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Articolo metodologico

Nuovo modello ratto di trombosi cerebrale venosa grave stabilito tramite combinazione di semi-legazione, cloruro ferrico e trombina

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DOI:

10.3791/69961

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13 febbraio 2026

 , 
1Department of Emergency, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, The People's Hospital of Qingxian

In questo articolo

Sommario

Il nuovo modello ratto di trombosi cerebrale venosa grave (CVST), costruito tramite semi-legatura combinata con cloruro ferrico e trombina, può imitare in modo più efficace il meccanismo fisiopatologico della grave CVST negli esseri umani.

Abstract

La trombosi del seno venoso cerebrale (CVST) è un tipo distinto di ictus che colpisce prevalentemente i giovani, in particolare le donne in gravidanza. Circa il 60% dei pazienti con CVST sviluppa un infarto venoso cerebrale o un'emorragia, definita come CVST grave. Attualmente, vari metodi vengono impiegati sia a livello nazionale che internazionale per indurre la CVST in modelli animali. Tuttavia, questi modelli non riescono a replicare pienamente i meccanismi fisiopatologici alla base della grave CVST, limitando così la ricerca di base su questa condizione. Un modello di ratto nuovo di CVST grave può essere stabilito tramite semi-legatura in combinazione con cloruro ferrico e trombina. La semi-legatura è stata ottenuta misurando il flusso sanguigno cerebrale (CBF) nella regione di interesse (ROI) prima e dopo la legatura del seno sagittale superiore (SSS) utilizzando un Perfusion Speckle Imager (PSI). La semi-legatura del SSS induce la stasi sanguigna all'interno del seno venoso. L'applicazione topica di cloruro ferrico sulla superficie dell'SSS porta a lesioni endoteliali, mentre l'iniezione diretta di trombina nel seno crea uno stato ipercoagulabile localizzato. Questo approccio imita efficacemente i tre componenti chiave della formazione della trombosi: stasi, danni endoteliali e ipercoagulabilità. Il modello risultante presenta un carico trombotico significativo che coinvolge contemporaneamente più seni venosi. Il trombo indotto rimane stabile per almeno una settimana. La colorazione con cloruro 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) dimostra che questo modello può produrre costantemente un infarto venoso cerebrale su larga area, che persiste fino a 7 giorni. Questo modello può persino indurre crisi epilettiche nei ratti, una capacità che i modelli precedenti non riuscivano a raggiungere. La rottura della barriera emato-encefalica è stata osservata tramite colorazione di Evans blue (EB). Pertanto, il modello grave di CVST stabilito tramite semi-legatura combinata con somministrazione di cloruro ferrico e trombina replica in modo più accurato la progressione fisiopatologica della grave CVST nell'uomo, dimostrando stabilità e affidabilità.

Introduzione

La trombosi del seno venoso cerebrale (CVST) è una forma distinta di disturbo cerebrovascolare che si differenzia dall'ictus arterioso. Si verifica più frequentemente negli individui più giovani 1,2, in particolare nelle donnein gravidanza 3, e la sua incidenza è aumentata costantemente negli ultimi anni. Uno studio epidemiologico condotto in Australia indica che l'incidenza annuale di CVST varia da 13,0 a 15,7 casi per milione diindividui 4. Negli Stati Uniti, l'incidenza del CVST mostra una tendenza al rialzo con l'età. Tuttavia, l'età massima di insorgenza per le donne è più bassa rispetto a quella degliuomini di 5 anni. Tra il 2021 e il 2023, 43 pazienti per milione che si sono recati nei pronto soccorso negli Stati Uniti sono stati diagnosticati conCVST 6. In ambito clinico, la trombosi sinusale multipla è la forma più comunemente osservata, rappresentando circa il 57,14% di tutti i casi. Segue il coinvolgimento del seno sagittale superiore (SSS; 16,19%), del seno trasverso (11,43%) e del seno sigmoide (8,57%)4. Le principali manifestazioni cliniche includono mal di testa, che può essere accompagnato da epilessia, disturbi della coscienza e sintomi neurologicifocali 7,8,9. Tuttavia, queste manifestazioni non sono specifiche. Circa il 60% dei pazienti con CVST sviluppa un infarto venoso cerebrale o un'emorragia, classificata come graveCVST 10,11. Sebbene il trattamento della CVST includa la terapia anticoagulante e l'intervento chirurgico, il tasso di mortalità della CVST grave rimane alto fino al 34,2%. Questa alta mortalità può essere attribuita al fatto che i meccanismi fisiopatologici sottostanti della CVST grave non sono ancora pienamente compresi. Un modello animale appropriato di CVST grave è quindi uno strumento sperimentale essenziale per indagare la sua patogenesi, la progressione fisiopatologica e le potenziali strategieterapeutiche 12.

Attualmente, i metodi per indurre modelli animali CVST possono generalmente essere classificati nei seguenti tipi: legaturapermanente 13,14, induzionechimica 15,16,17, approcciinterventistici 18,19, impianto di innesti auto-realizzati 20,21,22 ed elettrocoagulazionebipolare 23,24. Il trombo indotto dai modelli animali precedenti ha avuto una breve durata e non è stato in grado di indurre simultaneamente tromboni dei seni venosi multipli e infarto cerebrale venoso di grande area. Pertanto, lo sviluppo di un modello CVST grave che coinvolga contemporaneamente più seni venosi è diventato una priorità urgente. Il metodo di semi-legatura combinato con cloruro ferrico e trombina può stabilire un nuovo modello ratto di CVST grave. Inoltre, il nuovo modello di CVST grave simula in modo più accurato il processo fisiopatologico umano della CVST grave attraverso tre aspetti chiave: carico di trombo del seno venoso, infarto cerebrale venoso e alterazione della barriera emato-encefalica. Questo modello è applicabile alla ricerca sui meccanismi fisiopatologici e sulle strategie terapeutiche per la CVST grave. Questo nuovo modello di ratti potrà essere utilizzato in futuro per indagare il meccanismo fisiopatologico della grave CVST.

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Protocollo

Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato per gli Esperimenti sugli Animali e il Benessere Sperimentale degli Animali della Capital Medical University (AEEI-2020-119) a Pechino, Cina, ed è stato condotto in conformità con i regolamenti del Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'istituzione.

1. Preparazione degli animali

  1. Assegnare casualmente maschi sani maschi sani di Sprague-Dawley (SD), con un peso corporeo medio di 300 ± 10 g, al gruppo sperimentale o al gruppo operatorio fittizio. Tutti gli animali sono stati mantenuti con un ciclo alternato di 12 ore luce/buio con accesso a cibo e acqua ad libitum.

2. Applicazione della PSI

  1. Utilizzare il PSI per monitorare continuamente le alterazioni del flusso sanguigno cerebrale (CBF) all'interno dell'SSS dei ratti durante tutto il processo di modellazione. Seleziona un'area circolare fissa all'interno dell'SSS come regione di interesse (ROI). Monitorando i cambiamenti nel CBF del ROI durante l'intervento, si determina il completamento della semi-legatura e il successo dell'induzione da trombo.

3. Stabilimento del modello di ratti a CVST severo

  1. Anestetizzare i ratti usando il 5% di enflurano, con una miscela gassa composta dal 70% di protossido azoto e 30% di ossigeno somministrata tramite una maschera anestesia. Mantieni la concentrazione di enflurano nell'intervallo dell'1%-2% durante tutto l'intervento. Posiziona i ratti anestetizzati in posizione prona con la testa fissata sulla linea mediana usando un telaio stereotassico. Mantieni la temperatura corporea a 37 ± 0,5 °C durante tutto l'intervento chirurgico utilizzando una borsa termostatica.
  2. Effettuare un'incisione longitudinale di 1,5 cm lungo la linea mediana della regione cranica del ratto. Dissezionare il tessuto sottocutaneo per esporre il cranio sottostante.
  3. Con visualizzazione microscopica, si crea una finestra cranica longitudinale (10 x 4 mm) tra il bregma e il lambda utilizzando un trapano dentale ad alta velocità. Espone la SSS e la corteccia cerebrale bilaterale preservando l'integrità della dura madre. Durante il processo di perforazione cranica, raffreddare continuamente la punta con soluzione salina normale per prevenire danni termici alla dura mater e alla corteccia.
  4. Dopo l'esposizione alla SSS, valuta il CBF del ROI nell'SSS utilizzando il PSI e registra i dati corrispondenti. Semi-lega la SSS rostralmente e caudalmente usando un 8-0 Suture di poliammide sotto osservazione microscopica.
    NOTA: Quando si lega l'SSS, la forza dovrebbe essere moderata e non eccessiva. Altrimenti, non si può ottenere un effetto di semi-legatura. La legatura dovrebbe idealmente essere eseguita in una singola procedura continua. Tentativi ripetuti di legatura possono causare la perforazione dell'SSS, compromettendo così il successo della fabbricazione del modello.
  5. Utilizzare il PSI per valutare il CBF del ROI situato nel segmento legato dell'SSS, confermando che il CBF si era ridotto a circa il 50% di quello prima della semi-legazione. Annota i risultati in modo sistematico.
  6. In condizioni protette dalla luce, immergi un filo di seta 3-0 lungo 7 mm in cloruro ferrico al 40% e usalo per coprire la superficie del sito di legatura SSS per una durata di 5 minuti. Lava il campo con soluzione salina normale dopo aver rimosso il filo di seta.
  7. Iniettare 0,1 mL di soluzione di trombona (500 U/mL) nella cavità sinusale del segmento legato utilizzando un microiniettore entro 1 minuto. Ripetere l'iniezione altre due volte consecutive, per una dose totale di trombina di 150 U. Il reflusso di trombonica nello spazio epidurale non ha portato a una trombosi scarsa.
    1. Per facilitare l'iniezione della trombina nell'SSS, piega delicatamente l'ago del microiniettore prima dell'inserimento. Questa regolazione consente un migliore controllo dell'angolo dell'ago durante la puntura e aiuta a prevenire penetrazioni indesiderate attraverso la SSS.
  8. Rivalutare il CBF del ROI utilizzando il PSI dopo l'iniezione di trombina. Assicurarsi che i risultati confermino una significativa diminuzione della CBF rispetto a quella successiva alla semi-legatura, indicando un'induzione riuscita della trombosi. Registra i dati in modo sistematico per ulteriori analisi.
  9. Sigilla la finestra ossea con cera ossea, seguita dalla sutura dell'incisione. Dopo l'intervento, somministrare ketoprofene (5 mg/kg) sottocutaneamente a ciascun ratto per alleviare il dolore post-operatorio.
  10. Nel gruppo operatore fittizio, eseguire solo la craniotomia, senza ulteriori interventi chirurgici.

4. Carico di trombosi del seno venoso e infarto cerebrale

  1. Valuta il carico della trombosi del seno venoso in tre momenti: 1 giorno, 2 giorni e 7 giorni dopo l'istituzione del modello. Sacrifica i ratti ed esegui perfusione cardiaca con soluzione salina normale in diversi momenti.
  2. Eseguire una craniotomia per valutare visivamente l'entità del coinvolgimento della trombosi del seno venoso. Isolare il trombo e sottoporre analisi quantitativa. Taglia il tessuto cerebrale e sezionalo in fette coronali spesse 2 mm.
  3. Immergi le fette in una soluzione al 2% di TTC e incuba in un bagno d'acqua a 37 °C per 20 minuti per facilitare la colorazione. Successivamente, valuta visivamente l'infarto venoso cerebrale e quantifica il volume dell'infarto utilizzando il software ImageJ per un'analisi statistica successiva.
    Volume dell'infarcto = area dell'infarto in mm quadrato x spessore [2 mm]

5. Alterazione della permeabilità della barriera emato-encefalica (BBB)

  1. Il secondo giorno dopo l'intervento, si selezionano casualmente i ratti sia dal gruppo modello che dal gruppo operatorio fittizio e si somministra un'iniezione endovenosa di Evans blue (EB) al 2% attraverso la vena caudale.
  2. Dopo 2 ore di somministrazione con successo dell'iniezione, si sopprimono i ratti e si perfondono con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) attraverso il ventricolo sinistro. Preleva i tessuti cerebrali e dividili in fette spesse 2 mm per valutare l'entità della penetrazione dell'EB.

6. Analisi statistica

  1. Effettuare analisi statistiche utilizzando il software SPSS 17.0. Presentare i dati di misurazione come media ± deviazione standard. Utilizzare l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) o un test t a campioni indipendenti per confronti di gruppo.
  2. Per l'analisi di variabili continue misurate in più punti temporali all'interno dello stesso gruppo, si utilizza ANOVA delle misure ripetute per valutare le differenze tra i gruppi tra i momenti temporali. Un p-valore inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Risultati

Processo di modellazione
La Figura 1A rappresenta l'SSS del ratto, come indicato dalla freccia. Il rostrale e il caudale dell'SSS sono stati semi-legati (Figura 1B), seguiti dall'applicazione di filo imbevuto di cloruro ferrico sulla superficie delle regioni legate (Figura 1C). Successivamente la trombina è stata iniettata nei segmenti legati per indurre la trombosi. L'area indi...

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Discussione

Un nuovo modello ratto di CVST grave costruito tramite semi-legatura combinata con cloruro ferrico e trombina, non può solo simulare la stasi sanguigna e la lesione endoteliale, ma anche lo stato ipercoagulabile del sangue, cioè simula i tre elementi della formazione dellatrombosi 25. Ciò che è ancora più entusiasmante è che il modello di ratto sviluppato con questo metodo è in grado di manifestare crisi epilettiche. Le crisi epilettiche rappresentano una manifest...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

Ringraziamo l'Istituto di Malattie Critiche del Cervello della Capital Medical University per il loro supporto tecnico. Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione per le Scienze Naturali di Pechino (n. 7182064).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2,3,5-cloruro trifeniltetrazolioSigma-Aldrich
40% cloruro ferrico Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Cina
Evans blue Sigma-Aldrich
Cuscina riscaldante Apparecchiatura Harvard Holliston, MA, USA50-7061-f, 
Trapano dentali ad alta velocità  Saeshin, Busan, Corea del SudStrong-207B
Misuratore laser a speckle & nbsp;Sistema PSI PeriCam, Svezia
MicroscopioCarl Zeiss, Inc., Berlino, Germania
Sutura in poliammide  Fabbrica di Micro Apparecchiature di Ningbo Chenghe, Cina
Fotogramma stereotassicoDavid Kopf Instruments, Tujunga, California, USA
TrombocinaChang Chun Lei Yunshang Pharmaceutical Co., Ltd., Cina

Riferimenti

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