Articolo metodologico

Progettazione e standardizzazione di un modello di lesione mandibolare per lo studio della rigenerazione del tessuto craniofacciale nel modello Ambystoma mexicanum

DOI:

10.3791/69895

⸱

24 aprile 2026

 , 
1Departamento de Estudios Básicos Integrados, Facultad de Odontología, Universidad de Antioquia, 2Grupo Genética, Regeneración y Cáncer, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Antioquia, 3Instituto de Biología, Universidad de Antioquia

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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L'obiettivo di questo studio era standardizzare un approccio chirurgico sicuro e riproducibile per eseguire un'amputazione trasversale completa della mandibola in Ambystoma mexicanum per lo studio della rigenerazione dei tessuti craniofacciali.

Abstract

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Il complesso craniofacciale è una regione anatomica che, negli esseri umani, può essere influenzata da malformazioni dello sviluppo, traumi e patologie come il cancro, portando alla perdita dei tessuti interessati. Questo crea la necessità di cercare strategie per rigenerare questi tessuti persi. Ciò ha promosso lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari che orchestrano la risposta rigenerativa delle strutture craniofacciali lesionate nelle specie in rigenerazione, con Ambystoma mexicanum (A. mexicanum) come specie di grande interesse.

In conformità con quanto sopra, è stato progettato e standardizzato un modello chirurgico riproducibile di lesioni nella mascella degli axolotl per studiare la risposta rigenerativa dei tessuti lesionati e simulare un difetto critico come quelli eseguiti negli esseri umani. Così, animali giovani/adulti tra 12 e 15 cm sono stati anestetizzati con tricaina allo 0,1% per 20-30 minuti. Successivamente, è stata eseguita un'amputazione trasversale completa utilizzando una tecnica a quattro mani sul terzo distale della mandibola, inclusi la regione simfisaria e parasimfisaria, rimuovendo strutture scheletriche corrispondenti all'osso dentario e alla cartilagine di Meckel, nonché tessuti molli come muscoli, tessuto connettivo, nervi e pelle. Successivamente, i residui ossei sono stati regolarizzati e applicato lo 0,5% di sulfamazina. La risposta tissutale è stata valutata sia macroscopicamente che tramite diafanizzazione. Tutte le procedure eseguite sono state approvate dal comitato di sperimentazione animale dell'Università di Antioquia, Colombia. I risultati mostrano che gli animali amputati sono stati in grado di rigenerare le strutture craniofacciali rimosse morfologicamente, strutturalmente e funzionalmente.

Di grande rilevanza, questo lavoro fornisce una tecnica chirurgica riproducibile con la sopravvivenza del 100% di animali amputati e riamputati quando era necessaria la raccolta di tessuti rigeneranti. Pertanto, questo disegno chirurgico rappresenta un input di base per condurre analisi comparative con altri vertebrati capaci di rigenerare le strutture craniofacciali e per studiare in futuro i meccanismi cellulari e molecolari alla base di questa risposta rigenerativa.

Introduzione

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La capacità di rigenerare tessuti, organi e strutture complesse è stata ampiamente descritta in tutto il regno animale 1,2,3. Pertanto, l'interesse nel comprendere come queste specie possano attivare e regolare la risposta rigenerativa dopo lesioni o amputazioni di varie strutture all'interno delle appendici, come arti e code, è stato al centro dell'attenzione nello studio della biologia dellarigenerazione 4,5,6,7,8.

Di grande rilevanza per questo lavoro, lo studio della rigenerazione del tessuto craniofacciale è stato anche un ambito di grande interesse a livello mondiale, dato che questa regione anatomica è fortemente influenzata da traumi facciali, disturbi dello sviluppo craniofacciale, malattie infettive e patologie tumorali, incluso il cancroorale 9. In presenza di tumori, è necessaria l'escissione di strutture o ampie aree di tessuto, sia nelle mascelle che in altre regioni facciali, il che genera quindi la necessità di ricostruire e promuovere la riparazione dell'areainteressata 10,11,12. Di conseguenza, negli ultimi decenni, lo studio della rigenerazione dei tessuti craniofacciali è cresciuto, dato la necessità di esplorare e identificare i meccanismi cellulari e molecolari che possono potenziare la risposta rigenerativa di questi tessuti in specie con bassa capacità rigenerativa, comegli esseri umani 13,14. Ciò ha portato all'uso di modelli animali con la capacità di rigenerare strutture craniofacciali, come la mascella, per esplorare e chiarire i meccanismi coinvolti nella risposta rigenerativa dopo la creazione di piccole lesioni o difetti critici sullamandibola 15.

Studi precedenti sull'amputazione mandibolare hanno evidenziato la progettazione di vari tipi di approcci chirurgici che mettono alla prova la capacità di diverse specie di rigenerare questastruttura 16. Nel caso del pesce zebra, amputazioni trasversali nel terzo distale della mascella e gli approcci laterali della mandibola hanno rivelato una risposta rigenerativa in cui il segmento amputato viene ripristinato morfologicamente eistologicamente 17,18. D'altra parte, studi pionieristici sugli anfibi, come Notophthalmus viridescens, hanno dimostrato che dopo l'amputazione trasversa della mandibola, che include strutture come la lingua e l'apparato faringeo nel piano di amputazione, i tessuti persi, inclusi l'osso dentario, il tessuto muscolare e i denti, possono rigenerarsi. Tuttavia, la struttura linguale e l'apparato faringeo non possono essererigenerati 19,20. Tuttavia, quando la lingua e l'apparato faringeo non sono inclusi nel piano di amputazione in questa stessa specie, tutti i tessuti rigenerati riproducono la forma e la struttura dei tessutiamputati 21,22. Inoltre, le amputazioni trasversali nella specie Cynops pyrrhogaster che non includono la lingua nel piano di amputazione mostrano una risposta rigenerativa delle strutture mandibolariamputate 23. Altri studi mostrano che amputazioni trasversali complete nel terzo prossimale della mandibola e le ricessioni laterali della mandibola in specie come Ambystoma maculatum, Desmognathus fuscus, Plethodon cinereus, Eurycea bislineata e Ambystoma opacum promuovono una risposta rigenerativa nel tessutolesionato 24,25. Ciò dimostra che negli anfibi il successo della risposta rigenerativa può variare a seconda del design e dell'estensione dei tessuti coinvolti nel piano di amputazione.

D'altra parte, una delle specie modello tra gli anfibi utilizzata come riferimento per studiare i meccanismi alla base della risposta rigenerativa è l'anfibio urodele A. mexicanum 26,27. Rapporti precedenti hanno dimostrato che si tratta di un modello eccezionale in grado di rigenerare le strutture craniofacciali, inclusi i tessuti molli del pavimento della bocca, l'osso dentario, la cartilagine di Meckel e le strutture muscolari edentali 28,29,30,31. Questi riscontri sono stati derivati da vari approcci chirurgici, tra cui lesioni da punzo al pavimento della bocca, dentectomia dei denti insieme a una porzione dell'osso dentario, e un approccio più ampio caratterizzato dall'amputazione laterale di una porzione dellamandibola 28,29,30,31. Tuttavia, finora non è stato descritto alcun approccio chirurgico trasverso completo che crei un difetto critico, includendo contemporaneamente la regione distale degli emimandiboli sinistro e destro, così come l'osso dentario, la cartilagine di Meckel, la simfisi mandibolare completa e i tessuti dentali e muscolari bilateralmente.

Pertanto, questo articolo descrive il processo passo dopo passo per eseguire un'amputazione trasversale completa della mascella di A. mexicanum, che consente di monitorare la risposta rigenerativa dei tessuti amputati con un tasso di vitalità del 100% negli animali sopraffatti. Inoltre, data la mancanza di dettagli su come eseguire questo tipo di amputazione, questa guida chirurgica mira a garantire la riproducibilità di questo tipo di approccio chirurgico per qualsiasi ricercatore che intenda effettuare analisi comparative a livello morfologico, tissutale, cellulare e molecolare in questa e in altre specie esposte a questo stesso tipo di approccio chirurgico, così come in altri approcci, inclusa l'amputazione laterale della mandibola. In definitiva, questo lavoro fornisce una base per identificare future molecole che promuovono la risposta rigenerativa di queste strutture, con potenziali applicazioni nella medicina rigenerativa dei tessuti craniofacciali.

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Protocollo

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L'organismo modello utilizzato in questo progetto è stata la salamandra A. mexicanum, endemica di Xochimilco, Messico. Questa colonia di animali è stata legalmente istituita nel 2014 con l'importazione di salamandre genitori dall'Ambystoma Genetic Stock Center dell'Università del Kentucky, e attualmente conta 32 genitori e oltre 200 animali giovani. Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dell'Università di Antioquia (UdeA) ai sensi della Legge n. 151 del 27 marzo 2023, tenendo conto degli standard etici nazionali e internazionali nella sperimentazione animale, come il Capitolo VI della Legge 84 del 1989 e il Titolo V della Risoluzione 8430 del 1993 del Ministero della Salute della Colombia32,33.

1. Gestione degli animali

NOTA: Animali di circa 12-15 cm di lunghezza con fenotipo selvatico sono stati utilizzati per standardizzare questo protocollo. Tuttavia, non sono esclusi animali più piccoli e con altri fenotipi.

  1. Seleziona gli axolotl di circa 12-15 cm di lunghezza (dal muso alla coda).
  2. Posiziona gli axolotl singolarmente in un contenitore abbastanza grande da permettere loro di muoversi facilmente, idealmente trasparente e rettangolare.
  3. Mantenere gli animali a una temperatura compresa tra 19 °C e 21 °C nella soluzione di Holtfreter al 20% prima della procedura e dei cicli chiaro-oscuro (12:12).
    NOTA: Quando possibile, evitare di sovranutrire gli animali 24 ore prima dell'intervento. Questo serve a prevenire episodi di vomito.

2. Amputazione trasversale completa nel terzo distale della mandibola

  1. Preparazione dell'anestesia e pre-operatoria per animali
    1. Prepara una soluzione anestetica di metanesulfonato tricaina allo 0,1%: miscela 1 g di tricaina metanasolonato, 100 μL di 1 M di etilenediaminaminatetraacetico (EDTA), pH 7,5, 50 μL di 0,5% fenolo rosso, e prepara fino a 1 L con soluzione di Holtfreter al 40%. Regola il pH a 7,5 con NaOH.
    2. Prepara tutti gli strumenti microchirurgici sterili (forbici, forzep, pinzette, spatola 7A, tubi da 1,5 mL, dentimetro, pipetta Pasteur, piastra di Petri e un vassoio di plastica da posizionare successivamente sull'animale da operare).
    3. Pulisci l'area di lavoro con alcol antisettico al 70%, regola e posiziona la luce diretta sul campo chirurgico in modo appropriato.
  2. Anestesia
    1. Mettere l'axolotl in un contenitore con circa 500 mL di soluzione anestetica tricaina metanesulfonato allo 0,1% per 20-30 minuti per garantire un'anestesia profonda.
      NOTA: Assicurarsi che l'animale sia completamente immerso nella soluzione anestetica.
    2. Controlla la presenza di segni di anestesia generale verificando l'assenza totale di movimenti branchiali e la risposta agli stimoli tattili.
      NOTA: Per monitorare la rigenerazione mascellare, una volta che l'animale è stato anestetizzato, si effettuano fotografie preoperatorie utilizzando lo stereomicroscopio, seguendo i passaggi della sezione 4.
  3. Amputazione trasversale completa della mascella
    NOTA: L'amputazione dovrebbe essere eseguita con la massima attenzione e rapidità possibile utilizzando una tecnica a quattro mani, cioè due chirurghi.
    1. Posiziona con attenzione l'animale in posizione supina (a faccia in su) sul vassoio di plastica.
    2. Misurare la regione da amputare con un calímetro (metro dentale endodontico) dal bordo esterno della mascella verso l'estremità prossimale di questa struttura, circa 2,5 mm nella regione mento/simfisi (Figura 1A).
      NOTA: La misurazione con un calibro viene eseguita sulla pelle dell'animale (extraorale).
    3. Segna con una matita di cera rossa per identificare la traiettoria del piano di amputazione e l'entità del difetto chirurgico.
    4. Solleva con cura l'axolotl e tienilo saldamente con una mano in modo che l'animale non scivoli dalla presa dell'operatore.
      NOTA: Questa azione deve essere eseguita da uno degli operatori (operatore 1), mentre l'altro operatore (operatore 2) sarà responsabile della gestione degli strumenti chirurgici e dell'incisione.
    5. Posizionare una luce diretta sopra la regione della testa dell'axolotl, in particolare sulla regione anatomica da operare.
    6. Con l'altra mano, usa il lato arrotondato e più largo di una spatola 7A per separare la lingua dal pavimento della bocca e dalla zona della mandibola da operare. (Figura 1B).
      NOTA: Assicurati che la lingua sia leggermente sovrapposta alla mascella superiore.
    7. Per prima cosa, eseguire (operatore 2) un taglio iniziale con la pinza chirurgica, dal bordo esterno della mascella sopra la pelle e i tessuti duri (osso del dente e cartilagine di Meckel) (Figura 1C).
      NOTA: Assicurarsi che gli strumenti siano adeguatamente affilati per un maggiore controllo durante il taglio e la manipolazione dei tessuti.
    8. Continuare il taglio trasversale con forbici chirurgiche sottili in modo che l'incisione attraversi tutta la larghezza della mascella dal sito del primo taglio fino al lato controlaterale fino a quando il tessuto distale della mascella non sarà completamente rimosso, seguendo il piano di amputazione pianificato (amputazione trasversale completa) (Figura 1D).
      NOTA: Nel caso di assolotli più grandi con mascelle più robuste, si raccomanda di completare il piano di taglio con una pinza per un taglio più pulito e meno traumatico delle strutture scheletriche (Figura 1E).
    9. Osserva la retrazione immediata dei tessuti molli rimanenti (Figura 1F).
    10. Raccogliere il tessuto amputato con le pinze dissezionanti e immergerlo in un tubo da 1,5 mL con la soluzione desiderata secondo la procedura da eseguire: paraformaldeide al 4% (PFA) per la fissazione e la successiva istotecnologia o immunofluorescenza, oppure in Trizol o RNA successivamente per l'estrazione di RNA, DNA o proteine, tra le altre tecniche (Figura 1F).
      NOTA: Questo tessuto può essere utilizzato come controllo non rigenerante per il confronto con tessuto rigenerato da una prospettiva istologica, per l'espressione genica basale o per la rilevazione di marcatori della differenziazione finale del tessuto.
    11. Posizionare l'axolotl in una piastra di Petri, osservare al microscopio stereoscopico e rimodellare i bordi esposti dell'osso e del tessuto cartilagineo con la pinza.
    12. Rimettere con cura l'axolotl nel vassoio di plastica e applicare bagni antibiotici con sulfamerazina allo 0,5% per 12 ore.

3. Recupero postoperatorio di A. mexicanum

  1. Dopo l'intervento, si colloca l'axolotl nel contenitore trasparente di plastica con soluzione di Holtfreter al 40% e osserva i segni di recupero dall'anestesia generale, come movimenti branchiali, riflesso di raddrizzamento o risposta a stimoli tattili. Il recupero completo richiede circa 30-60 minuti.
    NOTA: Mantenere la soluzione di Holtfreter al 40% fredda, a una temperatura compresa tra circa 4 °C e 8 °C.
  2. Cambia la soluzione fredda al 40% di Holtfreter ogni 24 ore per almeno 8 giorni.
    NOTA: Le prime 48 ore sono le più critiche per il recupero dell'animale, quindi deve essere sotto osservazione quotidiana.
  3. Dopo 24-48 ore dalla procedura, dai all'axolotl cibo morbido che è più facile da catturare e meno traumatico per l'animale.
    NOTA: Non nutrire l'axolotl per le prime 24 ore dopo l'intervento chirurgico.

4. Acquisizione di immagini e monitoraggio della risposta rigenerativa

NOTA: Tutte le immagini devono essere scattate il più rapidamente possibile per evitare una maneggiatura prolungata dell'animale recentemente operato.

  1. Una volta che l'animale è completamente anestetizzato, prendilo con cura e portalo al microscopio stereoscopico e alla fotocamera digitale in una piastra di Petri per acquisire immagini pre- e post-amputazione.
    NOTA: Pulire e disinfettare lo stereomicroscopio con alcol al 70% in anticipo.
  2. Usa una luce incidente che punti sulla testa dell'axolotl per osservare meglio l'area della mascella.
  3. Tieni saldamente il corpo dell'axolotl con una mano per evitare che scivoli fuori dal campo di acquisizione dell'immagine.
    NOTA: Evitare di scattare foto in un mezzo acquoso per evitare distorsioni della dimensione reale; usare una piastra di Petri senza liquido. Inumidire leggermente l'axolotl occasionalmente con la soluzione di Holtfreter al 40%.
  4. Identifica correttamente l'area della mandibola e concentrati su di essa in modo appropriato.
    NOTA: Nei giorni successivi (follow-up) alla procedura, tieni presente la necessità di una corretta concentrazione, poiché la rigenerazione dei tessuti nelle fasi iniziali è spesso molto sottile e, in alcuni casi, impercettibile.
  5. Ottimizza i parametri per l'acquisizione dell'immagine regolando gli strumenti del programma (contrasto, luminosità, esposizione, guadagno, bilanciamento del bianco, ecc.).
  6. Acquisire immagini utilizzando uno stereomicroscopio (0,7x) per prendere misurazioni e monitorare la rigenerazione della struttura.
  7. Una volta completato il periodo di rigenerazione, i tessuti rigenerati sono stati colorati con blu alciano e rosso alizarino secondo il protocollo34 precedentemente riportato.

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Risultati

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Considerando l'importanza e la rilevanza dello studio della potenziale risposta rigenerativa post-amputazione delle strutture craniofacciali in specie come A. mexicanum29, è necessario disporre di una tecnica chirurgica sicura e riproducibile che permetta non solo la valutazione della risposta rigenerativa dei tessuti, ma offra anche un tasso di mortalità basso o nullo negli animali sottoposti a intervento chirurgico. Di conseguenza, questo studio present...

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Discussione

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Questo articolo presenta l'approccio chirurgico di successo per l'amputazione trasversa completa della mandibola nel modello animale di A. mexicanum , insieme a diverse raccomandazioni necessarie per riprodurre questo modello chirurgico al fine di monitorare la risposta rigenerativa di queste strutture e per l'identificazione potenziale di fattori che regolano questo processo rigenerativo.

In questo studio, è stata eseguita un'amputazione trasversale ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Vogliamo ringraziare il Vicerettore per la Ricerca dell'Università di Antioquia per le risorse fornite dal fondo per il primo progetto per insegnanti affiliati. Vogliamo ringraziare il Sistema General de Regalias de Colombia e la 15ª Chiamata di Borse di Studio dell'Università di Antioquia per il finanziamento del master di Samanta Tarquino. Infine, vorremmo anche ringraziare ciascuno degli studenti che partecipano alla cura della colonia di assolotti nel nostro laboratorio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Axolotl (Ambystoma mexicanum)Ambystoma Genetic Stock CenterN/A15-18 cm e 16 g - 22 g wildetype
Calcium Chloride dihydrateDuksan1098CaCl2 2H2O
Digital camera MotiCAM 5MotiCAM https://www.motic.com/upload/File/201407/2014071115335993.pdf
EDTA - Sodium salt, dihydrateBiobasicEB0185C10H14N2O8Na2 . H2O
Glass petri dishany makerN/AVetro borosilicato
Magnesium Sulfate 7-hydrateITW Reagents131404.1211MgSO4 7H2O
Microsurgical instrumentsN/AN/APinze, pinza, spatola 7A, dentimetro e forbici
Pasteur pipetteany makerN/APolietilene a bassa densità
Potassium ChlorideDuksan372KCl
Red wax pencilany makerN/A
Sodium ChlorideMerkK48297604 717NaCl
Software Motic Images Plus-Versión 2.0Motic https://www.motic.com/As_Support_Download/d42.html
Stereo microscopeOlympus SZX16 N/A
Sulfamerazine sodium saltSigma- AldrichS08004-Amino-N-(4-metil-2-pirimidinile) benzenesulfonamide
Tricaine methanesulfonateSigma- AldrichE10521Etil 3-aminobenzoato metanosulfonato
Tubes 1.5 mLAxygenMCT150CPolipropilene puro

Riferimenti

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