartenente alla famiglia Hepeviridae. È una delle principali cause di epatite virale acuta a livello mondiale. Non mostra alcun effetto citopatico nella coltura cellulare di mammiferi. Un vaccino contro l'HEV è disponibile in Cina. Tuttavia, vaccini o anticorpi terapeutici contro l'HEV non sono disponibili nella maggior parte del mondo. Diversi laboratori stanno lavorando su candidati vaccini contro l'HEV. Un test di neutralizzazione per misurare l'efficacia dei vaccini contro l'HEV sarà uno strumento molto utile per i ricercatori. Qui descriviamo un test di neutralizzazione della riduzione della fluorescenza (FRNT) per stimare il 50% di neutralizzazione (NT₅₀) degli anticorpi anti-HEV. Neutralizzato con ORF2 anti-HEV, o HEV neutralizzato con IgG per coniglio, è stato utilizzato per infettare le cellule Huh7, seguito dalla colorazione immunofluorescente della proteina virale ORF2. Le cellule fluorescenti positive sono state quantificate nell'applicazione ImageJ, mentre NT₅₀ è stato stimato in 2,1 x 10³. Questo metodo può essere applicato per stimare il NT₅₀ degli anticorpi anti-HEV presenti nei serai di topi immunizzati, nei seroli individuali recuperati con HEV e negli anticorpi anti-HEV prodotti in laboratorio.

Introduction

Il virus dell'epatite E (HEV) è un virus a RNA monocatenante a senso positivo che appartiene alla famiglia Hepeviridae ^1,2. Di solito causa epatite acuta auto-limitante, ma può causare epatite cronica nei individui^{immunodepressi 3,4}. Le donne in gravidanza sono ad alto rischio di sviluppare insufficienza epatica fulminante, con un tasso di mortalità che aumenta fino al 30^%. L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha riportato circa 19,47 milioni di casi di epatite acuta E (AHE) e 3....

Protocol

È stata ottenuta l'approvazione del comitato etico istituzionale (IEC) per prelevare un campione fecale da un paziente infetto da HEV ricoverato al Dipartimento di Gastroenterologia dell'AIIMS di Nuova Delhi. Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti partecipanti allo studio. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Isolamento e quantificazione del virus

1. Con consenso informato, ottenere il campione fecale da un paziente infetto da HEV per la purificazione del virus.
2. Risospendere il ....

Results

Infezione delle cellule Huh7 con g1-HEV e caratterizzazione virale

Il g1-HEV è stato isolato da un campione fecale utilizzando una serie di passaggi, come illustrato (Figura 1A). Il numero di copie del genoma del g1-HEV purificato è stato stimato tramite RT-qPCR, seguito dallo stoccaggio a -80 °C. Per confermare l'infezione e la replicazione virale, le cellule Huh7 sono state infettate con 1,8 × 10^{copie geno.......}

Discussion

FRNT è un metodo basato su immunocolorazione per stimare il potenziale neutralizzante degli anticorpi. È stato utilizzato per stimare valori NT₅₀ per anticorpi contro più virus, tra cui il virus della dengue (DENV), il Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) e il virus dell'encefalite giapponese (JEV⁾23,24,25. In questo metodo, il virus viene incubato con un anticorpo di prova (o siero), seguito d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubi microfuge da 1,5 mL	Assigeno	MCT-150-C
Piatto di coltura cellulare a 12 pozzi	Corning	3512
Shaker incubatore a 37 gradi	Thermo Scientific	50163013
4′,6-diamidino-2-fenilindolo	Abcam	AB104139	DAPI
Tubo centrifugo da 50 mL	Falcon	352070
Piatto di coltura cellulare a 6 pozzi	Corning	3516
Anticorpo IgG secondario Alexa farina 594	Thermo Scientific	A-11012
Anticorpi anti-ORF2	Genscript	NA	Sintetizzato su misura da Genscript e caratterizzato nel nostro laboratorio14
Anticorpo IgG anti-coniglio	Genscript	NA
Albumina Sirica Bovina	HIMEDIA	MB083	BSA
Microscopio confocale	Olympus	FV3000
DMEM, glucosio alto	HIMEDIA	AL007A
Siero bovino fetale	GIBCO	16000-044	FBS
ImageJ 1.54g	ImageJ.org (Wayne Rasband e collaboratori, NIH, USA)
Siero normale per capre	HIMEDIA	RM-10701
Paraformaldeide	HIMEDIA	GRN3660	PFA
Fosfato tamponamento salino pH 7,4	HIMEDIA	TL1006	PBS
Polietilenico 6000	SIGMA	81255	PEG6000
Kit di sonda a 1 passo SOLIScript	SOLIS BIODYNE	08-57-00250
Reagente TRI	Centro di Ricerca Molecolare	TR118
Triton X100	SIGMA	X100
Tripsina-EDTA	GIBCO	25300-54