Cerotti a microaghi dissoluti prodotti con la tecnica di colata a solventi e caratterizzazione essenziale di dispositivi biomedici a microaghi

Summary

Il presente lavoro mira a fungere da guida pratica che consenta ai ricercatori di preparare i propri dispositivi DMAP utilizzando il metodo della colata a dissolvenze, noto anche come micromodellaggio, e di effettuare una caratterizzazione di base.

Abstract

La tecnologia basata su microaghi ha rivoluzionato il campo della ricerca sulla pelle e sulla somministrazione transdermica ed è oggi considerata l'approccio più semplice per somministrare farmaci attraverso la pelle. Il successo dei Microneedle Array Patches (MAP) deriva principalmente dalla loro capacità di annullare la funzione della barriera cutanea che si oppone all'ingresso di farmaci applicati topicamente attraverso la penetrazione indolore dello strato corneo . I MAP dissolventi (DMAP) si distinguono tra gli altri tipi di dispositivi basati su MAP per la biocompatibilità dei loro materiali costituenti, la possibilità di auto-amministrazione da parte dei pazienti e l'assenza di rifiuti taglienti generati dopo l'uso. I DMAP sono solitamente realizzati con materiali polimerici che si disperdono all'inserimento nella pelle quando vengono in contatto con fluidi interstiziali, rilasciando il loro carico. A livello di laboratorio, i DMAP sono comunemente prodotti con il metodo della colata a solventi, che prevede l'uso di stampi master negativi della forma e lunghezza desiderate dei MAPs, sui quali vengono fonduti dispersioni polimeriche caricate da farmaci. Successivamente sono costretti a riempire le cavità dello stampo tramite l'applicazione di una forza centrifuga o pressione positiva. Dopo l'essiccazione, i DMAP diventano solidi e vengono staccati dagli stampi master, e vengono regolarmente sottoposti a vari studi di caratterizzazione prima dell'utilizzo. Questi saghi comprendono tipicamente lo studio delle proprietà meccaniche dei DMAP, la determinazione del contenuto residuo d'acqua, la capacità ex vivo di penetrare nella struttura cutanea, le prestazioni di rilascio del farmaco e la valutazione in vitro della biocompatibilità.

Introduction

Sebbene la somministrazione topica e transdermica di sostanze farmacologicamente attive attraverso e nella pelle sia considerata un'alternativa promettente alla somministrazione orale di farmaci, presenta sfide significative a causa della funzione naturale della barriera cutanea esercitata dallo strato corneo . Questa limitazione colpisce in particolare le molecole di grandi dimensioni, in particolare quelle con peso molecolare >500 Da¹. Inoltre, la diffusione passiva attraverso la pelle di altre molecole con proprietà fisicochimiche specifiche, come una notevole idrofilitia o lipofilicità, è anch'essa limitata. Sono state proposte diverse strategie tecnologiche per superare questa barriera, tra cui iontoforesi, sonoforesi, elettroporazione, uso di potenziatori chimici, metodi termici e sistemi nanodimensionati. Tuttavia, le patch a microneedle array (MAP) si distinguono per diversi vantaggi: estrema efficienza nell'annullare la funzione dello strato corneo , costo-efficacia, un'esperienza indolore per i pazienti e la possibilità di auto-gestione senza la necessità di personale^{medico 2}.

I MAP sono dispositivi che contengono sporgenze simili a aghi di dimensioni microscopiche che perforano lo strato corneo e bypassano la barriera epidermica. In letteratura sono descritti diversi tipi di MAPs, ovvero: MAP solidi, rivestiti, disciolenti, gonfianti e cavi. I MAP dissoluti (DMAP) sono composti da materiali polimerici solubili in acqua e utilizzano una strategia "pungente e rilascia", che spiega le loro caratteristiche più interessanti. In particolare, si sciogliono all'inserimento nella struttura cutanea in contatto con fluidi interstiziali, rilasciandone il contenuto. Rispetto alla strategia "pungere e rilascerla" eseguita dalle MAP solide, dove vengono utilizzate per creare microcanali all'interno della struttura cutanea che permettono il passaggio di una formulazione successivamente applicata^{topicamente 3,4}, l'approccio "pungere e rilasciare" non è soggetto al tempo in cui i microcanali restano aperti. La strategia "poke and flow" richiede la preparazione di MAP cavi, la cui architettura è considerevolmente più complessa e difficile da realizzare. Un ulteriore vantaggio dei DMAP è che non generano rifiuti taglienti dopo l'applicazione, riducendo così il rischio di ferite da aghi e contaminazioni biologiche. Inoltre, la loro applicazione semplice e minimamente invasiva consente una potenziale autogestione da parte dei pazienti, supportandone l'uso in contesti con risorse limitate o geograficamente remoti dove l'accesso a personale sanitario qualificato, infrastrutture mediche e sistemi sicuri di smaltimento di oggetti pungenti è^{limitato 2}. La comunità scientifica focalizzata sulla somministrazione dermica e transdermica di farmaci si è sempre più rivolta alla tecnologia MAP, in particolare ai DMAP, per superare i limiti delle strategie sopra menzionate. Sebbene la prima pubblicazione sui MAP risalga agli anni '80, la tecnologia ha subito un forte aumento nei primi anni 2000. Da allora, il numero di pubblicazioni è cresciuto esponenzialmente, raggiungendo oggi circa 500 articoli^{all'anno: 5}.

I DMAP sono comunemente prodotti con il metodo di colata a solvente o^{microstamping 6}. Questa tecnica di produzione si basa sull'uso di stampi master negativi della forma e lunghezza desiderate dei MAP. Dopo aver colato dispersioni polimeriche cariche di farmaci o sistemi di dimensioni nanodimensionate, viene applicata una forza esterna per riempire le cavità a forma di microago dello stampo master. Una volta essiccati, i DMAP possono essere accuratamente smodellati staccandoli o sciogliendo lo stampo principale con un agente chimico. Questi stampi master sono realizzati con materiali diversi, con il polidimetilsossiano (PDMS) il più comune, grazie alla sua flessibilità e bassa adesività, che facilita lo smoldaggio dei DMAP. La preparazione degli stampi master viene tipicamente eseguita con metodi litografici; tuttavia, sono ora disponibili stampi PDMS commerciali di varie forme, lunghezze e densità di microaghi.

Qui viene fornita una linea guida per la preparazione dei DMAP utilizzando la tecnica di colata con solvente. In questo caso, il processo viene eseguito utilizzando la forza centrifuga o l'applicazione di una pressione positiva. Ciò consente un'alternativa a costi efficienti rispetto ai metodi di produzione ad alto costo di dispositivi biomedici basati su MAP, consentendo a un gruppo più ampio di ricercatori di incorporare i MAP nel proprio lavoro di ricerca sulla pelle. Inoltre, la caratterizzazione essenziale per scopi accademici e di ricerca di base che precede i test in vivo include lunghezza e geometria dell'ago, resistenza meccanica alla compressione, prestazioni di inserimento ex vivo , carico e rilascio del farmaco, contenuto residuo d'acqua, stabilità, assorbimento ex vivo del farmaco e profilo di sicurezza in vitro .

Protocol

I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Produzione di array di microaghi dissolubili tramite centrifugazione

1. Preparare la dispersione colloidale acquosa dei materiali costitutivi dei DMAP dissolvendoli nella quantità appropriata d'acqua e mescolare vigorosamente. A seconda dei polimeri selezionati e della concentrazione, il tempo di dispersione può variare. Se necessario, riscaldare moderatamente l'acqua (40-45 °C) per facilitare la dispersione del polimero.
   NOTA: I polimeri più comuni utilizzati per preparare i DMAP sono poli(vinilpirodone) (PVP), gomma karaya, acido ialuronico (HA), poli(etere metili-vinilico alt-maleico) (PMVE-MA), poli(alcol vinilico) (PVA), carbossimetilcellulosa (CMC), chitosano, ecc.; tuttavia, può essere utilizzato qualsiasi altro materiale idrosolubile con proprietà ottimali. Per la maggior parte delle formulazioni, la concentrazione tipica di lavoro varia dal 5% al 30% a peso/peso. Concentrazioni più basse generalmente producono DMAP a dissoluzione rapida, mentre concentrazioni più alte producono dispositivi a lenta dissoluzione. Tuttavia, la concentrazione ottimale deve essere determinata empiricamente preparando diversi prototipi DMAP, poiché dipende dal peso molecolare del polimero, dalla viscosità e dalle proprietà meccaniche desiderate dei microaghi.
2. Lascia che i polimeri si mescolaro minimamente durante la notte per ottenere una dispersione completa, permettendo al contempo di rimuovere le bolle d'aria.
3. Centrifugare la dispersione polimerica se persistono bolle d'aria (1000 x g; 5 min; 25 °C).
4. Aggiungi il carico (farmaco o particella nanodimensionale) alla concentrazione desiderata e mescola moderatamente fino a renderlo omogeneo senza incorporare nuove bolle d'aria.
5. Smaltire gli stampi PDMS in piastre a 12 pozzi. Per questo, inserisci gli stampi nei pozzi con argilla da modellare, cemento dentale o qualsiasi materiale simile.
6. Gettate 50 μL della miscela polimerica caricata di farmaco sugli stampi PDMS e sulla centrifuga (3000 x g; 5 min; 25 °C). Successivamente, ruota le piastre di 180° e ripeti il processo di centrifugazione per assicurare il riempimento di tutte le cavità a forma di ago.
7. Rimuovere con attenzione l'eccesso di dispersione polimerica carica di farmaci. Usa una pipetta per trasferire la dispersione polimerica se è liquida; Usa una spatola se è molto viscosa.
8. Ripeti il processo di centrifugazione doppia (passo 1.6) per rimettere nello stampo eventuali dispersioni polimeriche caricate da farmaci che potrebbero essere esplose durante il passaggio precedente.
9. Asciugare la dispersione polimerica carica di farmaco negli stampi sotto vuoto (600 mBar; 30 min; 25 °C).
10. Ripeti il protocollo almeno due volte dal passaggio 1.6-1.9 per garantire il corretto riempimento degli stampi master con la dispersione polimerica caricata dal farmaco.
    NOTA: La forza centrifuga può essere progressivamente ridotta tramite 500 x g (25 °C) ad ogni ripetizione.
11. Prepara una dispersione polimerica altamente concentrata e priva di farmaco per formare la base del dispositivo DMAP. Garantirà che il farmaco presente nella dispersione riempita nelle cavità dello stampo non torni alla piastra di base.
12. Fondi 50 μL della dispersione polimerica libera sui stampi PDMS e distribuiti centrifugando due volte, incluse le piastre a punto medio, a una rotazione di 180° (500 x g; 5 min; 25 °C; 2x). Dopo la centrifugazione, aggiungere 100 μL di dispersione a ciascun stampo, seguito dall'aggiunta di altri 50 μL alla piastra di base dopo 12 ore.
13. Lascia asciugare i DMAP negli stampi PDMS per 3-5 giorni a temperatura ambiente in un essiccatore a sigillatura a secco.
14. Smalda con cura i DMAP del PDMS con le pinze o staccali con nastro scotch cellulosa (Figura 1).
15. Caratterizzare i DMAP prodotti (vedi passo 3).

2. Produzione di array di microaghi dissoluti applicando pressione positiva

1. Procedere in modo simile a come descritto nella sezione precedente fino al passo 1.5.
2. Fondi 150 μL della miscela polimerica caricata di farmaco sugli stampi PDMS e inseriscili in un serbatoio a pressione.
3. Riempi il serbatoio di pressione con aria finché non raggiunge una pressione di 3-4 bar per almeno 15 minuti.
4. Rimuovere con attenzione l'eccesso di dispersione polimerica carica di farmaci. Per questo, se la dispersione polimerica è liquida, si usa una pipetta, mentre se è molto viscosa, si rimuove con una spatola.
5. Ripetere l'applicazione di pressione (passaggi 2.2-2.3) per rimettere nello stampo qualsiasi dispersione polimerica caricata di farmaco che possa essere stata traboccata durante il passaggio precedente.
6. Asciugare la dispersione polimerica carica di farmaco negli stampi sotto vuoto (600 mbar; 30 min; 25 °C).
7. Prepara una dispersione polimerica altamente concentrata e priva di farmaco per formare la base del dispositivo DMAP. Garantirà che il farmaco presente nella dispersione riempita nelle cavità dello stampo non torni alla piastra di base.
8. Getta 0,2 g della dispersione polimerica libera sui stampi PDMS e applica una pressione positiva, come descritto nel passo 2.3.
9. Procedi in modo simile a come descritto nella sezione precedente dal passo 1.13.

3. Caratterizzazione dei DMAP

NOTA: In questo passaggio, sono stati eseguiti metodi che prevedono l'uso di tessuti cutanei umani e/o animali in conformità con le linee guida istituzionali. Inoltre, i metodi che prevedevano l'uso di campioni di pelle animale sono stati eseguiti in conformità con il principio delle 3R per la sperimentazione animale.

1. Visualizza i DMAP usando una micro-camera con l'ingrandimento appropriato per distinguere le proiezioni a forma di ago⁷.
   NOTA: Se sono stati caricati con un farmaco colorato o un colorante, deve essere osservato un colore diverso tra le punte e la piastra di base.
2. Collegare i DMAP a un dispositivo di supporto e visualizzare la morfologia e la lunghezza delle proiezioni simili a microago tramite microscopia ottica. Bisogna osservare una struttura a punta affilata. Registra la durata delle proiezioni simili a microaghi con il software appropriato per il tuo microscopio ottico.
   NOTA: Per misurare la lunghezza del microago tramite microscopia ottica, le MAP devono essere visualizzate perpendicolarmente agli obiettivi. Le misurazioni della lunghezza e la forma delle proiezioni simili a microaghi devono essere confermate tramite microscopia elettronica a scansione.
3. Valutare le proprietà meccaniche dei DMAP verso la deformazione dei microaghi dopo la compressione su una superficie solida. Per questo, inserisci il dispositivo DMAP in un applicatore DMAP disponibile in commercio e comprimilo contro una superficie piana in acciaio inossidabile per 30 secondi. Dopo la compressione, registrare la lunghezza delle proiezioni simili a un microago e calcolare la percentuale di deformazione confrontandola con la lunghezza iniziale secondo la seguente^{equazione 7}:
   
   Dove h_o e h_f rappresentano rispettivamente la lunghezza dei microaghi prima e dopo la compressione.
   NOTA: Se disponibile, l'uso di un analizzatore di texture standardizza la forza di compressione. In tal caso, una forza di 32 N/array imita la forza media del pollice che i pazienti applicano quando si auto-somministrano dispositivi DMAP.
4. Determinare la capacità di inserimento preliminare dei DMAP con un metodo di pelle artificiale surrogata basato su fogli termoplastici realizzati in materiale di tipo^{olefinico 8}. Per ciò, comprimere il dispositivo DMAP contro otto fogli legati seguendo le condizioni descritte nel passo 3.4. Il numero di fori creati in ciascun strato viene osservato tramite microscopia ottica o utilizzando una telecamera microscopica, e la percentuale di penetrazione a diverse profondità viene calcolata.
   NOTA: I fogli termoplastici commercialmente disponibili solitamente presentano uno spessore di 127 μm.
5. Determinare la capacità di inserimento ex vivo dei DMAP utilizzando espianti di pelle umana, suina o roditoria precedentemente eliminata e accuratamente potata. Pulisci l'espiante della pelle con abbondante acqua lasciandola in ammollo per 1-2 minuti e poi posizionala su un materiale schiumoso avvolto in alluminio con il lato dello stratum corneo rivolto verso l'alto.
   1. Prosegue con l'inserimento nelle condizioni descritte nel passaggio 3.4. Lascia i DMAP inseriti nella pelle fino alla dissoluzione delle punte dei microaghi. Se i DMAP sono caricati con un colorante o un farmaco colorato, la colorazione dei lati interni ed esterni della pelle rivela un'inserimento efficace^{dei DMAP 9}. Inoltre, i microcanali possono essere osservati tramite analisi istologica delle sezioni^{cutanee 7}.
      NOTA: Questo passaggio, che coinvolge pelle umana o animale ex vivo , è stato condotto in conformità con le linee guida e l'approvazione del Comitato Etico per la Ricerca Umana e Animale dell'Università di Valencia. È stato ottenuto il consenso informato, dove applicabile, e tutti gli esperimenti hanno rispettato gli standard etici istituzionali ed europei per l'uso di tessuti umani e animali nella ricerca biomedica.
6. Determinare il contenuto residuo d'acqua tramite analisi termogravimetrica. La perdita di peso osservata fino a 100-110 °C è attribuita all'acqua^{residua 10}.
   NOTA: A seconda della fonte della letteratura, il contenuto massimo residuo consentito è del 5%-10% del peso totale per garantire un'ottimale asciugatura dei DMAP.
7. Quantificare il carico immergendo i DMAP in 5-10 mL d'acqua (o in alternativa, in un mezzo acquoso appropriato per il farmaco analizzato) a 32-37 °C e quantificando la quantità di carico utilizzando un metodo analitico ottimale.
   NOTA: La spettrofotometria UV-Vis è comunemente utilizzata per l'analisi di piccole molecole. Per composti con bassi limiti di rilevamento e quantificazione, è altamente raccomandata la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) abbinata a rilevamento UV-Vis, fluorescenza o elettrochimica. L'HPLC abbinato alla spettrometria di massa può essere impiegato quando sono richieste sensibilità e specificità eccezionali. La determinazione analitica dei carichi di proteine e anticorpi viene tipicamente eseguita utilizzando saghi e immunosaggi con acido bicinconinico (BCA), come il saggio immunosorbente legato a enzimi (ELISA) o il Western blotting, rispettivamente. I profili di rilascio del farmaco vengono ottenuti campionando (0,2-1 mL) in momenti temporali predeterminati dal mezzo^{acquoso di rilascio 11}. Dopo ogni punto di campionamento, il volume sottratto viene sostituito con lo stesso volume di materiale di rilascio temperato per evitare errori legati all'auto-concentrazione dei campioni.
8. Valutare la stabilità dei DMAP ripetendo i saggi di caratterizzazione sopra menzionati per garantire che le caratteristiche dei DMAP rimangano costanti durante il periodo di archiviazione nelle condizioni di archiviazione progettate.
   NOTA: Se il carico è termostabile, i DMAP vengono tipicamente conservati a temperatura ambiente (25 °C). Per i principi attivi termosensibili, i DMAP sono conservati a 4 °C. L'umidità relativa dovrebbe essere mantenuta sotto il 30%. La stabilità dei DMAP viene monitorata regolarmente per un periodo di sei mesi.
9. Determinare il farmaco ex vivo deposizione e assorbimento cutaneo attraverso la pelle utilizzando un sistema di cellule di diffusione di Franz (FDC). Per questo, prepara la pelle come descritto e inserisci i DMAP nella struttura cutanea per 30 secondi, come descritto nel passo 3.6.
   1. Successivamente, incolla la camera donatrice di FDC sulla pelle con una quantità adeguata di cianoacrilato. Quando è asciugato, fissare il complesso della camera donatrice di pelle alla camera recettrice usando pinze appropriate¹². Infine, procedere con il protocollo di campionamento descritto nel sottosezione 3.5.
      NOTA: Questo passaggio che coinvolge pelle umana o animale ex vivo è stato condotto in conformità con le linee guida e l'approvazione del Comitato Etico della Ricerca Umana e Animale dell'Università di Valencia. È stato ottenuto il consenso informato, dove applicabile, e tutti gli esperimenti hanno rispettato gli standard etici istituzionali ed europei per l'uso di tessuti umani e animali nella ricerca biomedica. Se i DMAP si dissolvono lentamente, fissarli alla pelle usando bande adesive chirurgiche per prevenire l'auto-espulsione dalla struttura cutanea.
10. Valutare la biocompatibilità in vitro utilizzando saghi sull'attività metabolica, come saggi basati su tetrazolio e resazurina, o test di proliferazione, inclusi saghi 5-Bromo-2'-desossiuridina bromodeossiuridina (BrdU), secondo le istruzioni del produttore.
    NOTA: Le linee cellulari preferite sono cheratinociti, fibroblasti o melanociti. Le cellule non esposte ai DMAP sono tipicamente utilizzate come controlli negativi, mentre le cellule trattate con dodecil solfato di sodio (SDS) all'1% fungono da controlli positivi. La valutazione della biocompatibilità dipende dal profilo di dissoluzione dei DMAP. Per i DMAP a dissoluzione rapida (scioglimento entro 24 ore), si utilizza il metodo a base di estratto, in cui il dispositivo viene sciolto prima dell'esposizione cellulare. Per i DMAP a scioglimento lento, si applica il metodo del contatto diretto, con il dispositivo aggiunto direttamente ai pozzi seeded. Secondo gli standard internazionali ISO 10993, i risultati di vitalità cellulare >70% sono considerati non tossici.

Results

I DMAP prodotti devono indicare un aspetto omogeneo con una formazione efficace di proiezioni simili a microaghi, come mostrato nella Figura 2A. Quando un carico colorato viene caricato solo nella struttura a microaghi, una piccola quantità di farmaco può contaminare la base dei DMAP a causa di un traboccamento dalle punte o di una pulizia incompleta prima della fusione della dispersione polimerica libera. Tuttavia, si osserva una chiara differenza tra le du...

Discussion

Il protocollo descritto qui consente la preparazione dei DMAP. Tuttavia, la versatilità e l'ampia gamma di materiali polimerici utilizzabili per la produzione dei DMAP permettono la produzione di dispositivi di dissoluzione con caratteristiche diverse. I risultati presentati corrispondono ai DMAP a dissoluzione rapida, poiché sono stati prodotti con PVP, un polimero altamente dispersibile in acqua a bassa concentrazione. Il tempo di dissoluzione dei DMAP può essere facilmente regolato se...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastra a 12 pozzi per coltura cellulare	N/A	N/A	Nessuna specifica. Qualsiasi piastra commerciale a 12 pozzi è adatta
Centrifuga	Eppendorf	Centrifuga 5810 G	Sostituibile da qualsiasi altra centrifuga adattabile a piastre di coltura cellulare
Blu di metilene	Sigma Aldrich	66720	CAS 122965-43-9. Sostituibile da qualsiasi altro colorante o marca
Argilla da modellare	N/A	N/A	Nessuna specifica. Qualsiasi argilla da modellare commerciale è adatta
Fogli termoplastici di tipo olefinico	Amcor	PM996	Parafilm M
Polietreno (alcol vinilico) (PVA) MW: 9-10 kDa	Sigma Aldrich	363146	CAS 9002-89-5. Sostituibile da qualsiasi altro marchio
Poli (vinile pirrolidone) (PVP) MW: 40 kDa	Sigma Aldrich	PVP40	CAS 9003-39-8. Sostituibile da qualsiasi altro marchio
Stampi di polidimetilsilossano (PDMS)	Tecnologie Micropuntuali	ST-06	Distribuzione degli aghi dell'array 15 x 15; Altezza 600 e micro; m; Base 200 & micro; m; Passo dell'ago 500 µ. Sostituibile da qualsiasi altro stampo PDMS con altra forma e lunghezza della cavità
Serbatoio a pressione	Protrima	AT-10HT	Sostituibile da qualsiasi altro serbatoio a pressione che supporti una pressione di 4 bar