Articolo metodologico

Imaging a risonanza magnetica multianimale per misurazioni tumorali in modelli topini di cancro al pancreas

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DOI:

10.3791/69927

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3 febbraio 2026

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1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 3Veterinary Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine, Michigan State University, 4Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Biomedical Imaging, Advanced Molecular Imaging Facility, Michigan State University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo utilizza un letto a più camere per immagini a risonanza magnetica parallela (MRI) di fino a quattro animali al fine di rilevare tumori adenocarcinomi pancreatici in modelli murini geneticamente modificati. Questo protocollo di risonanza magnetica multi-animali è rapido ed economico per la rilevazione e la misurazione dei tumori, facilitando la selezione degli animali per studi preclinici e il monitoraggio longitudinale della crescita tumorale.

Abstract

Le modalità avanzate di imaging in vivo , come la risonanza magnetica (MRI), sono strumenti di ricerca essenziali per rilevare efficacemente i tumori nei modelli murini preclinici. La risonanza magnetica fornisce informazioni anatomiche dettagliate sulla localizzazione e dimensione del tumore. Tuttavia, questa modalità di imaging è costosa e richiede molto tempo. Per superare questa barriera di accesso senza compromettere la qualità delle imaging, è stato implementato un protocollo MRI multi-animali. Questo protocollo utilizza un inserto a quattro camere per ottenere risonanze anatomiche ad alta risoluzione di risonanza magnetica multianimale all'interno di una singola sessione di acquisizione. Immaginare contemporaneamente più topi riduce il tempo e i costi di questa procedura. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di risonanza magnetica multianimale progettato per aumentare l'efficienza della rilevazione e del monitoraggio longitudinale del tumore in un modello murino geneticamente modificato da Kras, p53-deleto (KPC), di adenocarcinoma del conduto pancreatico. Questo modello KPC clinicamente rilevante ben consolidato ha fornito preziose informazioni sui meccanismi molecolari alla base della carcinogenesi pancreasica, della progressione tumorale e della resistenza al trattamento. Come prova di concetto, questo protocollo viene applicato per convalidare il beneficio terapeutico dell'agente chemioterapico standard gemcitabina nel modello KPC. Le future applicazioni di questo progetto preclinico guidato dalla risonanza magnetica vengono brevemente discusse per valutare l'efficacia terapeutica delle terapie combinate.

Introduzione

L'adenocarcinoma del pancreas dottale (PDAC) rimane uno dei tumori maligni più letali. Nonostante modesti miglioramenti nella sopravvivenza negli ultimi anni, il tasso di sopravvivenza a 5 anni è ancora solo del 13%1. Nella maggior parte dei casi, il PDAC viene rilevato in uno stadio avanzato, spesso coinvolgendo invasioni locali o metastasi lontane, il che complica il trattamento. La malattia è biologicamente diversificata e caratterizzata da cellule tumorali altamente invasive, uno stroma desmoplastico denso e una scarsavascolarizzazione 2,3,4. Questo complesso microambiente tumorale continua a ostacolare gli sforzi per caratterizzare pienamente i componenti cellulari e non cellulari che influenzano la progressione della malattia. Per affrontare questo problema, sono necessari modelli preclinici efficaci che imitino da vicino la progressione della malattia umana e la desmoplasia.

Una varietà di modelli murini può essere utilizzata per studiare la biologia della progressione del cancro e valutare l'efficacia di nuoveterapie 5,6. Il modello murino geneticamente ingegnerizzato (GEMM) guidato da KRas sviluppa spontaneamente tumori pancreatici che riproducono molte caratteristiche fisiopatologiche e molecolari del PDACumano 3,7,8,9,10,11. In particolare, il modello KPC guidato da Kras, eliminato da p53 (LSL-KrasG12D; p53lox/+; Pdx1-Cre) è un PDAC ben caratterizzatoGEMM 7,8,9. L'imaging tumorale è una componente importante degli studi preclinici. La rilevazione e la misurazione della dimensione tumorale consentono la selezione degli animali per studi preclinici, il monitoraggio longitudinale della crescita e della progressione della malattia tumorale e la valutazione della risposta terapeutica.

Modalità avanzate di imaging in vivo come l'ecografia (USA), la bioluminescenza (BLI), la tomografia computerizzata (CT), l'imaging a fluorescenza (FLI), la tomografia a emissione di positroni (PET) e l'imaging a risonanza magnetica (MRI) possono essere utilizzate per l'imaging tumorale nel modello KPC e nei modelli simili PDAC 12,13,14,15,16. Tuttavia, l'imaging tumorale nel modello KPC può essere impegnativo, e ciascuna di queste modalità di imaging offre punti di forza e limitazioni uniche. Le tecnologie di imaging ottico, come la bioluminescenza (BLI) e l'ecografia (US), sono non invasive ed economicamente vantaggiose. Tuttavia, la loro risoluzione spaziale limitata, in particolare per gli organi interni, può portare a una scarsa correlazione con i volumitumorali 12,15,17,18. La bioluminescenza richiede cellule geneticamente modificate che esprimano segnale di luciferasi, che dipende anche dalla somministrazione del substrato, dal flusso sanguigno e dall'ossigenazione dei tessuti. Un tomografo computerizzato fornisce immagini rapide con artefatti di movimento minimi ma scarso contrasto dei tessuti molli senza agenti di contrasto. Il contrasto iodrato può causare tossicità nei topi. L'imaging a fluorescenza richiede agenti di contrasto/sonde fluorescenti, e l'autofluorescenza dagli organi addominali riduce la sensibilità.

A causa dei vincoli associati ad altri metodi di imaging, l'imaging a risonanza magnetica (MRI) è generalmente considerata la tecnica più affidabile per valutare tumori profondi, offrendo un contrasto dei tessuti molli superiore e una sensibilità molecolare per le strutture anatomiche interne 13,14,15,19. Tuttavia, i protocolli standard della risonanza preclinica comportano elevati costi operativi e lunghi tempi di acquisizione e possono rappresentare un ostacolo per molti laboratori di ricerca. La risonanza magnetica multianimale può superare questa barriera di accesso riducendo i tempi di preparazione degli animali pre-scansione (anestesia), i tempi di scansione e il recupero post-scansione. Questo protocollo dimostra la fattibilità tecnica dell'imaging tumorale PDAC (Figura 1, Figura 2, Figura 3 e Figura 4) e l'uso dei risultati delle immagini per reclutare animali per il trattamento chemioterapico con gemcitabina (Figura 5). I tumori PDAC mostrano molteplici meccanismi intrinseci che contribuiscono alla resistenza agli agenti chemioterapici standard (SOC). come gemcitabina, gemcitabina/nab-paclitaxel o FOLFIRINOX 2,3,4. Questo protocollo fornisce una piattaforma adatta e solida per valutare nuovi agenti terapeutici e la chemioterapia SOC al fine di trovare combinazionipromettenti 20,21,22,23,24,25,26,27 che potrebbero migliorare la risposta terapeutica nei pazienti.

Protocollo

Tutti gli esperimenti descritti sono stati condotti in conformità con i protocolli approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali della Michigan State University. Tutte le procedure che coinvolgono animali vivi rispettano le linee guida stabilite per garantire il benessere e il trattamento umano degli animali. Questo protocollo descrive l'uso e il trattamento del modello topino KPC del PDAC: LSL-K-Ras G12D (Krastm4Tyj); p53lox/lox (Trp53tm1Brn); Pdx1-Cre (Pdx1-cre6Tuv)9.

1. Preimaging della preparazione animale

  1. Assicurarsi una corretta verifica della genotipizzazione dei topi KPC prima dell'uso. Trasportare topi sperimentali dalla struttura animale all'impianto di imaging.
  2. Anestesiare fino a quattro topi in una camera di induzione sigillata preriscaldata con isoflurano all'1,5-2% e 0,8-2 L/min di ossigeno. Confermare l'anestesia applicando uno stimolo nocivo (pizzicamento delle dita dei piedi).
  3. Applicare lubrificante oftalmico su entrambi gli occhi di ogni topo per prevenire la disidratazione corneale.

2. Installazione di letto MRI multi-animali

  1. Posiziona due topi anestetizzati in posizione ventrale sulla parte inferiore (sinistra e destra) dell'inserto del letto stampato in 3D, che è fissato al supporto standard per la scansione PET/MRI fornito dal fornitore dal fornitore. Assicurati che gli animali siano posizionati con spine e arti dritti.
    NOTA: Una stampante 3D è stata utilizzata per stampare gli inserti del piano (Supplemental File 1 e Supplemental File 2).
  2. Collega l'ingresso d'aria nel piano del fornitore ai coni anteriori usando tubi (diametro interno 1/16", diametro esterno 1/8"), e raccordi luer (ad esempio, 7 connettori maschio 1/16", 2 connettori femmina 1/16", 2 connettori femmina-femmina, 2 connettori T da presa a presa).
  3. Fissare la testa del topo in un cono nasale per mantenere l'anestesia (1,5-2% isoflurano, 0,8-2 L/min ossigeno). Copri il basso con la parte superiore degli inserti del letto stampati in 3D (Figura 2B).
  4. Posiziona gli altri due topi anestetizzati in posizione ventrale sulla parte superiore (sinistra e destra) dell'inserto del letto stampato in 3D.
  5. Fissare la testa del topo in un cono nasale per mantenere l'anestesia (1,5-2% isoflurano, 0,8-2 L/min ossigeno).
  6. Attacca il pad di monitoraggio respiratorio al mouse in alto a sinistra. Assicurati che il pad di monitoraggio sia al livello dell'addome, non del torace, per misurare la respirazione senza un segnale dal battito cardiaco.
  7. Imposta il livello di isoflurano per mantenere una frequenza respiratoria di 30-40 bpm durante tutta la scansione, tipicamente 1,5-2%. Se la traccia respiratoria non è visibile o l'ampiezza è troppo bassa, assicurati che il pad sia ben tenuto in posizione dal nastro e che tutte le connessioni nel tubo siano ben strette.
  8. Copri il letto per completare la camera della risonanza magnetica multi-animali (Figura 2B).
    NOTA: Il letto PET/MRI fornito dal fornitore è dotato di aria calda circolante per mantenere la temperatura corporea degli animali (~35-37 °C). Fino a quattro mouse possono essere scansionati simultaneamente con inserti stampati in 3D. Le impostazioni esatte della temperatura dell'acqua calda, così come le velocità di ingresso e di scarico dell'aria, dipenderanno dall'impianto in ciascun sito, inclusa la distanza dalla sala di controllo alla risonanza magnetica. Questi possono essere installati in ogni sito tramite una serie di scansioni pilota in cui la temperatura viene monitorata per tutto il percorso e poi standardizzata per ogni studio.

3. Configurazione della prescansione e calibrazione dell'imaging

  1. Assicurati che i topi siano al centro della bobina della risonanza magnetica nel senso della lunghezza allineando il laser rosso con il centro del letto multicamera prima di inviare il supporto del letto nel canno.
  2. Assegna un'etichetta alla scansione usando l'ID del mouse e la data della scansione nel seguente formato: Sforzo, ID Mouse, Data della scansione.
  3. Impostare una scansione FLASH ponderata T1 con una fetta assiale, due fette coronali e due fette sagittali per visualizzare i topi nel letto a quattro camere e definire l'area di imaging usando le seguenti impostazioni: TR/TE 50/2,4 ms, 2 medie, angolo di inversione 20°, risoluzione 0,313 mm, spessore della fetta di 1 mm, tempo di scansione 13 s.
  4. Verifica che tutto il corpo del mouse sia nel campo visivo e che i topi siano dritti. Se no, ripeti i passaggi di posizionamento del mouse e/o sposta il letto del mouse dentro o fuori dal canone.
    NOTA: Questi parametri si basavano sulle specifiche del sistema MRI utilizzato. Questi parametri possono essere regolati secondo necessità per ottimizzare l'acquisizione dell'immagine in base ai requisiti sperimentali e/o alle capacità del sistema di risonanza magnetica.

4. Imaging per risonanza magnetica multi-animale

  1. Configurare la sequenza di eco rapida di rotazione ponderata T2 con i seguenti parametri: Tempo di ripetizione (TR): 3.200 ms, Tempo di eco: 46 ms, Numero di medie: 10, Risoluzione in piano: 300 x 300 μm, Numero di fette coronali: 14, Gap intraslice: 0,3 - 0,7 mm, Soppressione del grasso: Abilitata, Fattore raro: 8, pacchetti di slice: 2, Tempo totale di acquisizione dell'immagine: 14 min.
  2. Clicca sul centro (traslazione) e sul bordo (rotazione) delle caselle gialle e verdi nell'immagine localizzatrice per regolare la posizione del pacchetto a taglio secondo necessità per ottimizzare la copertura della regione del pancreas e di altri organi addominali per il gruppo superiore e inferiore degli animali.
  3. Conferma che tutti e quattro i topi siano correttamente allineati nella configurazione dei letti multianimali prima di procedere con la scansione.
  4. Monitorare la respirazione durante le sequenze di imaging e regolare il livello di isoflurano se necessario.
  5. Dopo il completamento della risonanza magnetica, verifica che la qualità dell'immagine sia adeguata. Cerca artefatto di movimento, che appare come sfocatura, se un mouse si è mosso durante la scansione. Controlla la copertura completa dell'addome. Se necessario, riposiziona i mouse e rifai la scansione.

5. Recupero del topo

  1. Quando la scansione è completata e verificata, rimuovere il letto dal sistema di risonanza magnetica.
  2. Apri la parte superiore del letto multicamera. Rimuovi il monitor respiratorio dal topo in alto a sinistra e trasferisci gli animali dalla parte superiore e inferiore degli inserti stampati in 3D nella gabbia di recupero.
  3. Posiziona gli animali in una gabbia di recupero sopra un cuscinetto riscaldante a 37 °C per il recupero post-anestesia.
  4. Monitorare la frequenza respiratoria e i movimenti per garantire un completo recupero dall'anestesia prima di riportare i topi nelle gabbie domestiche. I segni di recupero includono una respirazione e movimento normali (camminare).

6. Elaborazione e analisi dei file per risonanza magnetica

  1. Esporta le immagini DICOM dal software di risonanza magnetica a un programma di analisi per ritagliare le immagini da un'immagine con quattro mouse a un'immagine per ciascun singolo mouse.
  2. Nel software, apri l'immagine per il gruppo principale di animali nel modulo View . Le impostazioni automatiche di finestra/livello sono sufficienti, ma si può modificare nella scheda di controllo dell'immagine generale se necessario, così che i mouse siano visibili. Nella scheda VOI , disegna manualmente una casella generosa intorno al topo in alto a destra usando un oggetto analitico a cubo; poi ritaglia l'immagine attorno a quella casella dalla scheda Operazioni di Mascheramento e Contouring . Quando si salva il nuovo file, si modifica i metadati DICOM e il nome del file con l'ID del mouse corretto; poi, ripeti per il mouse in alto a sinistra usando la stessa immagine, apri l'immagine per il set inferiore di mouse e ripeti il ritaglio e il salvataggio del ROI.
    NOTA: Il VOI non deve essere preciso.
  3. Usa un software di visualizzazione per risonanze magnetiche per analizzare le immagini memorizzate nei file DICOM.
  4. Analizza le tacche di imaging dal dorsale al ventrale o dal ventrale al dorsale. Individuare milza e stomaco per stabilire un contesto adeguato per l'identificazione di tumori pancreasi e/o pancreatici.
  5. Definisci "Regione di Interesse" (ROI) tracciando una linea sul confine del tumore ed esegui una segmentazione semiautomatica per calcolare il volume tumorale. Prendi nota delle cisti liquidiche e di altri ritrovamenti ipercromatici (Figura 3 e Figura 4).
    NOTA: Un visualizzatore di risonanza magnetica dovrebbe essere utilizzato per analizzare i file DICOM.

7. Trattamento con gemcitabina

  1. Eseguire scansioni RM settimanali sugli animali KPC fino a quando il tumore inizia a formarsi e può essere rilevato (volume di ≥20mm 3). Prima della scansione, assicurati che i topi siano in buona salute (nessuna perdita di peso eccessiva o segni di disagio, difficoltà respiratorie e/o ansimi).
  2. Stabilire un regime terapeutico una volta soddisfatti i criteri tumorali.
    NOTA: Per il gruppo trattato, la gemcitabina è stata iniettata intraperitonealmente (i.p.) a una dose di 100 mg/kg due volte a settimana.
    ATTENZIONE: La gemcitabina è un agente chemioterapeutico citotossico. Maneggiare con l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) appropriata, inclusi guanti e camice da laboratorio. Smaltire siringhe e materiali contaminati in conformità con i protocolli istituzionali per i rifiuti pericolosi.
  3. Eseguire le risonanze magnetiche (dopo le sezioni 1-6) una volta a settimana per monitorare la risposta tumorale alla gemcitabina.
  4. Sacrificare animali quando il tumore soddisfa i criteri di eutanasia basati sulle misurazioni di volume dell'analisi RM (Sezione 6) e/o su altri sintomi.
  5. Durante la risonanza magnetica dei topi trattati, si applica una barriera protettiva per prevenire il potenziale trasferimento dell'agente chemioterapico tramite le escrezioni. Durante e dopo aver lavorato con la gemcitabina, segui buone pratiche di igiene personale. Getta le siringhe vuote usate in un contenitore per articoli per chemioterapia.
  6. Dopo aver completato il lavoro, spruzzare tutta l'attrezzatura anestesia, i letti di risonanza magnetica e tutte le superfici di lavoro con etanolo al 70%. Inserire barriere protettive e guanti chimicamente contaminati durante l'imaging in un sacchetto di plastica, legare il sacchetto e metterlo in un barile di fibre per l'incenerimento.
  7. Programmare le sessioni di imaging prima del prossimo ciclo di trattamento per minimizzare l'esposizione all'agente chemioterapico.
    NOTA: Una frequenza di risonanza magnetica ogni due settimane può essere considerata a seconda del tasso di crescita tumorale e del regime di trattamento. Le risposte al trattamento tramite cinetica tumorale possono essere valutate tramite imaging longitudinale (Figura 5).

Risultati

Gli animali KPC sviluppano tumori pancreatici dopo le 12settimane di 9 anni. Utilizzando un letto di risonanza magnetica multicamera, lo screening tumorale dei topi KPC è stato avviato a 10 settimane di età. Ciò ha permesso di reclutare animali presenti con tumori di circa 200 mm3 per lo studio preclinico con il trattamento con gemcitabina. Sono state osservate differenze nella cinetica tumorale e variazioni nella presentazione tumorale. La maggior parte dei tumori KPC ha mostrato un solido schema di crescita con un focus unico o predominante (Figura 4A), il che ha facilitato il reclutamento animale per trattamenti e valutazione del volume tumorale. Tuttavia, sono stati osservati anche animali con molteplici piccoli tumori solidi diffusi in tutto il pancreas (Figura 4A). Alcuni casi di PDAC possono anche presentare lesioni cistiche intratumorali piene di liquido, accompagnate da lesioni cistiche peritumorali non neoplasiche e da ritenzione di liquidi dovuta a un'ostruzione duttale della cistifellea e/o del pancreas. (Figura 4A).

Dopo il reclutamento, gli animali sono stati assegnati casualmente a due gruppi sperimentali: un gruppo di controllo che non ha ricevuto alcun trattamento e un gruppo trattato che ha ricevuto somministrazione intraperitoneale (i.p.) di gemcitabina a una dose di 100 mg/kg due volte a settimana. Dei 23 animali ammissibili in totale, 4 femmine e 7 maschi sono stati assegnati al gruppo di controllo, e 6 femmine e 6 maschi al gruppo trattato. Sono state effettuate risonanze magnetiche settimanali utilizzando il sistema multi-animali (Figura 5A), che ci ha permesso di monitorare continuamente i cambiamenti nella cinetica della crescita tumorale sia nel gruppo di controllo che in quello trattato (Figura 5B).

I dati di imaging processati dimostrano che i tumori nel modello KPC trattato con gemcitabina avevano un modello di crescita più lento rispetto al gruppo di controllo non trattato (Figura 5C), associato a un aumento statisticamente significativo (test Log rank, p = 0,04) della sopravvivenza complessiva della coorte trattata (Figura 5D). La sopravvivenza mediana per la KPC non trattata è stata di 20 settimane, mentre il gruppo trattato ha mostrato una prolungazione della sopravvivenza mediana di oltre 23 settimane (Figura 5D).

Figura 1
Figura 1: Flusso di lavoro della procedura di imaging a risonanza magnetica multi-animali, elaborazione e analisi delle immagini. I passaggi chiave del protocollo MRI multi-animali sono evidenziati, dalla preparazione della prescansione agli studi preclinici guidati da immagini. Fino a 4 animali vengono anestetizzati in una camera di induzione (preparazione pre-scansione) e preparati per essere collocati in un letto multi-animali (configurazione di letto per risonanza magnetica multianimale). Un'immagine pre-scansionata degli animali in configurazione 2 x 2 (2 nel compartimento superiore, 2 nel compartimento inferiore) seguita da una scansione a risonanza magnetica (imaging RM). I dati di imaging di ogni animale vengono salvati come file individuali e analizzati indipendentemente (Analisi delle Immagini). La ricerca dell'immagine e la dimensione del tumore vengono utilizzate per selezionare gli animali per studi preclinici e monitorare la risposta al trattamento (studi preclinici). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2: Passaggi chiave per la risonanza magnetica multianimale dalla configurazione alla scansione. (A) Pannello superiore, assemblaggio del sistema personalizzato del letto MRI multianimal. Inserti per letto stampati su misura in 3D con porte anestesiche integrate si inseriscono in un supporto letto standard per PET/MRI per un singolo ratto. Pannello inferiore, questi inserti stampati in 3D dividono il letto in due camere, permettendo la visualizzazione simultanea di fino a quattro animali: gli animali 1 e 2 sopra l'inserto superiore, e gli animali 3 e 4 sopra quello inferiore. Sono mostrati i moduli trasversali e frontali modificati degli inserti della stampante 3D dal visore STL. (B) Collocamento sequenziale dei topi in un letto di risonanza magnetica multicamera (dall'alto verso il basso). Immagine in alto, due animali posizionati in posizione ventrale nella parte inferiore (a sinistra e a destra) dell'inserto stampato in 3D, che si trova all'interno del letto PET/MRI fornito dal fornitore. Immagine centrale, gli altri due mouse sono posizionati in posizione ventrale nella parte superiore (sinistra e destra) dell'inserto stampato in 3D; Il mouse posizionato sul lato sinistro dell'inserto superiore è dotato di un monitor respiratorio. Immagine in basso: assemblaggio completato di quattro animali con la copertina sopra. Tutti gli animali hanno le teste fissate in un cono nasale per mantenere l'anestesia (1,5-2% isoflurano, 0,8-2 L/min di ossigeno). Configurazione finale di tutti e quattro gli animali nel supporto letto per risonanza magnetica con somministrazione di anestesia, scaldabagno caldo e sistema di monitoraggio dei parametri vitali per consentire la scansione MRI e l'acquisizione dati di tutti gli animali in un'unica sessione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Raccolta e elaborazione dei dati da risonanze magnetiche multi-animali. (A) Vista rappresentativa (piano mediale) della risonanza magnetica iniziale di tutti e quattro gli animali. (B) Scansione MRI (piano dorsale) di tutti e quattro i topi in un letto multicamera: due topi posizionati in basso (3, 4) e due topi in alto (1, 2) degli inserti stampati in 3D. (C) Fascicolo MRI finale ad alta risoluzione di ogni singola scansione del mouse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Presentazioni diverse di tumori PDAC: una risonanza magnetica integrata e un'analisi istologica. (A) Immagine rappresentativa della risonanza magnetica (piano dorsale) che illustra la variabilità anatomica dei tumori PDAC (da sinistra a destra): pancreas normale, tumori multifocali con lesioni cistiche piene di liquido e massa tumorale solida. Gli organi anatomici sono codificati per colori come segue: stomaco (giallo), milza (verde), tumore (viola), accumulo di liquidi dovuto a ostruzione dei dotti (blu). Scala bianca barra = 1 cm. (B) Sezioni istologiche di tumori colorati con H&E insieme a classi cellulari basate su sovrapposizioni di classificatori addestrati assistiti da computer, che evidenziano le caratteristiche istopatologiche dei tumori allineate ai risultati della risonanza magnetica. Area del tumore (T) delineata in nero per tutti i campioni quando il tumore è presente. Le classi cellulari sono indicate nel colore: tessuto pancreatico normale (grigio), tumore (rosso) e cellule immunitarie (giallo). Barra nera in scala = 0,5 cm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: Applicazione della risonanza magnetica multianimale per il reclutamento animale e il monitoraggio della crescita tumorale durante il trattamento con gemcitabina. (A) Cronologia del disegno sperimentale: Animali (14+ settimane) sono stati reclutati dopo che una risonanza magnetica ha rilevato un tumore ≥ 200 mm3. I topi del gruppo trattato hanno ricevuto gemcitabina (100 mg/kg, i.p., b.i.w.) fino a raggiungere i criteri di eutanasia. Durante l'esperimento sono state effettuate risonanze magnetiche multianimali per monitorare la cinetica della crescita tumorale. (B) Immagini MRI rappresentative (piano dorsale) che mostrano la progressione tumorale di un animale dal gruppo non trattato e di un animale del gruppo trattato, dal giorno 0 fino all'ultimo giorno dell'esperimento (endpoint di sopravvivenza). Barra bianca = 1 cm. (C,D) Grafici che illustrano la cinetica della crescita tumorale (C, n = 4 [2 F, 2 M] vs. 4 [2 F, 2 M]) e la sopravvivenza complessiva (D, n = 11 [4 F, 7 M] vs. 12 [6 F, 6 M]) nel gruppo di controllo non trattato e trattato. La significatività statistica per le curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier è stata determinata dal test di rango logaritmico (Mantel-Cox) (* p < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fascicolo supplementare 1: File STL per la stampa 3D dell'inserto inferiore con porte anestesiche integrate che si adatta a un normale supporto letto PET/MRI per ratti singoli. Clicca qui per scaricare questo File.

File supplementare 2: File STL per la stampa 3D dell'inserto superiore con porte anestesiche integrate che si adatta a un normale supporto letto PET/MRI per ratti singoli. Clicca qui per scaricare questo File.

Discussione

Questo protocollo utilizza un letto standard PET/MRI per ratti singoli fornito dal produttore, modificato con inserti stampati in 3D su misura, che permettono la scansione simultanea di fino a quattro topi (Figura 1). Questa configurazione multi-animali riduce notevolmente non solo il costoso tempo di scansione della risonanza magnetica, ma anche la durata complessiva della procedura. Consente la preparazione parallela (anestesia, posizionamento a letto e carico a letto), la scansione e il recupero di quattro animali in un'unica seduta, rispetto al tempo aggiuntivo richiesto per preparare, scansionare e recuperare ogni animale individualmente in quattro sedute separate. L'installazione include anche singoli coni nasali per la somministrazione controllata di anestesia a ciascun animale, monitoraggio vitale dedicato per un animale e capacità integrate di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea di tutti i topi scansionati (Figura 2). Gli inserti stampati in 3D forniscono un allineamento coerente degli animali e migliorano la coerenza della segmentazione. Il monitoraggio respiratorio in tempo reale consente una valutazione continua e l'aggiustamento dell'anestesia durante la scansione, minimizzando così gli artefatti del movimento.

Questo protocollo è stato utilizzato per rilevare e monitorare longitudinalmente la progressione del tumore pancreatico nel modello KPC (Figura 5A-C) trattato con l'agente chemioterapico gemcitabina, fungendo da prova di concetto preclinico. La gemcitabina, da sola o in combinazione, è un trattamento di prima o seconda linea per i pazienti con cancro pancreatico locale ometastatico 28,29,30. Questi risultati sugli animali trattati con gemcitabina sono coerenti con i precedenti rapporti, che hanno anch'essi mostrato un beneficio per lasopravvivenza 31. Ancora più importante, questo protocollo fornisce una piattaforma adatta e robusta per studiare terapie combinate di nuovi agenti terapeutici e chemioterapia SOC nel modello KPC o in modelli simili di PDAC. Queste terapie combinate possono essere inibitori di piccole molecole, immunoterapia, siRNA, modulatori dell'attività dei microRNA e altri oligonucleotidi terapeutici contro bersagli molecolari chiave 20,21,22,23,24,25,26,27. Queste terapie combinate possono includere bersagli geneticamente modificati per comprendere la loro interazione con la chemioterapia SOC o altre terapie nelle prime fasi dellosviluppo 9,20,32.

Sebbene il focus di questo protocollo sia l'imaging del pancreas e di altri organi della cavità addominale, questo protocollo multi-animale e le sequenze MRI descritte possono essere applicati per la caratterizzazione anatomica di altri modelli murini di cancro, come il cancro al seno e il glioblastoma, o altre malattie che coinvolgono il rene e/oil fegato 33. Siamo a conoscenza di altri protocolli che descrivono la risonanza magneticamultianimale 18,34. Ad esempio, Dazai et al. hanno descritto la scansione della risonanza magnetica neuroanatomica di fino a settetopi 18. Sebbene questa configurazione permetta l'imaging cerebrale di sette animali, non consente il controllo individuale dell'anestetico e della temperatura per ciascun topo. La loro camera di alloggiamento è progettata per topi che pesano meno di circa 32 g; Al contrario, il nostro letto multicamera supporta una gamma più ampia di dimensioni corporee di topo. A seconda dell'organo previsto, del tempo di scansione e della risoluzione, il protocollo di Dazai et al. può offrire alcuni vantaggi rispetto a quello descritto qui.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato, in parte, dalla sovvenzione R01 CA258314 del National Cancer Institute e dalla MSU Tetrad Initiative for Interdisciplinary Research edizione 2024 della LFS. Siamo grati al Nucleo di Analisi Tissutale del Programma di Salute di Precisione MSU, all'Istituto per le Scienze e Ingegneria della Salute Quantitativa MSU/Struttura di Imaging Molecolare Avanzato del Programma di Salute di Precisione, alle Risorse Animali del Campus MSU, al Laboratorio Diagnostico Veterinario MSU e al Centro di Analisi e Mappatura Quantitativa dei Bioelementi (QBEAM) per il loro supporto tecnico.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Stampante 3D StratasysJ750 Per inserti per letti MRI multi-animali
Gemcitabina HClApexBioA1402-500Per iniezioni IP  
HOROSHOROShttps://horosproject.org/Per l'analisi della risonanza magnetica
IsofluranoCovetrus11695067772Per l'anestesia del topo
Vaporizzatore isofluranoSOMNI ScientificVS6002Per l'anestesia del topo
Siringhe di insulina U-100 a dosaggio bassoBD14-826-79Per iniezioni IP  
Accoppiamenti a tubo Luer Lock, tappi dritti in nylon, sbarbati per diametro diametro del tubo da 1/16" x7McMaster51525K521Per l'assemblaggio del letto per risonanza magnetica multi-animali
Accoppiamenti a tubo Luer Lock, spina, per tubo a bardo da 1/16" ID x2McMaster7466N11Per l'assemblaggio del letto per risonanza magnetica multi-animali
Connettore Luer maschio-maschio x2SAIMMLPer l'assemblaggio del letto per risonanza magnetica multi-animali
Sistema di monitoraggio e cancellazione compatibile con la risonanza magnetica per piccoli animaliSAIIModello 1030monitorare gli animali durante la risonanza magnetica
Adattatore letto per risonanza magneticaBrukerT150743Componente del letto per risonanza magnetica fornito dal fornitore
Bobina per risonanza, 72 mm diametro diametraleBrukerT20209V3Bobina per la risonanza magnetica fornita dal fornitore
Ratto medio multimodale con cullaBrukerT151629Letto per risonanza magnetica fornito dal fornitore
lubrificante oftalmico & nbsp;Covetrus75848Per l'uso durante l'anestesia
Software ParaVision 360Brukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/preclinical-imaging/paravision-360.htmlPer l'analisi della risonanza magnetica
PMOD 4.2Brukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/preclinical-imaging/pmod.htmlPer l'analisi della risonanza magnetica
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Stratasys Vero Clear resinaStratasysRGD810Per la fabbricazione di letto MRI multi-animale
Connettori presa a presa a T, tubo Luer Lock x2McMaster51525K443Per il letto per risonanza magnetica multi-animali  
tubo (diametro interno 1/16", diametro esterno 1/8")BrukerT12330Per l'assemblaggio del letto per risonanza magnetica multi-animali

Riferimenti

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