Analisi spettrale Raman assistita da machine learning del nanosensore ssDNA-SWCNT rispondente alla serotonina per migliorare la selettività contro la dopamina

Summary

Il protocollo descrive l'analisi spettrale Raman di un nanosensore SWCNT avvolto in ssDNA, che consente una misurazione selettiva migliorata della serotonina rispetto alla dopamina con l'assistenza di un modello di apprendimento automatico.

Abstract

La serotonina (5-idrossitriptamina, 5-HT) svolge ruoli fondamentali nella neuromodulazione, tuttavia i metodi di rilevamento attuali faticano a fornire una rilevazione in tempo reale della 5-HT con alta sensibilità e selettività. In precedenza avevamo sviluppato un nanosensore di serotonina nel vicino infrarosso (nIRHT), che consiste in nanotubi di carbonio a parete singola avvolti in ssDNA che rilevano sensibilmente il 5-HT. Tuttavia, la risposta di fluorescenza del nIRHT non può discriminare tra 5HT e dopamina (DA), limitandone le applicazioni pratiche. In questo studio, la spettroscopia Raman combinata con il machine learning supera questa sfida di selettività. Le caratteristiche spettrali della banda G hanno rivelato firme distinte per il legame 5HT rispetto a quello DA al nIRHT, con DA che provoca una maggiore soppressione della banda G. Abbiamo utilizzato il Raman differenziale (ΔRaman) per isolare i cambiamenti spettrali specifici dell'analita e addestrato tre modelli di machine learning per la classificazione. Il modello di foresta casuale con ΔRaman ha raggiunto prestazioni ottimali con il 95,8% di accuratezza, superando significativamente i modelli che utilizzano spettri Raman grezzi. Questo approccio ha mostrato una specificità migliorata, con risposte trascurabili ad acetilcolina, GABA e glutammato, e ha raggiunto un limite di rilevamento di 0,1 μM adatto per applicazioni fisiologiche. Questo approccio basato su Raman trasforma il sensore di fluorescenza nIRHT non selettivo in una piattaforma capace di una robusta discriminazione dei neurotrasmettitori, superando i problemi di selettività nel sensore molecolare basato su nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNT).

Introduction

La serotonina (5-idrossitriptamina, 5-HT) è un neurotrasmettitore fondamentale che regola l'umore, la cognizione, il sonno e l'appetito, con disfunzioni implicate in depressione, ansia e altri disturbi^{neuropsichiatrici 1}. Il monitoraggio in tempo reale della dinamica della serotonina nei sistemi biologici rimane una sfida a causa della scala temporale di millisecondi della trasmissione sinaptica e dell'ambiente chimico complesso del tessuto^{neurale 2}. Nonostante i notevoli progressi nelle tecnologie di rilevamento dei neurotrasmettitori, raggiungere sia un'elevata sensibilità che una selettività molecolare per la serotonina continua a rappresentare notevoli sfide analitiche.

I metodi attuali di rilevamento della serotonina spaziano dalle tecniche analitiche tradizionali alle nuove piattaforme di nanosensori. La cromatografia liquida ad alte prestazioni con rilevamento elettrochimico (HPLC-ED) rimane lo standard d'oro, raggiungendo limiti di rilevamento di 0,056 nM con eccellente^{riproducibilità 3}. Tuttavia, l'HPLC richiede una preparazione estesa del campione e tempi di analisi da 15-30 minuti, impedendo il monitoraggio in^{tempo reale 4}. La voltametria ciclica a scansione rapida (FSCV) consente una risoluzione temporale subsecondaria ai microelettrodi in fibra di carbonio, ma soffre di incrostamento degli elettrodi e selettività limitata tra neurotrasmettitori strutturalmente^{simili 5,6}. Gli sviluppi recenti nei sensori fluorescenti codificati geneticamente, inclusi iSeroSnFR⁷ e GRAB-5HT⁸, raggiungono una sensibilità e una gamma dinamica notevoli ma richiedono modifiche genetiche dei tessuti bersaglio, limitando così la traduzione clinica.

I sensori ottici a nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNT) sono emersi come piattaforme promettenti per il rilevamento di neurotrasmettitori senza^{marcatura 9}. Gli SWCNT funzionalizzati dal DNA mostrano modulazione di fluorescenza nel vicino infrarosso (nIR) al momento del legame dell'analita, consentendo la rilevazione nella finestra trasparente al tessuto (900-1400 nm^)10,11. Il gruppo di Landry ha sviluppato il sensore nIRHT attraverso l'evoluzione sistematica dei liganti tramite arricchimento esponenziale (SELEC), selezionando ~10¹⁰ sequenze uniche di ssDNA per identificare costrutti rispondenti alla^{serotonina 12}. Questo sensore raggiunge una sensibilità ai micromolari con un aumento della fluorescenza del 200% al momento del legame alla serotonina, operando indipendentemente dall'ossidazione di dopamina o serotonina. Per escludere interferenze ossidative, il nostro studio precedente ha confermato la stabilità di queste soluzioni neurotrasmettitrici; Le analisi UV-Vis e NMR non hanno rivelato cambiamenti ossidati o nuove formazioni di picco rispetto al puro 5HT¹². Inoltre, il breve tempo di incubazione e le condizioni di pH neutro utilizzate nel sistema sono progettate per prevenire la formazione significativa di chinoni. Analogamente, il gruppo Strano ha stato pioniere nel riconoscimento molecolare in fase corona (CoPhMoRe), dimostrando che gli SWCNTs avvolti in (GT)₁₅ rilevano dopamina a concentrazioni^{11 nM 13}. Il nostro gruppo ha recentemente fatto avanzare questo campo attraverso l'ottimizzazione guidata dal machine learning, ottenendo miglioramenti di sensibilità di 2,5 volte grazie allo screening ad alto rendimento di sequenze sistematicamente^{mutate 14}.

Nonostante questi progressi, persiste una limitazione fondamentale nella selettività insufficiente tra serotonina e dopamina. Entrambi i neurotrasmettitori contengono anelli aromatici e catene etilaminghiche, che differiscono solo per un singolo gruppo^{idrossile 15}. I sensori SWCNT attuali basati su fluorescenza tipicamente raggiungono rapporti di selettività inferiori a 5:1, inadeguati per distinguere neurotrasmettitori co-rilasciati in ambienti^{sinaptici 16}. Questa sfida di selettività è particolarmente critica dato che serotonina e dopamina spesso colocalizzano nelle regioni cerebrali che governano ricompensa e^{motivazione 17}.

La spettroscopia Raman offre informazioni chimiche complementari tramite l'analisi delle modalità vibrazionali del complesso^{SWCNT-analita 18}. La banda G (~1580 cm⁻¹) degli SWCNT si divide in componenti G⁺ e G⁻, con frequenze sensibili all'adsorbimento molecolare e al doping^{elettronico 19}. Uno studio precedente ha dimostrato che i tensioattivi non covalenti su SWCNT inducono cambiamenti spettrali Raman distinti nella regione^{della banda G 20}.

In questo lavoro, dimostriamo l'analisi spettrale Raman assistita da machine learning del sensore nIRHT per ottenere una maggiore selettività tra serotonina e dopamina. Abbiamo caratterizzato sistematicamente risposte Raman dipendenti dalla concentrazione da 0,01 a 100 μM, rivelando impronte spettrali distinte per ciascun neurotrasmettitore. Tre modelli di machine learning — reti neurali convoluzionali (CNN), support vector machine (SVM) e foresta casuale (RF) — sono stati addestrati su dataset spettrali per classificare l'identità dell'analita. In modo fondamentale, introduciamo il processamento Raman differenziale, che rimuove i segnali di base per isolare le caratteristiche specifiche dell'analite. Il modello RF ottimizzato con elaborazione DR raggiunge un'accuratezza di classificazione del 95,8%, rappresentando un significativo progresso nella discriminazione molecolare. Questo approccio multimodale, che combina sensibilità alla fluorescenza nIR con specificità chimica Raman, offre un percorso verso il monitoraggio selettivo e in tempo reale della serotonina in ambienti biologici complessi.

Protocol

1. Fabbricazione di nanosensori SWCNT nIRHT funzionalizzati con ssDNA

1. Combinare 1 mg di nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNT), 100 μL di 1 mM di E6#9 ssDNA e 900 μL di 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) in un tubo da 1,5 mL.
   ATTENZIONE: La polvere di SWCNT secca rappresenta un potenziale rischio per l'inalazione. Maneggia la polvere all'interno di una cappa chimica certificata e indossa l'attrezzatura di protezione individuale adeguata, inclusa maschera e guanti.
2. Disperdere la miscela usando un sonicatore da bagno per 5 minuti. Sonicare la miscela utilizzando un sonicatore a punta dotato di una sonda da 3 mm al 50% di ampiezza per 30 minuti in un bagno di ghiaccio.
3. Centrifugare la soluzione sonicata a 21.500 x g per 1 ora per precipitare SWCNT non dispersi. Raccogliere con cura 850 μL del sovrantantante e trasferirlo in un nuovo tubo.
4. Misurare l'assorbanza della sospensione SWCNT raccolta a una lunghezza d'onda di 632 nm. Calcola la concentrazione utilizzando il coefficiente di estinzione SWCNT di 0,036 (mg/L)⁻¹ cm⁻¹. Conserva la soluzione finale del sensore nIRHT a 4 °C fino a un ulteriore utilizzo.

2. Misurazione degli spettri Raman

1. Carica 90 μL della dispersione nIRHT da 10 mg/L in una piastra a 96 pozzi. Misurare lo spettro Raman del sensore in un buffer PBS utilizzando una sorgente di eccitazione laser da 532 nm. Imposta questo spettro registrato come base.
   ATTENZIONE: È fondamentale mantenere rigorosamente la potenza laser a 10 mW e la lunghezza d'onda a 532nm quando si studiano campioni biologici vivi. Potenze laser più elevate possono indurre una fototossicità grave e compromettere la vitalità cellulare. Il laser a 532 nm a 10 mW utilizzato in questo protocollo è stato ben consolidato come sicuro e non distruttivo per l'analisi delle cellule vive, preservando gli organi^{sensibili 21} e l'attività elettrofisiologica dei neuroni^{primari 22} , garantendo al contempo un'acquisizione robusta del segnale Raman.
2. Aumentare ogni soluzione sensore da 90 μL (10 mg/L) con 10 μL della soluzione dell'analita per raggiungere concentrazioni finali di 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 50 e 100 μM. Attendere 5 minuti dopo l'aggiunta dell'analita per consentire un'incubazione sufficiente.
3. Misura gli spettri Raman dei campioni incubati. Prepara i campioni in triplicata per ogni concentrazione e ripeti i passaggi da 2.1 a 2.2 per garantirne la riproducibilità.

3. Analisi dei dati basata su machine learning

1. Costruire il dataset da un totale di 208 spettri Raman, comprendenti 77 risposte alla dopamina (DA), 76 risposte alla serotonina (5HT) e 47 risposte al gruppo di controllo (PBS).
2. Eseguire la sottrazione di fondo sulla regione in banda G dei dati spettrali. Normalizzare i dati sottratti dal fondo basandosi sul picco della banda G+.
3. Applica un filtro mediano per ridurre il rumore negli spettri normalizzati. Isolare i cambiamenti spettrali (ΔRaman) sottraendo lo spettro di controllo normalizzato da ciascuno spettro trattato con analiti.
4. Sviluppare un modello di Rete Neurale Convoluzionale (CNN), una Foresta Casuale (RF) e una Macchina a Vettori di Supporto (SVM) per la classificazione ternaria di 5HT, DA o il controllo.
5. Dividere l'intero dataset in set di addestramento, validazione e test usando un rapporto 6:2:2.
6. Configura l'architettura CNN con tre strati di convoluzione 1D utilizzando una funzione di attivazione ReLU e una dimensione massima di pooling di 2, seguita da due livelli completamente connessi.
7. Configurare la SVM utilizzando un kernel di Radial Basis Function (RBF) per una classificazione non lineare.
8. Configura il modello RF usando iperparametri predefiniti.
9. Addestrare i modelli costruiti utilizzando la validazione incrociata a 5 punti. Calcola le metriche medie di performance su tutte e 5 le partite per garantire la robustezza statistica.
10. Seleziona il modello che fornisce la massima accuratezza sui dati di validazione per l'analisi finale.
11. Valuta il modello selezionato nel set di test per verificarne la capacità di generalizzazione.
12. Determinare il limite indiretto di rilevamento (LOD) escludendo sequenzialmente i dati dell'insieme di addestramento che scendono sotto una soglia di concentrazione di 0,1 μM.
13. Testare il modello addestrato sull'intero intervallo di concentrazione, incluse le concentrazioni al di sotto dei criteri, per stabilire il LOD finale.

Results

Il nanosensore SWCNT funzionalizzato con ssDNA E6#9 (nIRHT), precedentemente sviluppato tramite la metodologia SELEC, dimostra un potenziamento reversibile della fluorescenza nIR durante il legame con 5HT, consentendo immagini 5HT in vitro in tempo reale e ex^{vivo 12}. La sequenza E6#9 (5'-CCCCCCAGCACCACAGCACACCCCCCCCC-3') avvolge gli SWCNT per creare siti di legame per il 5HT. Tuttavia, questo sensore manca di specificità: sia il 5-HT che il DA co...

Discussion

L'analisi spettroscopica Raman ha fornito un miglioramento significativo della specificità del sensore nIRHT, una capacità non raggiungibile con la sua risposta a fluorescenza convenzionale. Abbiamo osservato che la DA induceva una soppressione più pronunciata della banda G⁻ (1570 ^cm-1) rispetto alla 5HT. Queste firme differenziali probabilmente derivano da diverse orientazioni molecolari e geometrie di legame sulla superficie SWCNT. In particolare, la parte di catecolo di DA ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HiPCo raw	Nanointegris
iDus1.7 InGaAs	ANDOR	DU490A-1,9
Ramantouch	Nano Fotone
Vibra Cell 130	SONICS