Analisi comparativa della struttura dell'RNA di trascrizioni nascenti e mature in Saccharomyces cerevisiae

Summary

La struttura secondaria dell'RNA è stata osservata principalmente in RNA maturo con metodi di sondaggio strutturale. Il sequenziamento co-transcriptional Structure Tracking (CoSTseq) unifica il funzionamento nucleare, che è stato utilizzato per studiare la posizione della polimerasi sull'RNA nascente, con il sondaggio strutturale. CoSTseq consente così l'osservazione della struttura secondaria dell'RNA nell'RNA sotto trascrizione attiva.

Abstract

Durante la trascrizione, l'RNA nascente inizia a accoppiarsi di basi mentre esce dalle polimerasi a RNA (Pols). Questa accoppiamento di basi consente la formazione di strutture di RNA che influenzano criticamente l'espressione genica a livello di elaborazione, traduzione e stabilità dell'RNA. I metodi consolidati per studiare la struttura secondaria dell'RNA sono limitati ai trascrizioni mature, mentre si sa poco sugli stati di ripiegamento. Inoltre, l'abbondanza relativamente inferiore (<'1%) e la natura transitoria dell'RNA nascente ne complicano l'isolamento e la caratterizzazione. Il co-transcriptional Structure Tracking (CoSTseq) sfrutta il run-on trascrizionale con la sondaggi biotina-NTP e dimetilsolfato (DMS) per acquisire simultaneamente la posizione Pol e lo stato di accoppiamento di basi dei trascritti nascenti. In Saccharomyces cerevisiae, CoSTseq fornisce le informazioni di sequenza e strutturali vicino all'estremità 3' degli RNA nascenti trascritti da uno qualsiasi dei tre Pol RNA. Durante il run-on trascrizionale, la biotina-NTP incorporata nel sito attivo blocca efficacemente i Pols. Successivamente, il trattamento con DMS metila i nucleotidi A, C e U non accoppiati. L'arricchimento successivo della biotina e la sintesi del cDNA con una trasscrittasi inversa a cambio di modello permettono il sequenziamento a estremità accoppiata e il calcolo delle reattività DMS in funzione della posizione Pol. CoSTseq viene eseguito facilmente fianco a fianco con la sondaggia DMS (DMS-MaPseq), consentendo anche la cattura del trascrizione matura piegata. Qui viene presentato un protocollo dettagliato per CoSTseq parallelo e DMS-MaPseq, includendo il run-on trascrizionale, la preparazione delle librerie e l'analisi dei dati.

Introduction

L'RNA può ripiegarsi in strutture secondarie e terziarie grazie all'accoppiamento di basi all'interno delle molecole di RNA, e queste strutture possono essere ulteriormente influenzate da proteine che agiscono come chaperoni per guidare il ripiegamento^{dell'RNA 1}. La struttura dell'RNA può essere altamente dinamica, dove gli RNA cellulari possono conformarsi a una gamma di strutture definite dal paesaggio termodinamico per generare insiemi di possibili conformazioni^{di RNA 2}. I cambiamenti conformazionali dinamici hanno il potenziale di influenzare la regolazione e l'espressione^{genica 3,4}. Al contrario, l'RNA può anche adottare strutture altamente favorite strettamente correlate alla sua funzione, come tRNA, piccoli RNA nucleari e rRNA. Sebbene questi esempi mettano in evidenza RNA maturi con forti ruoli regolatori, le fasi di elaborazione dell'RNA eucariotico spesso co-verificano con la trascrizione, tra cui la splicatura pre-mRNA, la clivagatura all'estremità 3' e la modifica dell'RNA. Allo stesso modo, il ripiegamento dell'RNA può avvenire prima della maturazione del trascrito, come discusso^{altrove 5}.

Sebbene la sequenza dell'RNA possa codificare la struttura secondaria, una determinazione accurata spesso richiede una validazione sperimentale in vitro o in vivo. L'avvento di tecniche di modifica chimica specifica per struttura come DMS-MaPseq (profilazione mutazionale di dimetilsolfato con sequenziamento) ha aperto la strada per determinare la struttura secondaria dell'RNA cellulare nelle^{cellule viventi 6}. Il DMS viene introdotto nelle cellule e metila specificamente le facce di accoppiamento di basi Watson-Crick di adenosina, citosina e, in misura minore, uridina, che sono accessibili solo quando non sono accoppiate. Dopo la modifica da parte del DMS, una trasscrittasi inversa ad alta fedeltà e altamente processiva, come la Thermostable Group II Intron Reverse Transcriptase (TGIRT⁾⁷, può essere utilizzata per ricodificare basi modificate come mutazioni nella libreria cDNA preparata finalmente. Queste mutazioni possono poi essere utilizzate per dedurre l'accessibilità dell'RNA a livello nucleotidico. Pur essendo una tecnica potente, DMS-MaPseq e metodi correlati sono stati utilizzati principalmente per studiare RNA maturo già completamente^{piegato 6}.

Sono stati sviluppati diversi metodi per studiare la regolazione e l'elaborazione dell'RNA nascente. Il sequenziamento globale a run-on (GROseq) è stato sviluppato per superare i limiti dell'RNA-seq, che consente la misurazione in stato stazionario dei livelli di RNA nelle cellule e fornisce quindi informazioni che mediano tra trascrizioni, elaborazione dell'RNA e processi di degradazione che influenzano i livelli di RNA. GROseq utilizzava bromouridina per il run-on nucleare, dove una polimerasi a RNA (Pol) poteva aggiungere nucleotidi all'RNA nascente con una risoluzione di decine di^{basi 8}. Il sequenziamento di precisione run-on (PROseq) è stato costruito su questa metodologia per mappare i Pol di RNA su RNA nascente a risoluzione di coppie di basi utilizzando biotina-NTP. Qui viene aggiunto un NTP biotinilato dove Pol è stato rilevato per l'ultima volta all'estremità 3'^{dell'RNA 9} appena sintetizzato.

Recentemente, Schärfen et al. hanno sviluppato e utilizzato il Co-transcriptional Structural Tracking (CoSTseq), che sfrutta e adatta il run-on alla biotina e il sondaggio DMS per consentire la determinazione della struttura dell'RNA dei trascritti nascenti in S. cerevisiae¹⁰. CoSTseq consente di determinare la struttura secondaria dell'RNA durante la trascrizione attiva; questo protocollo dettaglia come il funzionamento nucleare viene combinato con il sondaggio DMS durante gli esperimenti CoSTseq. Dato che CoSTseq richiede una gestione attenta durante la preparazione del campione, oltre a un'attenta attenzione alla qualità dei dati durante l'analisi CoSTseq, questo protocollo dettaglia le migliori pratiche per generare librerie adatte per il sequenziamento a pari e estremità sulla piattaforma Illumina. Il protocollo CoSTseq produce contemporaneamente RNA nascente e maturo, quest'ultimo dei quali può essere analizzato come dataset DMS-MaPseq per consentire un confronto rigoroso tra RNA nascente e maturo (Figura 1). Sperimentalmente, è necessario l'accesso ai reagenti necessari per mantenere le colture di lievito e condurre sondaggi nucleari e DMS, come dettagliato nel protocollo qui sotto. La resa di RNA nascente è fondamentale per il successo della preparazione delle librerie e dell'analisi dei dati di CoSTseq; Pertanto, le condizioni di crescita stabilite da incubatori e mezzi di crescita appropriati sono fondamentali per garantire materiale di partenza sufficiente. Infine, per condurre un'analisi computazionale dei dati CoSTseq, l'accesso a un cluster di High-Performance Computing (HPC) è ideale.

Figura 1: Panoramica della preparazione combinata di CoSTseq e DMS-MaPseq dalla libreria dallo stesso campione biologico. (A) La permeabilizzazione della parete cellulare e della membrana nucleare del lievito con sarkosyl consente l'incorporazione di biotina-NTP all'estremità 3' dell'RNA nascente durante una reazione nucleare di riproduzione. (B) DMS metila i residui A e C non spaiati (talvolta U) su RNA nascente e maturo nella cellula permeabilizzata, e l'RNA totale viene ottenuto tramite estrazione di fenolo/cloroformio. L'RNA nascente viene quindi purificato dall'RNA totale tramite perle magnetiche coniugate con streptavidina; L'estrazione con TRIzol rilascia l'RNA nascente dalle perle. Parallelamente, il sovrantantante a perla contenente mRNA poliadenilati può essere precipitato da EtOH; da questo materiale, l'mRNA può essere isolato tramite pulldown della sfera oligo(dT). Gli mRNA poli A+ vengono frammentati prima della preparazione della biblioteca. (C) Viene utilizzata una trasscrittasi inversa a commutazione di template per generare separatamente cDNA da RNA nascente o maturo, seguita dalla legazione di adattatori 5' e 3' per introdurre un UMI N₇ e codici a barre (vedi Figura 2 per i dettagli di CoSTseq). Si noti che i passaggi di trascrizione inversa DMS-MaPseq e CoSTseq utilizzeranno adattatori eteroduplex distinti con sporgenze complementari alla biotina-NTP usate in CoSTseq e sporgenti N usate in DMS-MaPseq. Cicli PCR minimi sono utilizzati per l'amplificazione e limitare il bias nella libreria, e la selezione della dimensione viene applicata per rimuovere i dimer adattatori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

NOTA: Prima di iniziare, assicurati che tutti i buffer elencati nella Tabella 1 siano preparati. Tutti i reagenti devono essere preparati in acqua priva di nucleasi. La sterilizzazione tramite filtro dei tamponi è raccomandata quando si utilizzano sostanze chimiche/reagenti di grado biologico non molecolare per la preparazione del tampon. Per le sezioni da 1 a 4, preparate in anticipo quanto segue:

1. Preparazione di materiali e reagenti

1. Prepara una soluzione di sarkosyl (v/v) al 10% almeno un giorno prima per consentire tempo sufficiente per la completa dissoluzione. Sterilizza la soluzione omogenea con un filtro da 0,22 μm. Il giorno dell'esperimento, usa il sarkosyl al 10% per preparare una soluzione di sarkosyl allo 0,5% e lascialo sul ghiaccio fino all'uso.
2. Pre-raffreddare le ultracentrifughe a 4 °C. Nella cappa fumi, imposta il termomiscelatore a 30 °C e preriscalda un aliquota di 2,5x Structural sonder buffer. Questo termomiscelatore sarà utilizzato successivamente per il trattamento DMS.
3. Nella cappa fumi, impostare un blocco termico a 65 °C e riscaldare 650 μL di fenolo acido: cloroformio per reazione per l'estrazione dell'RNA.
4. Mescola DTT con buffer di trascrizione 2,5x fino a una concentrazione finale di 2 mM. Preparare e preraffreddare frescamente le soluzioni di tempra e lavaggio per l'uso immediato dopo il trattamento DMS (vedi Tabella 1).
5. Aliquota 40 μL di SDS al 20% in tubi per la lisi del lievito prima dell'estrazione dell'RNA. Prepara una soluzione di cloruro di zinco (ZnCl2) da 100 mM e sterilizza con filtro prima dell'uso.
6. Generare ceppi di lievito di delezione, deplezione o knock-in che potrebbero essere necessari per rispondere a domande specifiche di ricerca sull'accoppiamento di basi RNA nascenti rispetto al ceppo selvatico del lievito gemmelante. Rianima sempre freschamente i ceppi facendo striature su una piastra di agar di lievito appropriata (YPD, dropout o piastre antibiotiche). Inizia una coltura liquida da una singola colonia il giorno prima dell'inizio dell'esperimento. Per ulteriori istruzioni sulla crescita e manipolazione dei ceppi di lievito, si prega di consultare Schärfen et al., 2025.

2. Preparazione delle cellule di lievito per CoSTseq

1. Preparazione di una precoltura: Coltivare il ceppo di S. cerevisiae BY4741 in 50 mL di mezzo YPAD fino a raggiungere la fase logaritmica media (Densità Ottica (OD) a 600 nm = 0,6) a 30 °C con agitazione a 200 rpm. Se necessario, diluire la coltura a 0,2-0,3 e permettere al lievito di raggiungere 0,6 OD.
2. Raccolta del lievito: Raccogliere e centrifugare 1,8 OD (~3 mL) di lievito a 2.500 x g per 3 minuti in una centrifuga pre-raffreddata (4 °C). Scarta il soprantantante in un contenitore di rifiuti. Lavare il pellet risospendendo 10 mL di soluzione salina fosfatata a freddo (PBS). Gira di nuovo a 2.500 x g per 3 minuti a 4 °C. Smalti il surnatante e tieni la pellet di lievito sul ghiaccio.
3. Permeabilizzazione delle cellule di lievito: Sospendere con cura la pellet di lievito in 10 mL di sarkosyl freddo allo 0,5%. Usa un pipettor P1000 per risospendere le celle ed evita di creare bolle. Incubare sul ghiaccio per 20 minuti per favorire la permeabilizzazione. Pelleta le cellule di lievito permeabilizzate a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere le cellule di lievito permeabilizzate in 100 μL di acqua priva di nucleasi.

NOTA: Sebbene la marcatura DMS non richieda la permeabilizzazione della parete cellulare, la reazione nucleare di passaggio richiede la permeabilizzazione affinché i nucleotidi biotinilati raggiungano il sito di trascrizione. Questo viene ottenuto tramite il trattamento con sarkosyl, che permeabilizza sia la parete cellulare del lievito sia la sua membrana nucleare. Inoltre, il trattamento con sarkosyl facilita il test continuo prevenendo nuovi eventi di inizio della trascrizione e dislocando fattori negativi di allungamento da Pol II e^{cromatina 11,12}. Maneggiare delicatamente i campioni e mantenere una bassa velocità centrifuga (400 x g) per prevenire la rottura cellulare e favorire l'incorporazione efficace della biotina in trascritti nascenti^{allungati 13}.

3. Run-on nucleare e sondaggio DMS

NOTA: Il flusso nucleare con biotina-NTP introduce un ostacolo sterico che blocca i Pol di RNA nel loro sito attivo e fornisce un manico di biotina per l'arricchimento selettivo dell'RNA nascente. A seconda della risoluzione desiderata, un run-on nucleare può essere eseguito utilizzando uno, due o tutti e quattro i ribonucleotidi^{biotinilati 9}. Per garantire l'efficienza dei costi, il flusso di lavoro descritto qui utilizza un solo nucleotide biotinilato (cioè biotina-CTP).

1. Preparazione della reazione nucleare di corsa
   1. Preparare una soluzione di lavoro per tampone di trascrizione 2,5x con una DTT appena aggiunta da 5 mM e preriscaldare un buffer di sondaggio strutturale 2,5x a 30 °C (vedi Tabella 1).
   2. In un tubo pulito da 2 mL, aggiungere 120 μL di buffer di trascrizione 2,5x, 3,75 μL di 10 mM ATP, 3,75 μL di 10 mM GTP, 3,75 μL di 10 mM UTP, 7,5 μL di 1 mM Bio-CTP, 15 μL di 10% sarkosyl e portare il volume a 200 μL con 46,25 μL di acqua priva di nucleasi.
   3. Aggiungi 100 μL di cellule al tubo e incuba in un termomiscelatore impostato a 30 °C per 2 minuti con agitazione a 500 giri/min.
      NOTA: Questo passaggio è molto urgente. Cerca di limitare il numero di campioni per generare dati affidabili. È buona prassi scalipare i tempi tra i campioni per coerenza.
2. Trattamento DMS: Una volta completata l'incubazione, aggiungere rapidamente 200 μL di buffer di sondaggio strutturale 2,5x preriscaldato e 25 μL di reagente DMS al tubo contemporaneamente. Vortice delicatamente in due impulsi e continua a incubare sul termomiscelatore per 4 minuti a 30 °C scuotendo a 500 giri/min. Distanzia 30 secondi tra un campione e l'altro per essere coerenti.
   NOTA: Il sondaggio DMS è una reazione istantanea che consente un'alta risoluzione^{temporale 14} dello stato di accoppiamento di basi dell'RNA. Per prevenire la modifica continua del DMS, è fondamentale estinguere tempestivamente l'etichettatura del DMS utilizzando il forte agente riducente β-mercaptoetanolo. Inoltre, qualsiasi DMS residuo ostacolerà il recupero dell'RNA al momento dell'estrazione. L'aggiunta di alcol isoamililico saturo d'acqua prima della centrifugazione può rimuovere residui di DMS insolubile nel pellet^{cellulare 15}. Questo passaggio è altamente urgente. È essenziale lavorare con un numero limitato di campioni per generare dati affidabili.
   ATTENZIONE: Il DMS è un liquido altamente tossico e incolore con un leggero odore simile a cipolla. Sono necessarie precauzioni estreme quando si lavora con DMS. Il contatto diretto e/o l'inalazione di vapori può causare necrosi agli occhi, alla bocca e alle vie respiratorie, inclusi gravi danni agli organi. Usa occhiali protettivi, camice da laboratorio e guanti adeguati. Doppio guanto ogni volta che possibile e cambia immediatamente i guanti all'esposizione o dopo l'uso tramite DMS. Esegui i passaggi che coinvolgono il DMS sotto una cappa a fumo. Usa contenitori dedicati per i rifiuti per lo smaltimento DMS.
3. Tempra e lavaggio
   1. Prepara in anticipo i buffer di stop and wash come indicato nella Tabella 1 e mettilo sul ghiaccio fino all'uso. Ferma la metilazione del DMS aggiungendo 1 mL di buffer di stop.
   2. Centrifuga i campioni etichettati con DMS per 5 minuti a 3.500 x g in una centrifuga preraffreddata. Getta i rifiuti in un contenitore appropriato.
   3. Aggiungi 1 mL di buffer di lavaggio al pellet e risospendi. Ripeti il passo 3.3.2. Procedere immediatamente all'estrazione dell'RNA. Non congelare il pellet di lievito.
4. Estrazione del fenol cloroformico
   1. Risospendere il lievito marcato con DMS in 600 μL di tampone di lisi RNA, quindi trasferire la sospensione in tubi contenenti 40 μL di SDS al 20%. Incubare a 65 °C per 30 secondi con scuotimento a 950 giri/min.
   2. Aggiungi 650 μL di fenolo:cloroformio acido preriscaldato al lisato di lievito e continua a riscaldare sul termomiscelatore per 2 minuti a 65 °C con agitazione a 950 giri al minuto. Lascia riposare i campioni sul ghiaccio per 5 minuti.
      NOTA: Nel frattempo, imposta il blocco riscaldante o il termomiscelatore a temperatura ambiente (RT).
   3. Centrifuga a 20.000 x g per 3 minuti a RT.
   4. Sposta lo strato superiore su un nuovo tubo e aggiungi 650 μL di cloroformio. Vortice per un attimo. Centrifugare di nuovo e raccogliere lo strato superiore in un nuovo tubo contenente 700 μL di isopropanolo.
   5. Inverti per mescolare e incubare nel congelatore a -20 °C per 30 minuti, lasciando precipitare l'RNA. Centrifuga a 20.000 x g per 45 minuti a 4 °C. Scartate il soprannatante. Lava il pellet con 750 μL di etanolo al 75% (EtOH).
      NOTA: Questo è un punto di arresto/pausa nel protocollo. I campioni possono essere lasciati in EtOH al 75% durante la notte a -80 °C.
   6. Gira per 3 minuti a 20.000 x g e scarta il soprantantante. Asciugare all'aria il pellet di RNA e scioglierlo in 81 μL di acqua priva di nucleasi. Quantificare la resa dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro impostato su una lunghezza d'onda di 260 nm. Applicare 1 μL della risospensione sopra per misurare. Diluire il campione di RNA se necessario. Dovrebbero essere presenti almeno 80 μg di RNA totale per passare al passo successivo.
      NOTA: Se necessario, l'RNA marcato con DMS può essere conservato a -80 °C per un massimo di 2 settimane.

4. RNA nascente (CoSTseq)

NOTA: L'RNA totale ottenuto dall'estrazione fenolica: cloroformico contiene RNA maturi marcati con DMS così come RNA nascenti biotinilati marcati con DMS provenienti da tutte e tre le polimerasi. Per purificare gli RNA nascenti dall'RNA totale, i seguenti passaggi utilizzeranno perle di streptavidina per arricchire l'RNA nascente biotinilato. Grazie alla forte affinità della biotina per la streptavidina (K_d = ^10-14 - ^10-15 M), vengono eseguite due estrazioni consecutive da reagenti RNA (vedi Tabella dei Materiali) per eluire l'RNA dalle sfere di streptavidina. Si noti che meno dell'1% dell'RNA del lievito è RNA nascente, a seconda della condizione di crescita¹⁶.

1. Pulldown della biotina
   1. Preparazione delle perle magnetiche di Streptavidina
      1. Preparare il tampone di prelavaggio A e il tampone di prelavaggio B come mostrato nella Tabella 1 per la composizione. Omogeneizzare le sfere magnetiche di Streptavidina tramite vortice. Ottenere 44 μL di sfere magnetiche omogeneizzate per campione di 80 μg di RNA totale.
         NOTA: Ingrandisci moltiplicando il volume per il numero di campioni.
      2. Metti le perline magnetiche sul rack magnetico e rimuovi la soluzione di conservazione. Sospendere le sfere magnetiche in 1 mL di buffer di prelavaggio A.
      3. Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. Magnetizza e rimuovi il soprandatante. Ripeti il lavaggio. Lava 1 volta con 1 mL di buffer di prelavaggio B. Magnetizza e rimuovi il surnadante, poi procedi rapidamente alla fase di legatura e lavaggio.
   2. Rilegatura e lavaggio
      1. Prepara i buffer di 2 rilievi, 1 tampone di legame, alto salare e basso sale come mostrato nella Tabella 1.
      2. Sospezione delle perline prelavate aggiungendo il doppio del volume originale (88 μL) di 2x binding buffer. Trasferire 80 μL di sfere in un tubo sterile da 1,5 mL contenente 80 μL del campione di RNA biotinilato.
      3. Ruota la miscela di perla e campione su un rotatore per 20 minuti a temperatura ambiente. Raccogliere il flusso attraverso RNA maturo per stadio magnetico (procedere alla fase di precipitazione).
      4. Risciacquare il complesso RNA perla-nascente con 500 μL di tampone ad alto contenuto di sale 2 volte. Esegui un risciacquo con 500 μL di legatura 1x, seguito da un altro con 500 μL di tampone a basso contenuto di sale.
2. Eluzione tramite estrazione di reagenti di RNA
   1. Preriscalda un termomiscelatore a 60 °C. Raffreddare una centrifuga capace di raggiungere una velocità compresa tra 20.000 x g e 4 °C.
   2. Aggiungere 300 μL di reagente RNA (vedi Tabella dei Materiali) al complesso di RNA perla-nascente e risospendere. Incubare su un termomiscelatore per 5 minuti a 60 °C.
   3. Aggiungi 60 μL di cloroformio, vortice e incuba 3 minuti a RT. Fai girare a 14.000 x g per 5 minuti in una centrifuga preraffreddata.
   4. Sposta la fase acquosa superiore in un nuovo tubo di raccolta (~180 μL). Scartare la fase organica, lasciando le perle e la fase acquosa rimanente.
   5. Ripetere l'estrazione per ottenere un volume finale di 360 μL di fase acquosa nel tubo di raccolta.
   6. Aggiungere 360 μL di cloroformio al tubo di raccolta e al vortice per un breve periodo. Gira a 14.000 x g per 5 minuti in una centrifuga preraffreddata.
   7. Trasferire (circa 350 μL) dello strato superiore in un tubo fresco. Precipitare l'RNA aggiungendo 900 μL di EtOH assoluto e 1 μL di co-precipitante.
   8. Vortice brevemente e permette che le precipitazioni si verifichino a -20 °C per 20 minuti o -80 °C durante la notte.
   9. Nella centrifuga pre-raffreddata, centrifuga a 20.000 x g per 20 minuti. Scartate con cura il soprandanante.
   10. Lavare il pellet con 750 μL di EtOH al 75%, seguito da un'altra centrifugazione a freddo a 20.000 x g per 5 minuti.
   11. Asciuga il pellet per rimuovere l'EtOH residuo per 10 minuti. Dissolvere il pellet di RNA in 3,75 μL di_H2O.
       NOTA: Il blotting a punto dell'RNA eluzionato seguito da una sondazione con il coniugato streptavidina-HRP è il metodo più efficace per valutare il pulldown della biotina. Tuttavia, questo approccio consuma una quantità sostanziale del materiale campione, lasciando materiale insufficiente per la preparazione della biblioteca.
3. Precipitazione del sovrantato
   1. Precipitare il sovrantantante contenente RNA maturi aggiungendo 2,5-3 volumi di EtOH. Permettere che le precipitazioni si verifichino a -20 °C per 1 ora.
   2. In una centrifuga preraffreddata, gira per 45 minuti a 20.000 x g. Aspira con cura il soprandante.
   3. Lava il pellet di RNA con 0,5 mL di EtOH al 75%. Asciugare e sciogliere la pellet in 50 μL di acqua priva di nucleasi. Posizionare il tubo su un blocco termico a 65 °C per migliorare la dissoluzione del pellet di RNA.
   4. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro per i passaggi successivi.

5. RNA maturo (DMS-MaPseq)

1. Selezione Poly A
   NOTA: Gli RNA maturi poliadenilati vengono purificati utilizzando la cattura di affinità basata su perle oligo(dT). Questo protocollo è ottimizzato per utilizzare il Dynabeads mRNA Purification Kit DIRECT (vedi Tabella dei Materiali). Come preparazione iniziale, si preriscalda 1 mL di acqua priva di nucleasi a 80 °C per l'eluzione e si imposta un blocco di calore a 70 °C.
   1. Preparazione dell'RNA per il pulldown del poli A: trasferire 50 μg di RNA precipitato e portarlo a un volume finale di 300 μL con acqua priva di nucleasi. Riscalda l'RNA a 70 °C per 2 minuti per disturbare le strutture secondarie e mettilo subito sul ghiaccio. Mescola l'RNA con 300 μL di tampone di lisi/legame e vortice brevemente.
   2. Preparazione delle sfere magnetiche: Portare le sfere magnetiche in sospensione tramite vortice per almeno 30 secondi. Trasferire 100 μL di sfere sospese per campione in un tubo sterile da 1,5 mL. Magnetizza per scartare il buffer di archiviazione. Risciacqua le sfere magnetiche in un volume uguale di tampone di lisi/legame, magnetizza e scarta il soprantantante.
   3. Rilegatura e lavaggio
      1. Aggiungere i 100 μL di perle prelavate ai 600 μL di RNA del campione preparato. Ruota continuamente su un rotatore per 5 minuti a temperatura ambiente.
      2. Raccogli le perline posizionandole su una griglia magnetica e elimina il flusso passante. Lava le perline con 600 μL di tampone di lavaggio A. Pipetta per mescolare.
      3. Raccogli di nuovo le perline per buttare via il lavaggio. Lava le perline con 300 μL di tampone di lavaggio B. Pipetta per mescolare.
      4. Raccogli di nuovo le perline per buttare via il lavaggio. Mescola le perle con 90 μL di acqua tiepida (80 °C) e permette il legame aggiungendo 90 μL di tampone lisi/legame. Ripeti il passaggio 5.1.3.1-5.1.3.3.
   4. Eluzione: Sospendere le sfere in 30 μL di acqua calda (80 °C) senza nucleasi. Incubare a 75 °C a 80 °C per 2 minuti. Sottoporre rapidamente le sfere a un campo magnetico e raccogliere l'eluato in un tubo privo di RNasi. Ripeti l'eluzione e raccogli l'RNA eluzionato.
2. Frammentazione
   NOTA: La frammentazione degli mRNA può essere ottenuta sia tramite mezzi enzimatici che chimici. Qui, per la frammentazione si usano cloruro di zinco e calore. A differenza degli enzimi che richiedono una sequenza specifica o elementi strutturali, gli ioni di zinco agiscono come un acido di Lewis per attivare l'ossigeno 2' (un nucleofilo) e tagliare la spina dorsale fosfodiestera. Questo porta alla formazione di esteri fosfatici ciclici 5' OH e 2',3' sui filamenti di RNA^{prodotto 17}.
   1. Preriscalda il termociclatore con la temperatura del blocco impostata a 94 °C e la temperatura del coperchio impostata a 105 °C. Inserire 54 μL di mRNA eluzionato in un tubo PCR.
   2. Aggiungere 6 μL di soluzione di cloruro di zinco da 100 mM (concentrazione finale di 10 mM), vortice per 2 secondi e incubare immediatamente a 94 °C per 55 secondi sul termociclatore preriscaldato.
   3. Al termine dell'incubazione, si tempra la reazione di frammentazione con 6,6 μL di 0,5 M EDTA (concentrazione finale di 50 mM), si pipetta su e giù per mescolare e si posano rapidamente i tubi sul ghiaccio. Trasferisci il contenuto su tubi sterili da 1,5 mL.
   4. Consentire la precipitazione degli mRNA frammentati con l'aggiunta di 150 μL di isopropanolo, 15 μL di 3 M di acetato di sodio, pH 5,2 e 1 μL di co-precipitante.
   5. Lascia a -20 °C per 30 minuti. Gira a 20.000 x g per 45 minuti in una centrifuga preraffreddata. Lavare il pellet con EtOH al 75% e scioglierlo in 15 μL di acqua priva di nucleasi.
3. Trattamento PNK
   NOTA: La frammentazione chimica con ZnCl₂ genera estremità 5' e 3' inadatte alla ligatura¹⁷. Così, dopo la frammentazione chimica, gli RNA vengono sottoposti a un trattamento con polinucleotidi-chinasi (PNK), che fosforila le estremità fosfatiche 5' OH e defosforila 3', che possono poi essere legate agli adattatori¹⁸.
   1. Aggiungere 1 μL di inibitore della ribonucleasi, 2 μL di 10x PNK Buffer e 2 μL di T4 PNK. Incubare a 37 °C per 60 minuti. Fermare la reazione aggiungendo 30 μL di acqua priva di nucleasi, 50 μL di buffer di legame con l'RNA e 50 μL di EtOH.
   2. Utilizzare un metodo di purificazione dell'RNA basato su colonna di spin per rimuovere i contaminanti e concentrare l'RNA. Questo può essere fatto utilizzando un kit commercialmente disponibile (kit RNA Clean and Concentrator, vedi Tabella dei Materiali). In breve, miscela due volumi di buffer di legame RNA con 1 volume di campione, miscela un volume uguale di questa miscela con il 100% di EtOH e carica sulla colonna di spin con un nuovo tubo di raccolta. Fai girare questo campione e scartare il flusso di passaggio. Lavare la colonna di spin con 700 μL di buffer di lavaggio RNA e una volta con 400 μL di buffer di lavaggio RNA. Scartare il flusso attraverso. Fai girare la colonna vuota per 1 minuto per assicurarti la completa rimozione del buffer di lavaggio.
   3. Eludi l'RNA in 10 μL di acqua calda senza nucleasi.
      NOTA: Eseguire tutti i passaggi di centrifugazione a 10.000 - 16.000 x g a RT per 30 secondi.

6. Reazione di trascrizione inversa con cambio di template

NOTA: Gli RNA nascenti derivanti dal pulldown della biotina (passo 4.2) e dall'mRNA frammentato dopo il trattamento con PNK (passo 5.3) sono sottoposti ai seguenti passaggi per la preparazione della libreria ( vedi Figura 1 e Figura 2). In breve, verrà preparato un modello di RNA sintetico/duplex di innamoramento per DNA (adattatore eteroduplex R2 RNA/DNA) su cui può avvenire il cambio di schemi. Questo eteroduplex fornisce una breve sequenza complementare che consente lo switching di modello da parte della trascridasi inversa (RT) per cambiare filamento, quando il RT cambia fili dall'RNA al primer del DNA, consentendo così una sintesi fluida del cDNA dall'RNA alla sequenza adattatrice. Qui viene utilizzata la trascridasi inversa induro, che è stata testata e ottimizzata per questo protocollo. Altre trasscrittasi inverse a cambio di template possono essere utilizzate per la preparazione della libreria CoSTseq se desiderato, ma richiedono ottimizzazione da parte dell'utente.

1. Sequenze adattatori eteroduplex DNA/RNA
   NOTA: Gli adattatori eteroduplex DNA/RNA utilizzati per la trascrizione inversa del campione DMS-MaPseq sono gli stessi elencati in Xu et ^al.7 e citati da Schärfen et ^al.10.
   1. Per l'adattatore eteroduplex DNA/RNA che verrà utilizzato per la trascrizione inversa del campione CoSTseq, si utilizza un adattatore con una 'G' nella regione di sbalzo. Questo permetterà a G di catturare la biotina-C all'estremità 3' dell'RNA. Se si utilizza un NTP biotinilato diverso, modificare il primer del DNA eteroduplex per avere il nucleotide di accoppiamento appropriato come sporgenze (vedi Tabella 2).
   2. Per l'adattatore DMS-MaPseq, assicurati che ci sia un unico sovrasporgimento N, dato che l'estremità 3' sarà casuale dopo la frammentazione. Per una panoramica dei seguenti passaggi di preparazione della biblioteca, vedi la Figura 2.
2. Preparazione di un ibrido DNA/RNA per la commutazione del modello: Preparare 1 μM di innesco R2 RNA e R2R in un tampone composto da 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 e 1 mM EDTA. Incubare il primer a 82 °C per 2 minuti, poi raffreddare a 25 °C a una velocità di 0,1 °C/s. Alitera la miscela e congela per un uso successivo.
3. Cambio di modello trascrizione inversa
   1. Aggiungere i seguenti reagenti e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente: 2 μL di 5x tampone di reazione, 1 μL di 1 μM DNA/RNA eteroduplex (usare eteroduplex con singola sporgenza G per il campione CoSTseq; usare eteroduplex contenente una sporgenza casuale di N per il campione DMS-MaPseq), 0,5 μL di enzima, 0,5 μL inibitore RNasi, 3,75 μL di campione RNA (oppure aggiungere acqua per ottenere un volume totale di 7,75 μL).
   2. Incuba questa miscela (senza dNTP) per 30 minuti a RT. Poi aggiungi 1,25 μL di 10 mM dNTP alla reazione e applica le seguenti condizioni di ciclo in un termociclatore: 25 °C per 10 minuti, 42 °C per 10 minuti, 50 °C per 10 minuti, 55 °C per 10 minuti, 60 °C per 30 minuti, 65 °C per 20 minuti, 75 °C per 15 minuti.
   3. Aggiungi 1 μL di RNasi H e incuba a 37 °C per 20 minuti. Purificare la reazione PCR utilizzando un metodo di purificazione del DNA a colonna per rimuovere primer, nucleotidi ed enzimi rimanenti. Elute in un volume finale di 20 μL.

Figura 2: Rappresentazione schematica dettagliata della preparazione della libreria CoSTseq. L'RNA nascente con un'estremità biotinilata a 3' viene incubato con un adattatore di commutazione a modello contenente una sporgenza G complementare alla biotina-CTP. Per l'RNA maturo frammentato (DMS-MaPseq), si utilizza un adattatore con sovrasporgenza N-(vedi Figura 1). La sintesi del cDNA viene effettuata utilizzando una trascrittasi inversa altamente processiva, come la trascrivisi inversa di introni termostabile del gruppo II (TGIRT), seguita dal trattamento con RNase H per degradare il filamento di RNA. Successivamente, la ligasi ADN/RNA 5' di App collega l'estremità 5' (rA^pp) adenilata dal ribosio del collegamento UMI N₇ al 3' OH del cDNA monocatenato. L'adattatore UMI N₇ include un'estremità bloccata a 3′, che impedisce l'auto-ligatura tra gli adattatori. Infine, l'amplificazione PCR viene effettuata utilizzando primer che includono regioni sovrapposte e sporgenti da 5′ con codici a barre unici Illumina i5 e i7 assegnati a ciascun campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Ligazione adattatore 5' per la preparazione delle librerie finali di cDNA per il sequenziamento a fine accoppiata dei tag

1. Preparazione dell'adattatore a estremità 5'
   1. Adenilato l'adattatore a estremità 5' utilizzando una reazione basata su RNA ligasi (ad esempio, M-esima RNA Ligase, elencata nella Tabella dei Materiali) con i seguenti componenti di reazione: 8 μL di 10 μL di buffer di reazione di adenilazione 5'-DNA, 8 μL di 1 mM ATP, 100 μM R1R DNA (questo è il primer TruSeq contenente un identificatore molecolare unico o UMI), 8 μL di M-esima RNA ligasi, 52 μL di acqua priva di nucleasi.
      NOTA: Per dettagli relativi al design dell'adattatore UMI N₇ , vedi Tabella 2 e Figura 2.
   2. Incubare questa reazione a 65 °C per 1 ora, poi a 85 °C per 5 minuti. Procedere alla purificazione del prodotto utilizzando precipitazione EtOH o con un metodo di pulizia del DNA basato su colonna di spin a membrana silicea per isolare il cDNA, secondo le istruzioni del produttore.
   3. Per la precipitazione EtOH, il DNA può essere precipitato a -20 °C (minimo 20 min) usando acetato di sodio (pH 5,2) a una concentrazione finale di 0,3 M e 2x-2,5x del 95%-100% EtOH freddo. Centrifugare la reazione precipitata da EtOH per 15 minuti alla massima velocità in una centrifuga pre-raffreddata (4 °C), lavare il pellet usando il 70% di EtOH, ricentrifugare e asciugare il pellet all'aria. Risospendere (o elure, se si utilizza una colonna di spin) il pellet in 40 μL di acqua priva di nucleasi. Conserva a -20 °C a lungo termine.
2. Legazione adattatore da 5'
   1. Per un singolo volume di reazione da 20 μL, si aggiungono i seguenti componenti a 10 μL di cDNA: 2 μL di 10x NE Buffer 1, 2 μL di 50 mM_{MnCl 2,} 2 μL di AppDNA/RNA ligasi 5', 4 μL di 10 μM (100 ng/μL) dell'adattatore adenilato dal passaggio 7.1.
   2. Incubare questa reazione a 65 °C per 1 ora, poi 3 minuti a 90 °C. Pulire la reazione utilizzando il kit di purificazione PCR minElute ed eluto in un volume finale di 20 μL d'acqua senza nucleasi.
3. Amplificazione minima per PCR delle librerie di cDNA con test pilota
   1. Prima di procedere, prepara uno stock da 10 μM di primer indicizzati contenenti codici a barre unici. Ogni campione unico di CoSTseq o DMS-MaPseq dovrebbe avere un codice a barre unico associato per un'analisi a valle fluida. Vedi le sequenze di innesco nella Tabella 2. I singoli primer contenenti codici a barre forward e back possono essere combinati in una miscela 1:1 e conservati come premix a barre.
   2. Utilizzando 2 μL del prodotto PCR dello step 7.2, aggiungere 2,5 μL di buffer PCR ad alta fedeltà (ad esempio, un buffer HiFi commerciale), 0,375 μL di dNTP (10 mM), 0,75 μL di premix a barre (o 0,375 μL di primer unici a barre i5 e i7), 0,25 μL di DNA polimerasi a hot-start ad alta fedeltà (ad esempio, enzima HiFi a partenza a caldo commerciale), 6,625 μL di acqua priva di nucleasi.
   3. Incubare questa reazione a 95 °C, e ripetere [15 s 98 °C, 30 s 62 °C, 30 s 72 °C] per 23 cicli, terminando con 1 minuto di incubazione a 72 °C. Usa un gel di agarosio all'1% per decidere il valore ottimale per il ciclo.
      NOTA: Per testare condizioni di cicli più basse, un campione può essere preparato alla fine di un ciclo inferiore (ad esempio, fine di 15 o 16 cicli) e applicato a un gel di agarosio per confrontare l'intensità dello smear della libreria di cDNA su un gel di agarosio tra le lunghezze cicliche.
4. PCR finale per amplificazione della libreria
   1. Utilizzando 18 μL del prodotto PCR del passo 7.2, si aggiunge quanto segue dal KAPA HiFi PCR Kit: 22,5 μL di tampone PCR ad alta fedeltà, 3,375 μL di dNTP (10 mM), 6,75 μL di premix a barre (o 3,375 μL di primer univoci a barre i5 e i7), 2,25 μL di DNA polimerasi hot-start ad alta fedeltà e 59,625 μL di acqua priva di nucleasi.
   2. Incubare questa reazione a 95 °C e ripetere [15 s 98 °C, 30 s 62 °C, 30 s 72 °C] per il numero di cicli determinati nel passo 7.3. Terminare con 1 minuto di incubazione a 72 °C.
5. Selezione delle dimensioni
   1. Effettuare la selezione della dimensione sul prodotto PCR utilizzando purificazione a base di perle paramagnetiche (ad esempio, AMPure XP o equivalente). Usa 1,3 volte il volume di sfere (ad esempio, per una reazione PCR da 50 μL, usa 65 μL di pasta di perle) e mescola bene fino a rendere omogenea. Lascia che le perle leghino il campione per 10 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: Questo rapporto campione/sfere di 1:1,3x consente la rimozione dei dimeri adattatori del primer e garantisce che i frammenti di DNA trattenuti non siano inferiori a 150 bp e non superiori a 800 bp.
   2. Rimuovi il sovrantantante senza disturbare le perline e procedi a lavare le perline con l'80% di EtOH secondo il protocollo del produttore.
   3. Elure il prodotto finale a 11 μL. Eseguire 1 μL su un gel di agarosio per verificare le librerie. Invia il prodotto finale per il sequenziamento.

8. Analisi dei dati

NOTA: Il pacchetto completo di CoSTseq e il codice di analisi sono disponibili su GitHub (https://github.com/NeugebauerLab/CoSTseq), e il flusso di lavoro per l'analisi è mostrato nella Figura 3. Questa pipeline è progettata per gestire sia i dati di sequenziamento CoSTseq che DMS-MaPseq. CoSTseq utilizza Snakemake, un flusso di lavoro bioinformatico che parallelizza facilmente l'analisi ottimizzando il numero di core CPU^{disponibili 19}. Il flusso di lavoro è definito da un Snakefile, che consiste in un insieme di regole che stabiliscono le analisi che verranno eseguite. Non è necessario modificare il Snakefile disponibile all'installazione del pacchetto GitHub.

1. Regola il file di configurazione (file .yaml) con i percorsi corretti per far sì che i dati grezzi siano memorizzati. In queste impostazioni dovrebbe essere incluso un percorso verso le sequenze degli adattatori e i nomi dei campioni associati. Modifica il file di configurazione per eseguire analisi specifiche definite nel Snakefile.
2. Per iniziare l'analisi, scarica le letture finali accoppiate grezze in formato fastq.gz. Le letture di processo usano fastp²⁰ per tagliare le sequenze degli adattatori e filtro di qualità per letture con punteggi Phred di almeno 20. Allinea queste letture al genoma di riferimento usando STAR²¹ per generare file BAM.
3. Come conferma aggiuntiva, visualizza i file BAM generati dopo l'esecuzione della pipeline di analisi CoSTseq nel browser Integrated Genome Viewer (IGV). Utilizzando IGV, i file BAM dovrebbero essere facilmente interpretabili per mostrare letture lungo tutte le parti dei geni di interesse, indicando che le letture rappresentano RNA nascente. Come previsto, le letture di RNA maturo dovrebbero mostrare una copertura minima nelle regioni introniche, dato che si prevede che queste letture derivino da trascrizioni mature e probabilmente splicate in modo efficiente.
4. Usa l'output fastp (un file .html che può essere aperto in un browser web) per una percentuale stimata di letture duplicate. Si noti che le letture di CoSTseq possono essere molto copiate, evidenziando la criticità del passaggio successivo.
5. Utilizzando UMICollapse²², deduplica le letture per collassare le letture con UMI e allineamenti identici, permettendo la preservazione delle letture uniche e mitigando il bias PCR. I file risultanti dovrebbero essere privi di letture duplicate e in formato BAM, dove le letture allineate all'rRNA saranno separate da quelle associate a geni non rRNA.
6. Per l'ultimo componente principale della pipeline modulare CoSTseq, si utilizza un'implementazione Python personalizzata per calcolare il conteggio delle mutazioni e la copertura di lettura su ciascun nucleotide. Le funzioni che descrivono questa implementazione si trovano nel codice sorgente su GitHub, e il file Snake dettaglia l'input, l'output, i parametri e le funzioni per generare questi dati memorizzati in formato .pkl.
   NOTA: Esistono molte altre analisi che possono essere eseguite utilizzando la pipeline di analisi CoSTseq, anche se i parametri potrebbero richiedere ottimizzazione per esigenze di analisi personalizzate. Un metodo prezioso adattato per CoSTseq è HDProbe, un pacchetto R che consente confronti genomici dei tassi di^{mutazione 10}. In breve, HDProbe richiede dati da tutte le repliche e può categorizzare metodicamente differenze significative nei tassi di mutazione rispetto al controllo. Altri tipi di analisi che si possono voler eseguire includono la previsione strutturale basata sulle reattività sperimentali del DMS. Questo può essere eseguito utilizzando il pacchetto^{RNAstructure 23}.

Figura 3: Fasi di analisi e risultati attesi della pipeline modulare di analisi CoSTseq. Fasi di analisi, che indicano l'uso raccomandato degli strumenti esistenti oltre alla pipeline di analisi CoSTseq pronta all'uso con i file di output e i contenuti attesi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Results

Questa sezione presenta i risultati effettivi generati dall'implementazione del flusso di lavoro e dell'analisi CoSTseq, come descritto in questo protocollo. Innanzitutto, questa sezione descrive i risultati attesi dopo la valutazione della qualità delle preparazioni di librerie riuscite prima e dopo il sequenziamento. Prima del sequenziamento, i ricercatori possono utilizzare un test PCR e un'analisi TapeStation per confermare la presenza di RNA dopo l'arricchimento della biotina. Ciò i...

Discussion

L'RNA inizia a piegarsi co-trascrizionalmente a causa di una cinetica più rapida dell'accoppiamento di basi rispetto alla velocità di sintesi 24,25,26,27. La nostra conoscenza attuale sul ripiegamento dell'RNA nascente deriva da studi a singola molecola su RNA procariotici, sondaggi in vitro o approcci in silico. In questo protocollo, viene pr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10mM ATP	Invitrogen	18330019
10mM Biotina-11-CTP	Bioscienze di Jena	NU-831-BIOX
10mM GTP	Invitrogen	18332015
10mM UTP	Invitrogen	18333013
10X NEBuffer 1	New England Biolabs	B7001S	Utilizzato nel passo 7.2.1
Soluzione salina tamponata con fosfato 10X (PBS)	Gibco	70011-044
20% SDS	RPI	L23100-500
Fenolo acido: cloroformio	Ambion	AM9722
Perline AMPure XP per la selezione delle dimensioni	Beckman Coulter	A63880	Utilizzato per la selezione della dimensione nel passo 7.5.1
Bacto Peptone	Gibco	211677
Estratto di lievito bacto	Gibco	212750
Bicine	Sigma Aldrich	B3876-100G
Cloroformio	Sigma Aldrich	319988
D-(+)-GLUCOSIO	Sigma Aldrich	G5767-500G
DIFCO AGAR	BD DIFCO	214010
Dimetilsolfato	Sigma Aldrich	D186309-5ML
Dinabeads e commercio; Perline MyOne Streptavidin C1	Invitrogen	65001	Utilizzato per il pulldown della biotina nella Sezione 4.1
Dinabeads e commercio; mRNA DIRECT™ Kit di purificazione	Invitrogen	61011	Utilizzato per la selezione Poly A nella Sezione 5.1
EDTA, pH 8, 0,5M	Sigma Aldrich & nbsp;	03690-100ML
Etanolo	Sigma Aldrich	E7023-500ML
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516	Co-precipitante usato nei passaggi 4.2.7 e 5.2.4
Induro e reg;   Trascrittasi inversa	New England Biolabs	M0681S	Enzima RT usato nel passo 6.3.1
Isoamil alcol	Sigma Aldrich & nbsp;	W205710-1KG-K
Isopropanolo	JT-BAKER	9084-05-01
KAPA HiFi HotStart PCR Kit	Roche	07958889001	DNA Pol ad alta fedeltà usato in 7.3.2 e 7.4.1 per le reazioni PCR
Cloruro di magnesio	Sigma Aldrich	SLCM2154
Kit di purificazione PCR MinElute	Qiagen	28004	Utilizzato per la pulizia del DNA nei passaggi 6.3.3 e 7.2.2
M-esima RNA Ligasi	New England Biolabs	M2611A
Oligo Clean & Concentratore	Zymo Research	D4060	Suggerito per la pulizia con DNA Oligo nel passo 7.1.2
Acetato di potassio	Sigma Aldrich	236497-500G
Cloruro di potassio	JT Baker	3040-01
Idrossido di potassio	Avantor	6984-04-01
RNA Pulito e Pulito Concentratore-5	Zymo Research	R1014	Kit di pulizia RNA utilizzato nel passo 5.3.2 dopo il trattamento PNK
RNaseOUT & trade; Inibitore ricombinante della ribonucleasi	Thermo Fisher Scientific	10777019	Inibitore RNase utilizzato nello step 5.3.1 durante il trattamento con PNK
Sarkosyl	IBI Scientific	IB07080
Acetato di sodio	Qualità Biologica	351-035-721
Cloruro di sodio	Sigma Aldrich	S5150-1L
Idrossido di sodio	Macron	7708-10
SUPERase· In&Trade; Inibitore RNasi (20 U/μ L)	Thermo Fisher Scientific	AM2696	Inibitore RNasi utilizzato nel passo 6.3.1
Polinucleotidico chinasi T4	New England Biolabs	M0201S
Termostabile 5' App DNA/RNA Ligase	New England Biolabs	M0319L
Tris-HCl, pH 7,4, 1M	Thermo Scientific	J60202. K2
Triton X-100	TEKNOVA	T1105
TRIZOL™ Reagente	Invitrogen	15596-026	Per l'eluzione dell'RNA nascente nella Sezione 4.2; noto anche come "reagente RNA" nella Sezione 4
β-mercaptoetanolo	Sigma Aldrich	M6250-1L