Criosezionamento di impianti sintetici biocompatibili utilizzando resina polimerabile UV per un'analisi immunofluorescenza migliorata

Summary

Questo lavoro presenta un protocollo di criosezione che utilizza stabilizzazione con resina polimerica per mantenere l'integrità dell'interfaccia impianto-tessuto preservando l'accessibilità dell'antigene, consentendo un'analisi immunofluorescenza affidabile e ad alta risoluzione degli impianti polimerici sintetici.

Abstract

La valutazione istologica di impianti sintetici e biocompatibili presenta notevoli sfide tecniche a causa dell'incompatibilità tra i metodi convenzionali di lavorazione dei tessuti e le proprietà fisicochimiche di questi materiali. Gli approcci attuali che utilizzano l'incastramento completo della resina forniscono un'adeguata conservazione strutturale ma compromettono gravemente l'accessibilità degli epitopi, limitando così le applicazioni immunoistochimiche essenziali per caratterizzare le risposte immunitarie dell'ospite. Al contrario, l'incorporazione convenzionale della paraffina mostra una scarsa adesione ai substrati sintetici e limita la selezione degli anticorpi per un profiling immunologico completo. I protocolli standard di criosezione aumentano la compatibilità immunoistochimica migliorando la conservazione degli antigeni; tuttavia, questi metodi spesso portano a un'integrità strutturale inadeguata dei campioni contenenti impianti, compromettendo la valutazione morfologica e la qualità della sezionazione. Per affrontare queste limitazioni, è stato sviluppato un nuovo protocollo di elaborazione che incorpora una resina polimerizzabile UV per la stabilizzazione selettiva dei costrutti di tessuto impiantati prima della criosezionazione. Questa metodologia impiega una resina fotopolimerizzabile per fornire supporto meccanico preservando l'accessibilità degli epitopi e i determinanti antigenici, che sono tipicamente compromessi dalla polimerizzazione completa della resina. Il protocollo consente la generazione riproducibile di sezioni di alta qualità con spessore ottimale per la valutazione dell'immunofluorescenza, ottenendo una conservazione strutturale superiore rispetto alla sezione congelata standard senza l'estesa reticolazione che limita la penetrazione degli anticorpi nei campioni convenzionali incorporati in resina. Questo approccio rappresenta una soluzione pratica ed economica per l'elaborazione istologica degli impianti sintetici, offrendo capacità analitiche avanzate per la valutazione della biocompatibilità e facilitando la caratterizzazione dettagliata delle risposte immunitarie locali alle interfacce impianto-tessuto.

Introduction

La microscopia a immunofluorescenza è una tecnica analitica essenziale nella ricerca in medicina rigenerativa, che facilita la visualizzazione dell'architettura tissutale e della composizione cellulare utilizzando anticorpi coniugati con fluorofori. Questa metodologia integra la specificità molecolare del riconoscimento immunochimico con la sensibilità e la versatilità del rilevamento della fluorescenza, consentendo un'osservazione dettagliata delle distribuzioni cellulari dei bersagli all'interno dei loro microambienti tissutali. Gli approcci di immunofluorescenza comprendono sia strategie di marcatura diretta che indiretta, con protocolli di immunofluorescenza indiretta che forniscono un'amplificazione migliorata del segnale attraverso sistemi secondari di anticorpi coniugati con diversi fluorofori che coprono lo spettro visibile e quello del vicino^{infrarosso 1}. La capacità intrinseca della metodologia di rilevare simultaneamente più bersagli tramite separazione spettrale facilita la caratterizzazione fenotipica completa di popolazioni cellulari eterogenee e delle loro relazioni spaziali all'interno di microambienti tissutali^{complessi 2}.

Le capacità tecniche della microscopia a immunofluorescenza vanno oltre la localizzazione proteica convenzionale per includere applicazioni analitiche quantitative, incluse misurazioni dell'intensità di fluorescenza, analisi di colocalizzazione e valutazioni della distribuzione spaziale fondamentali per comprendere la funzione cellulare e l'organizzazione dei^{tessuti 3}. Nel contesto della ricerca sulla biocompatibilità degli impianti, l'analisi dell'immunofluorescenza fornisce approfondimenti fondamentali sulle risposte immunitarie dell'ospite, incluse reazioni a corpi estranei, cascate infiammatorie e processi di integrazione tissutale che determinano l'accettazione o il rifiuto dell'impianto a livello cellulare e^{molecolare 4}.

L'implementazione efficace dei protocolli di immunofluorescenza richiede un'attenta considerazione delle metodologie di elaborazione dei tessuti che preservino l'integrità morfologica mantenendo il segnale fluorescente e minimizzando l'autofluorescenza di fondo. La selezione tradizionale del mezzo di incorporamento dipende dal tipo di tessuto, dalle esigenze analitiche a valle e dagli antigeni specifici di interesse. Per materiali sintetici e impianti, la letteratura attuale raccomanda principalmente l'incorporamento completo della resina per mantenere la stabilità strutturale durante le procedure di^{sezionamento 5}. Tuttavia, questo approccio presenta limitazioni significative a causa della necessità di ultramicrotomi e lame specializzati per sezionare blocchi di resina polimerizzata, rappresentando un notevole investimento in attrezzature e competenze tecniche. L'incastramento con paraffina, pur fornendo un adeguato supporto strutturale per la sezione, introduce cambiamenti conformazionali ai determinanti antigenici durante la fissazione e la lavorazione attraverso una disidratazione estesa, indurimento chimico e infiltrazione con solventi organici che possono denaturare le proteine e mascherare gli epitopi. Il processamento della paraffina produce anche interferenze autofluorescenze intrinseche che compromettono il rilevamento del segnale e l'analisi quantitativa. Queste alterazioni richiedono procedure di recupero degli antigeni, tipicamente che coinvolgono il prelievo di epitopi indotto dal calore (HIER) o il prelievo di epitopi indotti da proteolitici (PIER), per ripristinare l'accessibilità degli^{anticorpi 6}. Nonostante questi interventi, numerosi anticorpi commercialmente disponibili rimangono incompatibili con i campioni incorporati nella paraffina, e le dure condizioni di recupero possono ulteriormente compromettere la qualità del segnale fluorescente e introdurre artefatti di fotosbiancamento.

La criosezionazione offre una metodologia alternativa di elaborazione per applicazioni di immunofluorescenza. Per la preparazione tissutale possono essere utilizzati due metodi di crioconservazione. Il primo approccio prevede la crioconservazione rapida tramite immersione diretta di campioni di tessuto fresco in un bagno di isopentano pre-raffreddato con azoto liquido per raggiungere temperature inferiori a –20 °C, seguito da una sezionazione utilizzando microtomi criostatici dotati di camere di taglio a temperatura controllata. Il secondo protocollo utilizza un breve periodo di fissazione in paraformaldeide (PFA) o formalina, seguito da crioprotezione tramite infiltrazione gradata di saccarosio prima del congelamento. Il processo di crioconservazione crea una matrice rigida che mantiene l'integrità dei tessuti preservando al contempo le conformazioni proteiche native essenziali per il riconoscimento degli anticorpi. La sezionamento congelato mantiene i tessuti in uno stato quasi nativo con modifiche chimiche^minime, riducendo così la necessità di procedure di recupero antigenico più severe e consentendo l'uso di una gamma più ampia di anticorpi primari, inclusi quelli incompatibili con i tessuti incorporati nella paraffina a causa del mascheramento dell'epitopo o della^{denaturazione 8}.

Il processo di criosezionamento utilizza tipicamente un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT), un mezzo di incorporazione solubile in acqua composto da alcol polivinilico e poliglicole che fornisce supporto strutturale durante la sezionazione, pur rimanendo trasparente e compatibile con i sistemi di rilevamento della fluorescenza. L'incorporamento OCT facilita la generazione di sezioni sottili e uniformi con spessore compreso tra 5 e 15 μm, a seconda delle specifiche esigenze analitiche e delle caratteristiche^{tissutali 9}. La conservazione delle conformazioni proteiche native nelle sezioni congelate mantiene rapporti segnale-rumore ottimali essenziali per l'analisi quantitativa dell'immunofluorescenza, mantenendo al contempo epitopi intatti che permettono l'uso di una gamma più ampia di anticorpi primari, inclusi quelli incompatibili con i tessuti incorporati in^{paraffina 8}.

Tuttavia, la sezionamento dei tessuti congelati presenta sfide tecniche uniche, in particolare nel trattamento di materiali impianti sintetici che possiedono proprietà fisicochimiche distinte rispetto ai tessuti biologici nativi. L'espansione termica differenziale tra polimeri sintetici e interfacce tessuti biologiche durante il congelamento può causare sollecitazioni meccaniche localizzate che compromettono l'integrità strutturale e crea artefatti di^{sezionamento 10}. Inoltre, la rigidità intrinseca di molti materiali sintetici rispetto ai tessuti biologici congelati può causare la deviazione della lama durante la sezione, causando spessore irregolare della sezione e danni sia al campione che all'attrezzatura di taglio. Queste limitazioni tecniche richiedono protocolli di elaborazione specializzati che possano soddisfare le esigenze uniche dei campioni contenenti impianti mantenendo al contempo i vantaggi della sezionazione congelata per applicazioni di immunofluorescenza.

Per affrontare queste limitazioni, questo studio ha sviluppato un protocollo di criosezionamento che combina la stabilizzazione selettiva con resina polimerizzabile UV con parametri di sezionamento criostatico controllati per consentire un'analisi immunofluorescenza ad alta risoluzione e multiparametro dei costrutti tessuti impiantati.

Protocol

Questa ricerca è stata condotta in conformità con le linee guida del Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali della Mayo Clinic (IACUC) con il numero di approvazione A00003765-18-24. Tutte le procedure che coinvolgevano impianti sintetici biocompatibili sono state condotte in condizioni sterili, in conformità con i protocolli di biosicurezza appropriati.

1. Elaborazione dei campioni e crioprotezione

NOTA: Maneggiare la formalina esclusivamente in una cappa chimica e indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati, poiché la formalina contiene formaldeide, un potente irritante, sensibilizzatore e cancerogeno.

1. Fissare i campioni sintetici integrati con tessuto in formalina tamponata al 10% di neutro durante la notte a 4° C utilizzando almeno 10 volumi di fissativo rispetto al volume tissutale per garantire un'immersione completa e una penetrazione adeguata. L'obiettivo di questo periodo di fissazione limitato è ottenere una minima reticolazione incrociata preservando la morfologia tissutale. (Vedi Tabella dei materiali per i materiali utilizzati nel protocollo.)
2. Trasferire i campioni in soluzione di saccarosio al 15% preparata in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per l'incubazione notturna a 4° C con agitazione delicata. Assicurarsi una completa infiltrazione di saccarosio, come dimostrato dall'affondamento dei tessuti.
3. Trasferire i campioni in soluzione di saccarosio al 30% in PBS per una seconda incubazione notturna a 4° C. Confermare l'equilibrio completo con il tessuto che affonda sul fondo del contenitore, indicando un'adeguata infiltrazione di saccarosio e uno spostamento d'acqua.
4. Prepara un rapporto volumetrico 1:1 di soluzione di saccarosio al 30% e composto OCT. Incubare i campioni in questo mezzo di transizione per 2 ore a 4° C, poi trasferire al 100% di OCT per 1 ora per raggiungere un equilibrio completo, come indicato dall'aspetto uniformemente opaco del tessuto.
5. Posizionare con cura i campioni in criostampi standard riempiti con fresco composto OCT, assicurando un orientamento ottimale per la sezionazione dei piani. Orientati con l'interfaccia impianto-tessuto disponibile per le procedure successive. Elimina le bolle d'aria usando una pinza pre-raffreddata.
6. Posizionare criostampi riempiti immediatamente sulla piattaforma di ghiaccio secco per creare un gradiente di temperatura che favorisca la rapida formazione di cristalli di ghiaccio dal basso verso l'su. Monitorare per 10–15 minuti fino alla solidificazione completa, confermato dall'aspetto opaco bianco caratteristico del composto OCT congelato. Trasferire i blocchi congelati in una stoccazione a –80° C o direttamente nella camera criostatica per la sezionazione immediata.

2. Installazione del criostato e sezionamento iniziale

1. Mantieni la camera a temperatura controllata a criostato a –15° C. Verifica la temperatura utilizzando un monitoraggio digitale integrato e bilancia durante la notte prima dell'introduzione del campione.
2. Installa nuove lame usa e getta. Imposta l'angolo della lama per la sezionazione combinata di materiali sintetici-biologici secondo le specifiche del produttore.
3. Lo spessore desiderato della sezione (50–100 μm) viene programmato nel criostato selezionando l'impostazione Spessore sul pannello di controllo, regolando con i tasti freccia e confermando il parametro premendo il tasto Sede .
4. Avanzare attraverso il campione incorporato per raggiungere la profondità predeterminata corrispondente all'interfaccia impianto-tessuto. Monitorare la superficie avanzante della sezione per identificare il piano ottimale per l'applicazione della resina UV, caratterizzato da sottili cambiamenti nell'opacità tissutale e nell'esposizione iniziale dell'impianto alla periferia, e la profondità viene confermata quando queste caratteristiche rimangono costantemente visibili nelle sezioni successive tagliate.
   NOTA: Fermare la sezionazione immediatamente al raggiungimento dell'interfaccia critica per impedire l'avanzamento oltre la regione target.

3. Applicazione di resina polimerizzabile ai raggi UV

NOTA: Maneggiare la resina polimerizzabile ai raggi UV in un'area ben ventilata indossando i DPI adeguati e proteggere occhi e pelle dalla luce di polimerizzazione LED-UV. Queste resine contengono irritanti che possono causare reazioni cutanee e oculari, e l'esposizione LED-UV può causare lesioni oculari indotte dai raggi UV.

1. Tagliare il parafilm con forbici a dimensioni 2–3 mm oltre il perimetro dell'impianto. Separati con cura dal supporto protettivo della carta usando pinze sterili.
2. Dispensare 5–10 μL di resina polimerizzabile ai raggi UV sulla superficie del parafilm esposta (Figura 1A). Il volume della resina viene ottimizzato conducendo applicazioni di test preliminari in cui vengono erogati volumi incrementali e la distribuzione risultante viene valutata visivamente per garantire una copertura uniforme della superficie del campione senza traboccamento o accumulo eccessivo di resina che interferirebbero con la sezionazione.
3. Sostituire immediatamente il supporto protettivo della carta su parafilm caricato di resina. Applicare un rullo di giunzione in poliuretano (2 pollici) con pressione costante in passaggi paralleli sovrapposti, seguiti da passaggi perpendicolari per ottenere uno strato di resina sottile e uniforme (Figura 1B).
4. Rimuovere con cura lo strato protettivo di carta, rivelando una pellicola di resina distribuita uniformemente. Posizionare la resina-parafilm direttamente sulla superficie esposta dell'impianto, assicurando un allineamento preciso con l'interfaccia impianto-tessuto (Figura 1C).
5. Applicare un rullo di cucitura in poliuretano dal centro dell'impianto verso l'esterno per eliminare le bolle d'aria e garantire un contatto intimo tra la resina e sia le superfici sintetiche che biologiche (Figura 1D).
6. Posizione sorgente luminosa UV di lunghezza d'onda 405 nm a distanza di 2–3 cm direttamente sulla superficie dell'impianto. Esporre per 90 secondi per garantire una polimerizzazione completa, verificata tramite valutazione tattile della durezza della resina e delle caratteristiche non appiccicose (Figura 1E). Posizionare una copertura protettiva UV sopra la finestra della camera criostatica prima della fotopolimerizzazione UV per proteggere l'operatore dall'esposizione dannosa ai raggi UV durante la procedura di polimerizzazione della resina.

4. Recupero della sezione e preparazione delle lame

1. Rimuovere il parafilm usando un unico movimento continuo per evitare interruzioni meccaniche dell'interfaccia resina-tessuto. L'adesione completa alla resina viene confermata ispezionando la superficie esposta sotto l'illuminazione criostatica per una copertura uniforme della resina, l'assenza di sollevamento al bordo del tessuto e l'assenza di residui visibili di parafilm.
2. Campioni di sezione a uno spessore predeterminato di 8 μm utilizzando un meccanismo di avanzamento calibrato del microtomo. Monitorare ogni sezione per uno spessore costante e l'assenza di artefatti (compressione, strappo, sezioni incomplete). Posiziona la piastra anti-rollio in modo ottimale per evitare che si arriccili (Figura 1F).
   NOTA: Si utilizzano vetrini adesivi idrofili e caricati positivamente perché offrono una migliore ritenzione di campioni difficili, migliorando l'adesione durante il trasferimento della sezione e la successiva lavorazione. Etichetta le slide singolarmente prima del trasferimento della sezione.
3. Posizionare la superficie adesiva del slide, assicurando il contatto iniziale al bordo della sezione prima del contatto progressivo su tutta l'area. Assicurarsi che la superficie in resina polimerizzata ai raggi UV aderisca al vetrino, mantenendo la superficie del tessuto sollevata per l'immunofluorescenza (Figura 1G).
4. Premi delicatamente il gruppo della sezione per eliminare le bolle d'aria. Verifica la corretta orientazione sotto l'illuminazione criostatica, confermando l'interfaccia impianto-tessuto intatta.

5. Conservazione e conservazione

1. Posizionare le diapositive complete in scatole di stoccaggio pre-etichettate a –20° C per applicazioni che richiedono elaborazione entro 72 ore.
2. Utilizzare condizioni di 80° C per periodi di conservazione superiori a una settimana.

6. Protocollo di colorazione immunofluorescenza

NOTA: Maneggiare la pepsina con i DPI appropriati, poiché è un irritante per la pelle e le respirazioni.

1. Recuperare i vetrini dallo stoccaggio e trasferirli nelle camere di umidità per 15–20 minuti per un equilibrio a temperatura ambiente.
2. Esegui tre cicli di lavaggio PBS consecutivi di 2 minuti ciascuno.
3. Recupero di antigeni:
   1. Metodo di recupero epitopo indotto dal calore (HIER): posizionare i vetri orizzontalmente in contenitori adatti a microonde con soluzione di recupero bersaglio 1x. Microonde (uscita da 1000 watt) ad alta potenza, per 15 minuti, seguita dal raffreddamento a temperatura ambiente.
   2. Metodo di recupero dell'epitopo indotto da proteolisi (PIER): applicare 100–150 μL di soluzione pronta all'uso per sezione. Copri con copertine di plastica temporanee e incuba a 37° C per 10 minuti in una camera umidificata.
4. Esegui tre cicli di lavaggio PBS consecutivi (2 min ciascuno).
5. Applicare 1 mL di soluzione bloccante contenente lo 0,1% di saponina e il 2,5% di siero normale di capra in PBS. Incubare 30 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata.
6. Esegui tre cicli di lavaggio PBS consecutivi (2 min ciascuno).
7. Applicare soluzioni primarie di anticorpi da 100 μL a concentrazioni ottimizzate:
   1. Anti-Collagene IV rabbit polyclonal a diluizione 1:100.
   2. Anti-Laminina policlonale di coniglio a diluizione 1:500.
   3. Anticorpo monoclonale anti-F4/80 a diluizione 1:500.
8. Copri con coperture di plastica temporanee e incuba durante la notte a 4° C in camere umidificate.
9. Esegui tre cicli di lavaggio PBS (2 min ciascuno).
10. Applicare anticorpi secondari a una concentrazione di 10 μg/mL.
    1. Anti-Coniglio IgG Alexa Fluor Plus 555
    2. Capra Anti-Coniglio IgG Alexa Fluor 488
11. Incubare per 60 minuti a temperatura ambiente in condizioni di buio.
12. Colorazione opzionale per l'agglutinina del germe di grano (WGA):
    1. Applica WGA-Alexa Fluor 647 a 5 μg/mL in PBS con il 2,5% di siero normale per capra.
    2. Copri e incuba a 37° C per 30 minuti. Esegui tre cicli di lavaggio PBS consecutivi di 2 minuti.
13. Applicare un mezzo di montaggio rigido da 80 μL con controcolorante nucleare per sezione.
14. Copri il copertino con il vetro di copertura per eliminare le bolle d'aria.
15. Lascia asciugare i vetri orizzontalmente a temperatura ambiente per 2 ore al buio.
16. Conserva a 4° C per fino a una settimana per una qualità ottimale dell'immagine.

7. Microscopia a fluorescenza e acquisizione di immagini

1. Eseguire immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita con set di filtri del produttore: eccitazione/emissione 360/460 nm, eccitazione/emissione 470/525 nm, eccitazione/emissione 545/605 nm, eccitazione/emissione 620/700 nm.
2. Le immagini vengono catturate selezionando ogni canale di fluorescenza all'interno del menu Filtro del software del microscopio. Prima dell'ottimizzazione dell'esposizione, viene eseguita una procedura di bilanciamento del nero selezionando Regola Bilanciamento del nero per garantire una correzione accurata della linea di base per ogni canale. I parametri di esposizione vengono quindi ottimizzati aprendo la finestra di cattura dell'immagine , abilitando la modalità Live e regolando i controlli di esposizione e intensità luminosa fino a raggiungere un alto rapporto segnale-rumore senza saturazione dei pixel. La saturazione viene monitorata tramite il display Istogramma del software e lo strumento Highlight Saturated Pixels . Ogni canale viene regolato indipendentemente prima dell'acquisizione dell'immagine.
3. Effettuare l'acquisizione automatica delle piastrelle con la sovrapposizione del 10% del produttore tra i campi adiacenti. Mantieni l'adattamento automatico della messa a fuoco durante tutta la sequenza di acquisizione.

Results

Valutazione e ottimizzazione della qualità delle sezioni
Dopo la stabilizzazione e la sezionazione in resina UV a 8 μm di spessore, raccogliere le sezioni su vetrine adesive e valutare il controllo qualità. Sezioni di alta qualità dimostrano una morfologia intatta senza crepe significative o artefatti di frattura, con architettura tissutale continua e un'interfaccia impianto-tessuto preservata (Figura 2A). Le sezioni che presentano danni ...

Discussion

Questo metodo di stabilizzazione con resina polimerabile UV offre un approccio alternativo per criosezionare campioni di tessuto incorporati in OCT contenenti materiali sintetici altrimenti difficili da processare utilizzando tecniche standard di sezionamento congelato. Sebbene siano disponibili diverse opzioni di adesivo, come vetrini caricati, nastri adesivi e altri supporti adesivi, per aiutare a prevenire il distacco di sezioni di tessuto o campioni fragili durante la manipolazione, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5W Luce ultravioletta a collo d'oca 395– 405 nm per l'indurimento della resina	Amazon	UPC & lrm; 603335835561
Anticorpo - Anti-F4/80 (Monoclonale)	Abcam	ab300421	1:500
Anticorpo - Collagene IV (Policlonale)	Abcam	ab6586	1:100
Anticorpo - IgG Anti-Coniglio Asino AlexaFluor Plus 555	Invitrogen	A32794	10 ug/mL
Anticorpo - Capra anti-coniglio IgG AlexaFluor 488	Invitrogen	A-11008	10 ug/mL
Anticorpo - Laminina (policlonale)	Invitrogen	PA1-16730	1:500
BioMed Clear	Formlabs	FLBMCL01	Materiale biocompatibile #1
BioMed Durabile	Formlabs	FLBMDU01	Materiale biocompatibile #2
Formalina al 10% tamponata	Cardinal Health	C4320-101
BZ-X Filter Cy5	Keyence	OP-87766	Set di filtri
FILTRO BZ-X DAPI 	Keyence	OP-87762	Set di filtri
Filtro BZ-X GFP	Keyence	OP-87763	Set di filtri
Filtro BZ-X TRITC	Keyence	OP-87764	Set di filtri
Software analizzatore BZ-X800	Keyence	BZ-X800	Software integrato
Fisherbrand Premium Coverglass  50 x 24 mm	Fisher Scientific	12-544-14
Stampante 3D Form4B	FormLabs	F4B-Stampante
Serbatoio di resina Form4	Formlabs	RT-F4-01
Siero di capra	Gibco	16210064
Criostato HM525 NX	Epredia	956641EC
Forno a microonde domestico	Panasonic	NN-S766BA	Uscita da 1000 watt
Sottili in plastica IHC-Tek 24 mm x 60 mm	IHC World	IW-2601	Copertura temporanea
JDiction Resina UV a bassa viscosità	Amazon	6974143904430	Alta autofluorescenza
Keyence BZ-X800	Keyence	BZ-X800
Let's Resin UV Resin Clear Hard Type	Amazon	ALR00038	Alta autofluorescenza
Let's Resin Resina Clear UV Resina ad alta viscosità	Amazon	ALR00048
Vetrini per vetrata micro Matsunami MAS	Offerta di nuovi arrivati	SUMAS1190	Slide adesivo
Impianto chirurgico Medpor	Stryker	8662	Materiale biocompatibile #3
Mr. Resina UV Resina Cristallina	Amazon	B08FRF9QTB	Alta autofluorescenza
MX35 Ultra Microtome Blade	Epredia	3053835
Pellicola di laboratorio Parafilm M	Parafilm	P7543-1EA
Pepsin	Sigma	R2283-15ML
Soluzione salina tamponata con fosfato pH 7,4	Sigma	P3813
Piano Apo & lambda; 40X	Keyence	BZ-PA40	Obiettivo
Piano Apo & lambda; 4X	Keyence	BZ-PA04	Obiettivo
Rullo a cucitura in poliuretano	Amazon	682698799567
Attacco antifade in vetro ProLong con tinta NucBlue	Invitrogen	P36985	Hoechst 33342 Controcolorazione
Saponin	Millipore	558255-100GM
StainTray	Simport	M920-2
Lamina di silicone sterile	Bentec	PR72034-51N
Soluzione di recupero bersaglio, citrato pH6	Agilent	S236984-2
Composto Tissue-Tek O.C.T	Sakura	4583
Agglutinina per germi di grano AlexaFluor 647	Invitrogen	W32466	5 ug/mL