Articolo metodologico

Valutazione dell'effetto del timochinone sulla segnalazione di Keap-1/NRF-2, sullo stress ossidativo e sul comportamento nei ratti

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DOI:

10.3791/69924

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13 marzo 2026

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1Faculty of Medicine, Department of Physiology, Kirsehir Ahi Evran University, 2Faculty of Medicine, Department of Histology and Embryology, Kirsehir Ahi Evran University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo dimostra come valutare gli effetti del timochinone sulla via Keap-1/Nrf-2, sui biomarcatori dello stress ossidativo e sugli esiti comportamentali in un modello ratto di esposizione subcronica alla deltametrina.

Abstract

Gli sviluppi recenti nella ricerca sull'esposizione ai pesticidi hanno aumentato l'interesse per strategie protettive basate su antiossidanti. Il timochinone (TQ), un composto bioattivo di origine vegetale, è stato segnalato per aver effetti protettivi contro vari agenti tossici. Questo studio descrive un protocollo per valutare gli effetti della TQ sui parametri di stress ossidativo, sulla via di segnalazione Keap-1/Nrf-2 e sugli esiti comportamentali nei ratti esposti a bassa dose di Deltametrina (DTM). Qui, 24 maschi adulti di ratti Wistar Albini (250 ± 20 g) sono stati assegnati casualmente a quattro gruppi (n = 6/gruppo): controllo, TQ, DTM e DTM+TQ. DTM (1,28 mg/kg) e TQ (10 mg/kg) sono stati somministrati intragicastricamente per 30 giorni. Il peso corporeo è stato monitorato durante tutto lo studio. L'attività locomotoria e il comportamento simile all'ansia sono stati valutati con il test in campo aperto al giorno 31, mentre il comportamento simile alla depressione è stato valutato con il test del nuoto forzato al giorno 32. Al termine del periodo sperimentale, sono stati raccolti plasmi e tessuti cerebrali per analisi biochimiche, istopatologiche e molecolari. I marcatori di stress ossidativo, inclusi malondialdeide, ossido nitrico totale, glutatione e gruppi solidrilico, sono stati misurati nei campioni di plasma e corteccia cerebrale. I livelli di espressione della proteina ECH associata simile al kelch (Keap-1) e del fattore eritroide 2 correlato (Nrf-2) sono stati analizzati utilizzando Western blotting e immunoistochimica. Questo protocollo fornisce un approccio completo e riproducibile per studiare la neurotossicità indotta dai pesticidi e gli effetti modulatori dei composti antiossidanti.

Introduzione

Gli insetticidi sono ampiamente utilizzati in agricoltura e negli ambienti domestici per controllare i parassiti; tuttavia, l'esposizione cronica a basse dosi può causare contaminazione ambientale e effetti negativi sulla salute sia negli esseri umani che negli animali. Questa esposizione, in particolare attraverso alimenti e acqua contaminati, è stata associata a un aumento del rischio di disturbi neurologici e altre tossicitàsistemiche 1.

I piretroidi hanno in gran parte sostituito gli insetticidi organofosforici a causa di regolamentazioni più severe su questi ultimi e della loro tossicità relativamente inferiore per i mammiferi. Il DTM, un piretroide di tipo II contenente un gruppo α-ciano, è tra gli insetticidi più comunemente utilizzati al mondo ed è considerato altamente efficace contro gliinsetti 2. Nonostante ciò, studi sperimentali hanno dimostrato che l'esposizione al DTM induce stress ossidativo e neurotossicità nei modellianimali 3,4.

Il DTM è un composto altamente lipofilo che attraversa facilmente la barriera emato-encefalica e interrompe la funzione neuronale prolungando l'apertura dei canali di sodio dipendenti dal voltaggio. Questo effetto porta a un ripetitivo scarico neuronale, un aumento dell'afflusso intracellulare di sodio e una maggiore generazione di specie reattive di ossigeno, portando infine a danni ossidativi, infiammazione e alterazioni comportamentali, in particolare nelle regioni cerebrali vulnerabili come l'ippocampo e la cortecciacerebrale 1. Data la crescente preoccupazione riguardo alla neurotossicità indotta dai pesticidi, si è rivolta sempre più attenzione alle strategie protettive basate su antiossidanti derivate da fonti naturali. Il TQ, un importante componente bioattivo dell'olio essenziale di Nigella sativa, è stato segnalato come possedente potente antiossidante, antinfiammatorio eneuroprotettivo 5. Diversi studi hanno dimostrato i suoi effetti benefici contro lo stress ossidativo indotto chimicamente e contro i processineurodegenerativi 5,6,7,8,9.

Uno dei meccanismi principali alla base degli effetti protettivi della TQ riguarda la modulazione della via di segnalazione Keap-1/Nrf-2. Questa via svolge un ruolo centrale nel mantenimento dell'omeostasi redox cellulare regolando l'espressione di enzimi antiossidanti e detoxossianti. In condizioni di stress ossidativo, la repressione di Nrf-2 mediata da Keap-1 viene alleviata, permettendo a Nrf-2 di traslocarsi nel nucleo e attivare l'espressione genica dipendente da elementi di rispostaantiossidante 9.

Poiché l'esposizione al DTM induce alterazioni a livello molecolari, biochimico, istologico e comportamentale, un singolo approccio analitico non è sufficiente per cogliere l'intera portata dei suoi effetti neurotossici. Pertanto, questo protocollo integra valutazioni comportamentali, analisi dei biomarcatori dello stress ossidativo, valutazione istopatologica e indagine molecolare della via Keap-1/Nrf-2 per fornire un quadro completo e riproducibile per studiare la neurotossicità indotta dai pesticidi e gli effetti modulatori di composti antiossidanti come TQ.

Nel complesso, le evidenze riassunte sopra evidenziano la necessità di un approccio sperimentale integrato per chiarire i meccanismi alla base della neurotossicità indotta dal DTM e per valutare potenziali interventi protettivi. Combinando valutazioni comportamentali con analisi biochimiche, istopatologiche e molecolari della via Keap-1/Nrf-2, il protocollo attuale consente una valutazione multidimensionale dei danni neuronali correlati allo stress ossidativo. L'interpretazione dei risultati sperimentali all'interno di questo quadro meccanicistico enfatizza come il TQ moduli la segnalazione redox, attenui il danno tissutale e migliori gli esiti comportamentali nel contesto dell'esposizione subcronica al DTM.

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Protocollo

Il Comitato Etico Locale per la Sperimentazione Animale Istituzionale ha approvato il protocollo sperimentale con il numero di registrazione 68429034/35. La durata totale dello studio è stata di 32 giorni. Prima degli esperimenti, gli animali erano stati acclimatati alle condizioni standard di laboratorio. Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in rigorosa conformità con le linee guida istituzionali e internazionali sull'etica animale. I materiali sperimentali utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

NOTA: I rifiuti chimici e biologici sono stati smaltiti in conformità con le linee guida sull'istituzione sulla sicurezza dei laboratori e sulla gestione dei rifiuti. Acidi, basi e solventi organici venivano raccolti in contenitori separati e etichettati e consegnati all'unità istituzionale di rifiuti pericolosi. I materiali biologici e i consumabili contaminati venivano raccolti in contenitori per biohazard, sterilizzati e trasferiti nella struttura istituzionale appropriata per lo smaltimento finale.

1. Disegno sperimentale

  1. Ottieni 24 maschi adulti di ratti Wistar Albini del peso di 250 ± 20 g dal Laboratorio di Esperimenti Animali. Ospita ogni ratto individualmente in gabbie a 24 ± 2 °C in un ciclo di 12 ore chiaro/buio, con accesso ad libitum al cibo standard per ratti e acqua del rubinetto.
  2. Dividere casualmente gli animali in quattro gruppi (n = 6 per gruppo): Gruppo 1: Controllo (C), Gruppo 2: TQ, Gruppo 3: DTM, Gruppo 4: DTM + TQ.
  3. Sciogliere il DTM (98% di purezza) in olio di mais e somministrare a una dose di 1,28 mg/kg tramite gavage intragastrico per 30 giorni.
  4. Sciogliere il TQ a una dose di 10 mg/kg in olio di mais e somministrare tramite gavage intragastrico per 30 giorni. Prepara ogni trattamento fresco ogni giorno e somministra a un volume totale di 1 mL/kg.
  5. Nel gruppo di trattamento combinato, somministrare la TQ immediatamente dopo la DTM. Somministrare solo olio di mais al gruppo di controllo per tenere conto dello stress legato al gorgone.
    NOTA: La dose DTM è stata selezionata sulla base della letteratura precedente per indurre stress ossidativo senza causare morbilità e corrisponde a circa 1/100 della LD501.

2. Misurazione del peso corporeo

  1. Misura il peso corporeo nei giorni 1, 10, 20 e 30 dello studio (Figura 1).

3. Parametri comportamentali

  1. Eseguire tutti i test comportamentali in condizioni standardizzate per garantire la coerenza. Registra sia il Test di Nuoto Forzato (FST) che il Test in Campo Aperto (OFT) utilizzando una telecamera aerea che offre una visuale completa dell'apparecchiature di prova. Mantieni l'illuminazione a circa 100–150 lux. Definisci immobilità come l'assenza di movimento attivo, ad eccezione dei movimenti minimi necessari per mantenere postura e respirazione. Pulire tutte le aree di test con il 70% di etanolo tra gli animali per prevenire influenze olfattive.
  2. FST
    1. Eseguire la FST al giorno 32 per valutare comportamenti simili a quelli depressivi. Effettuare una sessione pre-test di 15 minuti 24 ore prima della sessione di prova di 5 minuti per abituare gli animali all'ambiente acquatico e minimizzare lo stress indotto da novità. Non effettuare punteggi comportamentali durante la sessione pre-test.
    2. Mettere singolarmente i ratti in contenitori cilindrici (diametro: 35 cm, altezza: 50 cm) contenenti 30 cm d'acqua mantenuti a 25 ± 1 °C per 5 minuti.
    3. Registra le durate del nuoto, dell'arrampicata e dell'immobilità usando una videocamera. Quantifica i parametri comportamentali in pochi secondi dalle registrazioni video10.
    4. Definisci i comportamenti come segue:
      Immobilità: Considera l'animale immobile quando rimane galleggiante senza movimenti attivi, facendo solo movimenti minimi necessari per mantenere la testa fuori dall'acqua.
      Nuoto: Definisci nuoto come movimento orizzontale attivo lungo tutto il cilindro con movimenti coordinati di tutte e quattro le zampe.
      Arrampicata: Definisci l'arrampicata come movimenti vigorosi e orientati verso l'alto delle zampe anteriori contro la parete cilindrica mentre l'animale rimane in posizione verticale.
    5. Se l'animale rimane completamente immobile, valuta il comportamento come immobilità secondo i criteri predefiniti.
    6. Non applicare stimoli esterni o correzioni di rotta durante la sessione di test. Permette all'animale di comportarsi liberamente per tutto il periodo di 5 minuti, a meno che non sia necessario intervenire per motivi di sicurezza (ad esempio, rischio di annegamento).
  3. OFT
    1. Eseguire l'OFT al giorno 31 per valutare l'attività locomotoria e il comportamento simileall'ansia 11. Registra i singoli movimenti per 5 minuti in un'arena di 90 x 35 cm, divisa in 24 unità uguali da linee nere.
    2. Quantificare i seguenti parametri comportamentali dalle registrazioni video di un investigatore cieco sull'assegnazione di gruppo:
      Il numero di incroci con tutte e quattro le zampe (attività locomotoria)
      Tempo trascorso nelle zone centrali e periferiche (comportamento simile all'ansia)
    3. Se un animale rimane completamente immobile, registra il comportamento come immobilità e assegna zero attraversamenti per quel periodo.
    4. Non applicare stimolazioni esterne, riposizionamenti o correzioni di rotta durante la sessione di test.
    5. Lascia che l'animale si comporti liberamente per tutto il periodo di 5 minuti, a meno che non sia necessario intervenire per motivi di sicurezza.
    6. Pulisci l'arena con il 70% di etanolo tra gli animali per eliminare i segnali olfattivi.

4. Valutazione dei marcatori dello stress ossidativo

  1. Esegui tutte le procedure al giorno 32. Anestesiare profondamente i ratti con xilazina intramuscolare (5 mg/kg) e ketamina (45 mg/kg). Confermare l'anestesia profonda in assenza del riflesso di ritiro dei pedali. Raccogli circa 3–5 mL di sangue tramite puntura cardiaca in tubi rivestiti di EDTA.
  2. Eutanasia completa tramite esanguinazione sotto anestesia profonda e conferma della morte prima della raccolta del tessuto. Centrifugare i campioni di sangue a 3.000 x g per 10–15 minuti a 4 °C. Raccogli con cura il plasma senza disturbare il buffy coat e conserva le aliquote a −80 °C. Disseziona rapidamente il cervello sul ghiaccio. Separare l'emisfero cerebrale sinistro e l'ippocampo per analisi biochimiche e congelare subito in azoto liquido (−80 °C di stoccaggio). Fissare l'emisfero cerebrale destro con formalina tamponata al 10% di neutro per la valutazione istologica.
  3. Analisi dello stress ossidativo plasmatico
    1. Perossidazione lipidica plasmalogica (test TBARS)
      1. Campioni di plasma centrifugo (3.000 x g, 10 min, 4 °C). Mescolare 0,5 mL di plasma con 1 mL di reagente TCA–TBA–HCl (15% di acido tricloroacetico (TCA), 0,375% di acido tiobarbiturico (TBA), 0,25 N di acido cloridrico (HCl)). Centrifuga a 1.000 x g per 10 minuti e trasferisci il surnatante in tubi di vetro. Aggiungere 50 μL di idrossitoluene butilato allo 0,02% (BHT) per prevenire ossidazione artificiale.
      2. Riscaldare a 100 °C per 15 minuti, raffreddare a temperatura ambiente, centrifugare a 1.000 x g per 10 minuti e misurare l'assorbanza sovrantantante a 532 nm10. Calcolare la concentrazione di MDA usando la legge di Beer–Lambert
        ε = 1,56 × 105 M⁻1 cm⁻1, l = 1 cm e si esprime come plasma nmol/mL.
    2. Livelli di Tiol nel Plasma (RSH)
      1. Miscelare 0,5 mL di plasma con tampone Tris-HCl (100 mM, pH 8,2) contenente 1% di dodecile solfato di sodio (SDS) e 2 mM di acido etilediaminatetraacetico (EDTA). Incubare 5 minuti a 25 °C e centrifugare (3.000 x g, 10 min, 4 °C). Usa il soprantantante per l'analisi.
      2. Aggiungere 0,3 mM 5,5′-dithiobis-(2-acido nitrobenzoico) (DTNB) e incubare a 37 °C per 15 minuti. Misura l'assorbenza a 412nm 10. Calcola le concentrazioni di RSH usando ε = 13.600 M⁻1 cm⁻1 ed esprime come plasma μmol/L.
    3. Livelli di NOx nel plasma (reazione di Griess)
      1. Deproteinizza il plasma con idrossido di sodio (NaOH) allo 0,3 M e solfato di zinco al 5% (ZnSO₄). Centrifuga a 20.000 x g per 5 minuti e raccogli il soprandante.
      2. Preparare soluzioni di stock di nitrato (100, 10 e 1 mmol/L) e generare una curva standard (1–100 μmol/L). Caricare 100 μL di sovrantanti (pozzi duplicati) in una micropiastra (sovrantante).
      3. Aggiungere 100 μL di cloruro di vanadio (III) (VCl₃) seguiti da 50 μL di solfanilamide e 50 μL di N-(1-naftil) etilediamina. Incubare per 30–45 minuti a temperatura ambiente e misurare l'assorbenza a 540nm 10. Determinare le concentrazioni di NOx dalla curva standard ed esprimere come plasma μmol/L.
  4. Analisi dello stress ossidativo tissutale
    1. Utilizzare circa 100 mg di tessuto dell'emisfero cerebrale sinistro per tutte le analisi biochimiche.
    2. Perossidazione dei lipidi tissutali (saggio TBARS)
      1. Omogeneizzare il tessuto (1:10 p/v) in un TCA al 10% gelido. Aggiungi un volume uguale dello 0,67% TBA e riscalda a 100 °C per 15 minuti. Raffreddare e centrifugare (3.000 x g, 10 min, 4 °C)10. Misura l'assorbenza soprantantante a 535 nm. Calcola la MDA usando ε = 1,56 × 105 M⁻1 cm⁻1 ed esprimi come nmol/g tessuto umido.
    3. Livelli di glutatione tissutale (GSH)
      1. Omogeneizzare il tessuto al 10% di TCA (1:10 p/v) e centrifugare (3.000 x g, 10 min, 4 °C). Mescolare 0,5 mL di soprandanante con 2 mL di soluzione DTNB (0,4 mg/mL in citrato di sodio all'1%). Misura immediatamente l'assorbenza a 412 nm. Calcola il GSH usando ε = 13.600 M⁻1 cm⁻1 ed esprimi come μmol/g tessuto umido.
    4. Livelli di NOx tissutali (reazione di Griess)
      1. Omogeneizzare il tessuto in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (1:5 w/v) e centrifuga (2.000 x g, 5 min). Deproteinizza il surnatant con 0,3 M di NaOH e 5% di ZnSO₄. Centrifuga (3.000 x g, 20 min) e raccogli il sovrantatore trasparente.
      2. Prepara standard di nitrati (1–100 μmol/L). Carica 100 μL di sovrantante in pozzi duplicati. Aggiungi i reagenti VCl₃ e Griess come descritto sopra. Incubare per 45 minuti a 37 °C e misurare l'assorbenza a 540 nm10. Determinare le concentrazioni dalla curva standard ed esprimersi come tessuto μmol/g.
        ATTENZIONE: Le procedure che coinvolgono sostanze chimiche pericolose, tra cui TCA, HCl, NaOH e solventi organici, sono state eseguite in una cappa chimica certificata. Dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati, come camice da laboratorio, guanti resistenti ai prodotti chimici, occhiali protettivi e, quando necessario, visiere, sono stati utilizzati in tutti gli esperimenti. Tutte le sostanze chimiche sono state maneggiate secondo le linee guida istituzionali di sicurezza e le relative schede dati di sicurezza dei materiali (MSDS).

5. Determinazione dei livelli di Keap-1 e Nrf-2 tramite analisi Western blot

  1. Tagliare il tessuto ippocampo in pezzi da 50 mg e inserire in tubi di omogeneizzazione contenenti 500 μL di tampone RIPA integrato con un cocktail di inibitori della proteasi.
  2. Aggiungi una quantità adeguata di sfere magnetiche e omogeneizza a 1.000 x g per due cicli. Centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
  3. Trasferire il sovrantantante per pulire i tubi della microcentrifuga e centrifugare di nuovo nelle stesse condizioni. Conserva i campioni sul ghiaccio e determina le concentrazioni di proteine.
  4. Misura le concentrazioni proteiche utilizzando un fluorometro con il Protein BR Tay Kit, seguendo le istruzioni del produttore.
  5. Prepara gel SDS–PAGE al 10% per l'elettroforesi. Regola la concentrazione proteica a 30 μg/μL.
  6. Aggiungi 4 volte il tampone di Laemmli in un rapporto 3:1 e integra con il 10% di β-mercaptoetanolo. Riscaldare i campioni a 95 °C per 5 minuti, poi centrifugare brevemente.
  7. Carica 5 μL di marcatore proteico e 30 μg di proteine per corsia. Fai funzionare i gel a 110 V per 60–90 minuti.
  8. Attivare le membrane PVDF al 100% metanolo per 3–5 minuti, poi bilanciare in 1× transfer buffer per 10 minuti a temperatura ambiente prima del trasferimento.
  9. Bagna carta filtro e spugne con il transfer buffer e assembla con cura il transfer sandwich, assicurando la completa rimozione delle bolle d'aria. Esegui il trasferimento proteico utilizzando un sistema di trasferimento umido a 100 V per 90 minuti a 4 °C (tensione costante).
  10. Bloccare membrane in albumina sirica bovina al 3% (BSA) per 1 ora a temperatura ambiente su uno shaker orbitale. Incubare le membrane durante la notte a 4 °C con anticorpi primari diluiti al 3% di BSA (Keap-1 e Nrf-2, 1:3.000; β-actina, 1:1.000).
  11. Lava le membrane 5 volte per 5 minuti con 1 × di soluzione fisiologica tampata con Tris-buffer e detersivo Tween 20 allo 0,1% (TBS-T). Incubare con anticorpi secondari (1:15.000) per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
  12. Lavare le membrane come descritto e incubare con un substrato a chemiluminescenza avanzata (ECL) (ad esempio, substrato HRP a base di luminolo) secondo le istruzioni del produttore (mescolando volumi uguali di reagente A e B immediatamente prima dell'utilizzo). Applicare abbastanza substrato per coprire completamente la superficie della membrana (circa 1 mL per membrana) e incubare per 1–2 minuti a temperatura ambiente.
  13. Rilevare i segnali chemiluminescenti utilizzando un sistema di imaging digitale dotato di rilevamento della chemiluminescenza (non è richiesta una specifica lunghezza d'onda di eccitazione, poiché l'emissione luminosa deriva dalla reazione HRP–luminolo). Acquisire immagini utilizzando impostazioni automatiche di esposizione assicurandosi bande non sature. Mantieni parametri di esposizione identici per tutti i campioni all'interno dello stesso blot.
  14. Eseguire analisi densitometriche utilizzando software di analisi delle immagini sotto parametri identici di selezione del ROI, sottrazione di fondo e normalizzazione. Normalizza le intensità delle bande Keap-1 e Nrf-2 alla corrispondente proteina di mantenimento β-actina. Esporta i valori normalizzati come file .csv per l'analisi statistica.

6. Analisi istopatologica

  1. Fissare l'emisfero cerebrale destro con formalina neutra al 10% per 72 ore. Disidratarsi tramite una serie di etanolo gradato (70%–100%), incorporarsi in paraffina e sezionare a 5 μm.
    Ottenere sezioni cerebrali coronali ai livelli della corteccia ippocampale ed entorinica secondo le coordinate stereotassiche definite in Paxinos & Watson, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (Academic Press). Usa il visualizzatore interattivo dell'atlas cerebrale dei ratti (https://labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas per verificare e affinare la localizzazioneanatomica 11.
  2. Preparare quattro sezioni coronali consecutive (spessore 5 μm) da tessuto cerebrale immerso nella paraffina utilizzando procedure istologiche standard. Tingere le sezioni con ematossilina ed eosina (H&E) secondo i protocolliconvenzionali 12. Esamina tutte le vetrine al microscopio lucico con un ingrandimento del 200×. Assicurarsi che la valutazione istologica venga eseguita da un investigatore cieco per minimizzare il biasdell'osservatore 13.
    NOTA: Questa procedura ha garantito un confronto anatomico coerente tra i gruppi.
  3. Valuta semiquantitativamente la perdita neuronale, l'edema cellulare, la pignosi nucleare, l'infiltrazione infiammatoria e la congestione vascolare in 10 campi casuali per sezione.
  4. Calcola i punteggi medi per ogni parametro per gruppo. I criteri di punteggio erano i seguenti: 0 (nessuno, <5%), 1 (lieve, <33%), 2 (moderato, 33–66%) e 3 (grave, >66%; Tabella 1).

7. Analisi immunoistochimica della reattività di Nrf-2 e Keap-1 nell'ippocampo e nella corteccia entorinale

  1. Preparare sezioni spesse 5 μm dall'ippocampo e dalla corteccia entorinale e montarle su vetrini di vetro.
  2. Deparafinizza e reidrata le sezioni, poi lava in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a temperatura ambiente.
  3. Incubare sezioni con perossido di idrogeno al 3% per 5 minuti per bloccare l'attività della perossidasi endogena. Lava le sezioni con PBS
  4. Esegui il recupero dell'antigene riscaldando le vetrine in tampone di citrato di sodio (pH 6,0) per 10–15 minuti. Lascia raffreddare i vetri per 30 minuti, poi lava con PBS.
  5. Incubare nuovamente le sezioni con perossido di idrogeno al 3% per 15 minuti per garantire una completa inibizione della perossidasi. Lava le sezioni con PBS.
  6. Applica una soluzione bloccante per 10 minuti per ridurre il legaggio non specifico. Incubare le sezioni durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro Nrf-2 (diluizione 1:100) e Keap-1 (diluizione 1:200). Lava le sezioni con PBS dopo l'incubazione.
  7. Incubare sezioni con un anticorpo secondario adatto per 30 minuti a temperatura ambiente. Lava le sezioni con PBS.
  8. Applicare streptavidina–perossidasi alle sezioni e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata (mantenere un'umidità relativa del 95–100% utilizzando una scatola di incubazione sigillata contenente carta filtrante inumida). Lavare le sezioni con PBS dopo l'incubazione.
  9. Applicare il cromogeno DAB e monitorare lo sviluppo dei colori al microscopio luminoso al 100× ingrandimento. Ferma la reazione risciacquando i vetrini con acqua del rubinetto.
  10. Controcolora le sezioni con ematossilina diluita 1:9 per 5 minuti a temperatura ambiente. Risciacqua accuratamente con PBS e acqua distillata. Monta le sezioni usando un mezzo di montaggio permanente.
  11. Esamina le sezioni colorate al microscopio ottico. Cattura fotomicrografie a ingrandimento ×400 da 16 campi rappresentativi per sezione.
  12. Quantificare l'immunoreattività di Nrf-2 e Keap-1 utilizzando software di analisi delle immagini. Registra e analizza i dati quantificati per ulteriori valutazioni statistiche.
  13. Per l'analisi immunoistochimica, apri le immagini in ImageJ e calibra usando lo strumento Set Scale. Converti tutte le immagini in scala di grigi a 8 bit per standardizzare le misurazioni di intensità. Definisci manualmente le regioni di interesse (ROI) per le aree positivamente colorate e le regioni di fondo adiacenti e salvale nel ROI Manager.
  14. Quantificare l'intensità della colorazione usando una deconvoluzione cromatica H-DAB consistente, seguita da parametri di soglia identici su tutti i campioni. Misura il valore medio di grigio, la densità ottica e la percentuale di area positiva.
  15. Per l'analisi basata su cellule, si trattano le immagini con soglia di segmento usando lo strumento Watershed e si quantificano le cellule positive usando Analyze Particles. Tutti i dati sono stati esportati come file .csv per l'analisi statistica.

8. Analisi statistica

  1. Esegui analisi statistiche utilizzando SPSS versione 29.0. Inserisci i dati grezzi nella scheda Data View, con ogni riga che rappresenta un singolo animale e variabili definite nella scheda Variable View; il gruppo sperimentale era codificato come variabile categoriale (Control, TQ, DTM e DTM+TQ).
  2. Valuta la normalità dei dati utilizzando il test di Shapiro–Wilk selezionando Analizza > Statistiche Descrittive > Esplora, assegnando variabili di risultato alla Lista dei Dipendenti e Gruppo alla Lista dei Fattori, e abilitando i grafici di normalità con i test. Per le variabili normalmente distribuite, effettuare confronti di gruppo utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) tramite Analizza > Confronta le Medie > ANOVA Unidirezionale, con statistiche descrittive e il test di Levene per l'omogeneità delle varianze abilitati sotto Opzioni.
  3. Quando è stato rilevato un effetto principale significativo, applicare il test post hoc di Tukey tramite il menu Post Hoc per identificare le differenze tra i gruppi a coppie. Utilizzare i risultati del test di Levene per confermare l'omogeneità della varianza (p > 0,05).
  4. Per i dati di punteggio istopatologico che non soddisfano le ipotesi parametriche, eseguire un'analisi non parametrica utilizzando il test di Kruskal–Wallis selezionando Analizza > Test Non Parametrici > dialoghi legacy > K campioni indipendenti, seguito dal test post hoc di Dunn con correzione di Bonferroni utilizzando il modulo di test non parametrico Independent Samples.
  5. Esportando i risultati statistici e le tabelle riassuntive come file .xls o .csv, i risultati sono stati espressi come media ± deviazione standard (SD), e un valore p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Risultati

Misurazioni del peso corporeo
Il peso corporeo è stato registrato nei giorni 1, 10, 20 e 30. I ratti dei gruppi C e TQ hanno mostrato un aumento progressivo del peso corporeo durante il periodo sperimentale, senza differenze significative tra questi gruppi al giorno 30. Al contrario, i ratti esposti al DTM hanno mostrato una significativa riduzione del peso corporeo rispetto ai controlli. La co-somministrazione di TQ ha attenuato la perdita di peso associata al DTM. N...

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Discussione

Questo studio dimostra che l'esposizione orale subcronica al DTM induce alterazioni comportamentali, biochimiche, molecolari e istopatologiche costanti nei ratti e che il TQ mitiga efficacemente questi effetti se somministrato contemporaneamente. Integrando test comportamentali standardizzati con il profiling dello stress ossidativo, l'analisi a livello di percorso della segnalazione Keap-1/Nrf-2 e la valutazione istopatologica, il protocollo fornisce un quadro solido e riproducibile per...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse o interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
5,5'-Dithiobis (2-acido nitrobenzoico)Thermo Scientific & nbsp;  69-78-3 
Centrifuga da banco NF048Nü ve43560
Beta_Actin ThermoFisher Scientific, Stati Uniti7D2C10
Soluzione BSA  Proteintech, Stati Uniti)66201-1-IG
Butilato idrossitolueneSigma Aldrich128-37-0
Dijital Homojenizatö R Daihan Scientifichttps://www.artlaboratuv
arcihazlari.com/urun/dai
han-hg-15d-dijital-homoje
nizator-set-a?srsltid=Afm
BOorx_az06ulcHpSzKZs
uP8-47Za4BkvLOM22Xh
p00tgwWhJ-86Vc
DTM   Bayer TR01426058O
Ematossilina e dash; eosina Bio OpticaW01030708
Acido cloridricoMerck7647-01-0
Programma software Image J NIH; Washington, Stati Unitihttps://imagej.net/ij/
Kit di colorazione immunoistochimica  Sistema di rilevamento a grande volume Lab VisionTM UltraVisionTM: antipolivalenteHRP, TA-125-HL
Leica Autocut 14051956472Germaniahttps://www.leicabiosystems
.com/istologia-attrezzature/mi
crotomi/istocore-autocut/
Microscopio luminoso Nikon, Eclipse  Ni-U, 940728
N-(1-Naftil)etilendiaminaThermo Scientific & nbsp;1465-25-4
Nano Microplate ReaderBMG LABTECHSPECTROstar Nano
soluzione salina tamponata fosfato  MerckP4417
Anticorpi primari Keap-1 ProteintechCatalogo n. 10503-2-AP, 1:200
Anticorpi primari Nrf-2 ProteintechCatalogo n. 16396-1-AP, 1/100
Kit per il saggio BR della proteina Qubit & nbsp;ThermoFisher Scientific-INVITROGENQ33211
Citrato di sodioMerck03-04-6132
Dodecile solfato di sodioThermo Scientific & nbsp;151-21-3
Idrossido di sodioMerck1310-73-2
Nitrato di sodioMerck7631-99-4
Sreptavidina Peroxidasi Thermo Scientific & nbsp;SHRP248-B
SulfanilamideThermo Scientific & nbsp;  63-74-1 
acido tiobarbiturico  Merck504-17-6
TQ CAYMAN 490-91-5
Acido tricarbalico, 99%Chimici Termoscientifici  139360500
Acido tricloroaceticoChimici Termoscientifici76-03-9
Tris-HClThermo Scientific & nbsp;  1185-53-1 
Cloruro di vanadio(III)Sigma Aldrich7718-98-1
Substrato chemiluminescente West Pico PLUS e iBright 750 Sistema scientifico Thermo Fisherhttps://www.clinxsci.com/product
/mini_chemiluminescence_imagi
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aid=0AAAAAoN6UOOtoB8UD0d
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LS1GqllMuNgkrFYDaW7yK585njQ
jFja485Fkwj9lRUEKDBoCgLoQA
vD_BwE
Soluzione di solfato di zincoMerck7733-02-0

Riferimenti

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