Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento, la purificazione e la coltura delle cellule marginali primarie dalla stria vascolare del muro, e per stabilire modelli in vitro di stress ossidativo e senescenza cellulare allo scopo di studiare i disturbi della parete laterale cocleare.
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Articolo metodologico
Isolamento e coltura delle cellule marginali primarie della stria vascolare da topi neonatali
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La stria vascolare è una struttura chiave nell'orecchio interno responsabile della generazione e del mantenimento del potenziale endococleare (EP), e la sua disfunzione è strettamente associata a varie forme di perdita uditiva. La stria vascolare è composta da cellule marginali, cellule intermedie e cellule basali, tra cui le cellule marginali svolgono un ruolo centrale nella generazione e nel mantenimento dell'EP. Pertanto, stabilire un modello di coltura primaria in vitro delle cellule marginali è essenziale per indagare le caratteristiche biologiche della stria vascolare e il suo coinvolgimento nei disturbi correlati alla perdita uditiva.
In questo studio, abbiamo isolato e coltivato con successo cellule marginali primarie dalla stria vascolare di topi neonatali. I tessuti strati sono stati ottenuti tramite microdissezione, digeriti con collagenasi di tipo II e purificati tramite placcatura differenziale per rimuovere la maggior parte dei fibroblasti, con cellule coltivate che raggiungono oltre l'80% di confluenza entro il settimo giorno. La colorazione immunofluorescenza ha dimostrato un'espressione stabile della citocheratina 18 (CK18) e del membro 1 della sottofamiglia Q del canale voltagiat-dipendente del potassio (KCNQ1), confermando un isolamento riuscito, un'alta purezza e la preservazione della funzione fisiologica delle cellule marginali.
Sulla base di questo modello, sono stati stabiliti modelli in vitro di stress ossidativo e senescenza cellulare utilizzando rispettivamente perossido di idrogeno (H2O2) e D-galattosio. Le cellule trattate hanno mostrato livelli significativemente aumentati delle specie reattive intracellulari dell'ossigeno (ROS) e positività β-galactosidasi (SA-β-gal) associata alla senescenza, indicando un'elevata sensibilità delle cellule marginali primarie allo stress ossidativo e agli stimoli che inducono la senescenza. Collettivamente, questo studio stabilisce un sistema stabile e riproducibile per la coltura e la modellazione delle cellule marginali primarie del muro, fornendo una piattaforma affidabile in vitro per indagare la disfunzione della stria vascolare e i meccanismi correlati.
Introduzione
Nel sistema uditivo, vari tessuti all'interno della coclea lavorano in sinergia per convertire onde sonore complesse in segnalielettrici 1. La stria vascolare regola la composizione ionica dell'endolinfa e genera il potenziale endo-cocleare (EP), mantenendo così l'omeostasi cocleare e assicurando la normale funzione delle cellule ciliate interne ed esterne. È composto da tre tipi di cellule distinte: cellule marginali, cellule intermedie e cellule basali. Le cellule marginali formano uno strato monoteliale epiteliale polarizzato che si trova direttamente verso l'endolinfa ed è sigillato da giunzioni strette. La membrana basolaterale delle cellule marginali è arricchita con due principali trasportatori di potassio, Na⁺/K⁺-ATPasi e NKCC1, coinvolti nella regolazione del trasporto di ioni sodio e potassio nelle strie vascolari. La funzione di Na⁺/K⁺-ATPasi è stata dimostrata essere direttamente associata all'EP 2,3. I canali K⁺ KCNQ1/KCNE1 si trovano nella membrana apicale delle cellule marginali e generano un potenziale di diffusione K⁺ aggiuntivo che contribuisce alla formazione dell'EP4. Le cellule marginali sono arricchite di molteplici proteine correlate al potassio e fungono da unità cellulare centrale che guida il riciclo del potassio nell'endolinfa cocleare. Pertanto, le cellule marginali sono le cellule chiave responsabili della generazione e del mantenimento dell'EP.
La stria vascolare (SV) ha dimostrato di svolgere un ruolo critico nella patogenesi di molteplici disturbi associati alla perdita uditiva neurosensoriale (SNHL), tra cui la perdita uditiva correlata all'età (ARHL), la perdita uditiva indotta dal rumore (NIHL), la perdita uditiva ereditaria (HHL) e la perdita uditiva indotta da farmaci (DIHL). Inoltre, diversi altri disturbi dell'udito, come la malattia autoimmune dell'orecchio interno (AIED), la malattia autoinfiammatoria dell'orecchio interno (AIDS) e la malattia di Ménière (MD), sebbene etiologicamente distinti, sono stati dimostrati da studi recenti che coinvolgono la SV nei loro meccanismi patogenisottostanti 5,6. Pertanto, è essenziale stabilire modelli cellulari affidabili per indagare la patogenesi della perdita uditiva. Gli studi hanno dimostrato che la riduzione della densità cellulare marginale funge da forte predittore dell'EP durante tutta la vita murina, mentre l'atrofia della stria vascolare rappresenta una lesione caratteristica precoce in ARHL 7,8. La coltura in vitro di cellule marginali può fornire un modello affidabile per studiare la patogenesi dell'ARHL ed esplorare potenziali bersagli terapeutici. Oltre all'ARHL, studi recenti hanno rivelato un'alta correlazione e una possibile relazione sottostante tra la stria vascolare e altri disturbi uditivi, suggerendo che i modelli cellulari marginali in vitro potrebbero avere applicazioni piùampie 5,9,10.
Questo studio descrive un protocollo per la dissezione e la coltura della stria vascolare da coclee neonatali di topo, seguita dalla purificazione delle cellule marginali tramite placcatura differenziale, fornendo così un modello cellulare affidabile per la ricerca sulle patologie correlate alla stria vasculare.
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Protocollo
I cuccioli neonatali di topo (P0-3) sono stati forniti da Biont. Tutte le procedure sperimentali erano conformi alle Linee Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio pubblicate dagli Istituti Nazionali di Salute degli Stati Uniti (Pubblicazione NIH, revisionata 2011) e approvate dal Comitato di Etica Animale dell'Ospedale Renmin dell'Università di Wuhan (WDRM202400019).
1. Sterilizzazione e preparazione dei materiali
- Prepara gli strumenti per la dissezione, inclusi due paia di pinze per microdissecazione, una coppia di forbici standard, una coppia di forbici chirurgiche e una coppia di forbici per microdissecazione. Sterilizza tutti gli attrezzi usando un'autoclave e asciugali in forno a 60 °C per 4 ore.
- Prepara 100 mL di mezzo cellulare epiteliale-animale (mezzo EpiCM-a) secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere siero bovino fetale (FBS), integratore di crescita delle cellule epiteliali (EpiCGS-a) e soluzione di penicillina/streptomicina al mezzo basale per ottenere concentrazioni finali di 2% FBS, 1% EpiCGS-a e 1% penicillina/estreptomicina.
- Disinfettare lo stadio e la custodia dello stereomicroscopio con il 75% di etanolo. Poi, inserire gli strumenti di dissezione autoclaviata e il microscopio disinfettato all'interno di un armadietto di sicurezza biologica. Esponi tutti gli oggetti alla luce UV per 30 minuti per garantire la completa sterilità prima di iniziare la procedura di dissezione.
2. Dissezione e isolamento osseo temporale per la raccolta dell'epitelio uditivo
- Eutanasiare i cuccioli neonatali di topo (P0-3) dopo anestesia isoflurana al 4%, disinfettare con il 75% di etanolo ed eseguire la decapitazione sul ghiaccio. Utilizzare altri metodi eticamente approvati se necessario.
- Immobilizza la testa, apri il cuoio capelluto lungo la sutura sagittale usando forbici a microdissezione (micro-dissection), separi il cuoio capelluto bilateralmente e lo accisi.
- Taglia la testa del topo neonatale lungo la linea mediana usando forbici per microdissecazione. Rimuovere il tessuto cerebrale con una pinza per esporre le ossa temporali (Figura 1A).
- Osservare le ossa temporali bilaterali alla base cranica, rimuovere altre ossa inutili e trattenere il tessuto osseo temporale contenente la coclea (Figura 1B).
- Trasferire un osso temporale in una ciotola sterile da 35 mm contenente Soluzione Salata Bilanciata di Hank (HBSS) fresca su ghiaccio.
- Trasferire l'altro osso temporale sotto il microscopio, fissare il tessuto osseo temporale con una coppia di pinze e utilizzare un'altra coppia per eseguire una dissezione smussata del tessuto muscolare superficiale fino a quando non diventa visibile l'anello ossecolale semicircolare bianco (Figura 1C). Dopo aver confermato il posizionamento cocleare, proseguire la dissezione contusiva verso il basso fino a osservare tessuto cocleare traslucido (Figura 1D).
NOTA: I passaggi 2.6-2.7 devono essere eseguiti sul ghiaccio. - Utilizzando le pinze per microdissezione rimuovi con cura un piccolo pezzo della parete ossea all'angolo apicale della coclea, inserisci delicatamente un lato della pinza nella coclea e separa la parete ossea dal labirinto membranoso. Rimuovere la parete ossea ed estendere il tessuto membranoso del labirinto in una soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) fresca (Figura 1E).
- Fissare la membrana basilare con una coppia di pinze e separare con cura la stria vascolare con un'altra coppia di pinze. Trasferiscilo in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1 mL di soluzione di collagenasi tipo II da 1mg/mL posta sul ghiaccio (Figura 1F).
- Ripeti i passaggi sopra per prelevare la stria vascolare dall'altro lato.
3. Disaggregazione enzimatica per ottenere cellule marginali della stria vascolare
- Incubare il tubo della microcentrifuga contenente il tessuto prelevato in una soluzione di collagenasi di tipo II da 1mg/mL a 37 °C per 30 minuti.
NOTA: La soluzione di collagenasi tipo II è stata preparata diluendo la collagenasi tipo II in soluzione salina tamponata fosfato (PBS; 2,7 mM KCl, 2,0 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 10 mMNa 2HPO 4). - Centrifuga il tubo a 300 × g per 8 minuti.
- Rimuovi con attenzione il soprantantante. Aggiungi 1 mL di mezzo di coltura per interrompere la digestione, tritura delicatamente per risospendere le cellule e centrifuga di nuovo a 300 × g per 8 minuti.
- Aspira il soprannatante e aggiungi 1 mL di substrato fresco per la coltura. Triturate per ottenere una sospensione a cella singola, trasferire la sospensione a un tubo conico da 15 mL e aggiungere un mezzo aggiuntivo per regolare il volume totale a 10 mL.
- Mescola accuratamente la sospensione a celle tramite pipetting ripetuto, poi trasferisci 1 mL della sospensione in ciascun pozzo di una piastra a 6 pozzi. Coltivare le cellule in 2 mL di DMEM integrati con soluzione di FBS al 2%, EpiCGS-a all'1% e soluzione di penicillina/streptomicina a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .
- Sostituisci il mezzo ogni giorno e monitora lo stato delle cellule. La crescita raggruppata delle cellule marginali può tipicamente essere osservata 2 giorni dopo la placcatura.
4. Purificazione delle cellule marginali
- Al terzo giorno di coltura, si osservano la comparsa di numerosi fibroblasti a forma di fuso che circondano i gruppi di cellule marginali simili a ciottoli (Figura 2B).
- Sfruttando le differenze nei tassi di adesione, pipetta delicatamente per rimuovere parzialmente i fibroblasti a forma di fuso. Utilizzando una pipetta da 1 mL, risciacquo delicatamente la soluzione salina bilanciata del D-Hanks su grandi aree in ciascuno dei quattro quadranti. Monitorare la purificazione cellulare al microscopio e regolare di conseguenza la forza e la direzione della pipettatura. Generalmente, lo scarico su grandi aree viene eseguito due volte. Dopo ogni ciclo, esaminare microscopicamente la densità dei fibroblasti; Sulla base di queste osservazioni, applica la pipettatura delicata localizzata su aree di fibroblasti densamente popolate per ottenere una distribuzione rada e uniforme all'interno del piatto di coltura.
NOTA: È stata mantenuta una densità adeguata di fibroblasti, poiché una rimozione completa o una purificazione eccessiva possono limitare la crescita delle cellule primarie. Raccomandiamo di mantenere un rapporto approssimativo di 2:1 tra cellule marginali e fibroblasti. - Cessare la purificazione quando i fibroblasti appaiono distribuiti scarsamente tra i cluster cellulari marginali sotto esame microscopico. Rimuovi il soprandanante e aggiungi 2 mL di substrato fresco per la coltivazione per continuare la coltivazione.
5. Colorazione da immunofluorescenza
- Al secondo giorno post-purificazione, esaminare la morfologia cellulare al microscopio. Quando si osserva una formazione adeguata di cluster cellulari e una densità appropriata, aspirare il mezzo di coltura e lavare le cellule tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4).
- Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso la soluzione fissativa, lava le cellule tre volte con PBS (5 minuti per lavaggio).
- Permeabilizza le cellule con 0,5% di Triton X-100 per 15 minuti. Rimuovi la soluzione e lava le cellule tre volte con PBS (5 min per lavaggio).
- Bloccare cellule con PBS contenente il 10% di siero di capra per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Incubare cellule con anticorpo monoclonale anti-topo CK18 per conigli (diluito 1:300 in PBS contenente siero di capra al 3%) o anticorpo KCNQ1 (G-8) (diluito 1:100 in PBS contenente siero di capra al 3%) durante la notte a 4 °C.
- Lava le cellule tre volte con PBS (10 min per lavaggio). Incubare con il corrispondente anticorpo secondario (diluito 1:300 in PBS contenente 3% di siero di capra) per 1 ora a temperatura ambiente.
- Rimuovere l'anticorpo secondario e lavare le cellule tre volte con PBS (10 min per lavaggio).
- Applicare 1-2 gocce di mezzo di montaggio antifade contenente DAPI sulle vetrine, montare i copri-stalli ed esaminare i campioni utilizzando un sistema di scansione laser confocale.
NOTA: Ad eccezione delle fasi di lavaggio, tutte le soluzioni di incubazione, inclusi gli anticorpi, sono state aggiunte in volumi sufficienti a coprire completamente le cellule.
6. Trattamento H2O 2 e colorazione ROS
- Dopo 7 giorni di coltura, quando le cellule marginali hanno formato uno strato monostrato confluente, si induce lo stress ossidativo tramite trattamento con 1 mMH 2O2. Preparare la soluzione operativa da 1 mM diluendo la soluzione stock al 30% diH 2O2 1:10000 in mezzo cellulare epiteliale. Incubare i gruppi sperimentali con questa soluzione operativa, trattando i gruppi di controllo con il solo mezzo cellulare epiteliale.
- Dopo 16 ore di trattamento, rimuovere con cura il substrato e lavare le cellule con PBS. Valutare i livelli intracellulari di ROS nelle cellule marginali utilizzando un kit di analisi per specie reattive di ossigeno secondo il protocollo del produttore.
- Rimuovere il mezzo di coltura, poi aggiungere MitoTracker Red CMXRos diluito (un colorante selettivo per mitocondri) e DCFH-DA alle cellule, e incubare a 37 °C in un incubatore di coltura cellulare per 30 minuti.
- Lavare le cellule tre volte con PBS (5 min ciascuna), montare le coperture e osservare i campioni utilizzando un microscopio laser confocale.
7. Trattamento con D-galattosio e colorazione SA-β-gal
- Dopo 7 giorni di coltura, quando le cellule marginali formano un monostrato confluente, la polvere di D-galattosio è stata sciolta in un mezzo EpiCM-a per preparare una soluzione lavorativa di 40 mg/mL di D-gal. Incubare gruppi sperimentali con questa soluzione (2 mL per pozzo di una piastra a 6 pozzi, 48 ore, a 37 °C) per indurre la senescenza cellulare, mentre si trattano i gruppi di controllo con lo stesso volume di mezzo Epi.
- Dopo 48 ore di trattamento, rimuovere con cura il mezzo e lavare le cellule con PBS. Valutare la senescenza cellulare nelle cellule marginali utilizzando il kit di colorazione SA-β-gal secondo le istruzioni del produttore.
- Fissa le celle con una soluzione fissativa per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il fissativo, lava le cellule tre volte con PBS (5 minuti per lavaggio).
- Incubare le cellule con soluzione di lavoro per colorazione SA-β-gal contenente il 5% di X-Gal (1 mL per pozzo di una piastra a 6 pozzi) durante la notte a 37 °C in un incubatore umidificato senza CO2.
- Acquisire immagini di colorazione SA-β-gal sotto illuminazione a campo chiaro utilizzando un microscopio.
8. Analisi statistica
- Per confronti tra gruppi trattati con H₂O₂ e gruppi di controllo riguardo all'intensità media di immunofluorescenza della colorazione ROS, e tra gruppi trattati con D-galattosio e di controllo riguardo alla proporzione di cellule SA-β-gal-positive, applicare test T dopo valutazioni di normalità e logaritomiat.
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Risultati
Crescita e caratteristiche morfologiche delle cellule coltivate
Utilizzando questo protocollo, abbiamo stabilito con successo colture primarie di cellule marginali isolate dalla coclea murina. Al secondo giorno di coltura, la microscopia ottica ha rivelato che le cellule si erano attaccate al substrato e avevano iniziato a formare colonie raggruppate (Figura 2Aa). Il terzo giorno abbiamo purificato le cellule (Figura ...
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Discussione
Per decenni, la ricerca sulla perdita uditiva si è concentrata principalmente sul ruolo delle cellule ciliate sensoriali e sulle loro connessioni sinaptiche con i neuroni ganglionali aspirale 11. Numerosi studi pubblicati sono stati dedicati all'istituzione e all'ottimizzazione di modelli in vitro di cellule ciliate, che hanno svolto un ruolo indispensabile nell'indagine dei danni alle cellule ciliate, della rigenerazione e degli effetti dei farmaci
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che la ricerca non presenta conflitti di interesse commerciali o finanziari.
Ringraziamenti
Esprimiamo la nostra gratitudine al Dipartimento di Otorinolaringoiatria-Chirurgia della Testa e del Collo, Ospedale Renmin dell'Università di Wuhan (Wuhan, Cina) e all'Istituto di Ricerca di Otorinolaringoiatria-Chirurgia della Testa e del Collo, Ospedale Renmin dell'Università di Wuhan (Wuhan, Cina) per il loro generoso sostegno e incoraggiamento. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Health Service Center Construction and Incubation Foundation della Cina (ZX0000000037), dalla National Natural Science Foundation of China (81700916, 82301294), dalla Natural Science Foundation della provincia di Hubei (2017CFB242) e dal Health Commission Scientific Research Project della provincia di Hubei (WJ2017Q005).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubo centrifuga da 15 mL | Servicebio | EP-1501-J | Uso per la cultura |
| Piatto per coltura cellulare da 35 mm | NIDO | 706001 | Uso per la dissezione |
| 4% Paraformaldeide | Servicebio | G1101 | Colorazione immunofluorescente |
| Placca a 6 pozzi | Servicebio | CCP-6H | Uso per la cultura |
| Anticorpo anticoniglio Alexa Fluor 488-Coniugato | Proteintech | SA00013-2 | Colorazione immunofluorescente |
| Mezzo di montaggio antifade con DAPI | Assenno | abs9235 | Colorazione immunofluorescente |
| Kit di conteggio delle celle-8 | Beyotime | C0037 | Uso per il conteggio delle celle |
| Collagenasi di tipo II | Biosharp | BS164 | Uso per la cultura |
| Sistema di scansione laser confocale | Olympus | FV1200 | Colorazione immunofluorescente |
| DCFH-DA | Invitrogen | C2938 | Colorazione ROS |
| D-gal | Solarbio | D8310 | Uso per la modellazione cellulare |
| EpiCM-a Medium | Sciencell | 4131 | Uso per la cultura |
| Pinza fine | RWD | F11020-11 | Uso per la dissezione |
| Siero di capra | Beyotime | C0265 | Colorazione immunofluorescente |
| H2O2 | Mkbio | MM0707 | Uso per la modellazione cellulare |
| Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) | Biosharp | BL561A | Uso per la cultura |
| Isoflurano | RWD | R510-22-10 | Uso per la dissezione |
| Anticorpo KCNQ1 (G-8) | Santa Cruz | SC-365186 | Colorazione immunofluorescente |
| Microscopio | Olympus | SZX7-1063 | Uso per la dissezione |
| Microscopio | Olympus | IX71 | Utilizzato per osservare i risultati della colorazione a immunofluorescenza |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | Colorazione ROS |
| Cuccioli di topo neonatali (P0-P3) | fornito da BIONT | ||
| PBS | Servicebio | G4202 | Colorazione immunofluorescente |
| Anticorpo monoclonale anti-topo Rabbit CK18 | Proteintech | 10830-1-AP | Colorazione immunofluorescente |
| Kit per la colorazione della senescenza β-Galactosidasi | Beyotime | C0602 | Colorazione dell'invecchiamento |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Colorazione immunofluorescente |
Riferimenti
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