Visualizzazione tridimensionale dei vasi linfatici nella pelle umana e dei loro cambiamenti strutturali durante il linfedema

Summary

Qui, una visualizzazione tridimensionale della struttura dei vasi linfatici nella pelle umana è stata ottenuta utilizzando microscopia confocale o a foglio luminoso dopo l'applicazione di tre distinte tecniche di pulizia dei tessuti. La combinazione di questi metodi con la colorazione immunoistochimica fornisce una comprensione dei cambiamenti funzionali nei vasi linfatici durante la progressione del linfedema.

Abstract

I vasi linfatici della pelle, che comprendono capillari e vasi raccoglitori, svolgono ruoli chiave nella rimozione dei rifiuti e nelle risposte immunitarie, e sono essenziali per il mantenimento dell'omeostasi tissutale. Tuttavia, la pelle umana, con i suoi tre strati — epidermide, dermide e grasso sottocutaneo — contiene una densa matrice extracellulare ricca di collagene, rendendo così difficile visualizzare le reti linfattiche in tre dimensioni. Per affrontare questa limitazione, questo articolo introduce tre metodi distinti, ciascuno adattato a specifiche molecole di interesse e obiettivi sperimentali, per la visualizzazione tridimensionale delle linfatatiche cutanee umane utilizzando reagenti per la pulizia dei tessuti in combinazione con microscopia confocale o a foglio luminoso. Puntando sulle molecole di giunzione aderente nelle cellule endoteliali linfatiche tramite immunoistochimica, sono stati valutati cambiamenti strutturali con chiare implicazioni funzionali, in particolare il caratteristico rimodellamento simile a bottone a cerniera delle giunzioni capillari, nei tessuti cutanei derivati da pazienti con linfedema secondario. Questa tecnica di visualizzazione tridimensionale rivela strutture vascolari che non sono riconoscibili tramite l'analisi convenzionale delle sezioni tissutali istologiche, migliorando così la comprensione della struttura e della funzione dei vasi linfatici.

Introduction

Cresce l'interesse per la funzione dei vasi linfatici da quando è stato riconosciuto il loro ruolo nel mantenimento dell'omeostasi cutanea, oltre al loro ben consolidato coinvolgimento nella metastasi^{tumorale 1,2}. I vasi linfatici sono strutturalmente divisi in capillari e vasi raccoglitori, ciascuno con caratteristiche distinte. I capillari linfatici sono costituiti da una struttura a singolo strato formata da cellule endoteliali linfatici e fungono da punti di raccolta iniziale per il liquido interstiziale, i prodotti di scarto e le cellule immunitarie. Al contrario, i vasi linfatti collettori hanno una struttura a due strati con cellule muscolari lisce che circondano lo strato endoteliale linfatico, permettendo il trasporto attivo del liquido linfatico raccolto dalla rete capillare verso la circolazione^{centrale 3}. I modelli murini sono stati utilizzati per chiarire le caratteristiche strutturali, in particolare dei vasi linfatici bronchiali, e hanno dimostrato come le condizioni infiammatorie inducano il rimodellamento^{strutturale 4}. Lavori precedenti hanno dimostrato che l'infiammazione indotta dai raggi ultravioletti causa una dilatazione anomala dei capillari linfatici, compromettendo così la loro funzione di raccolta dei liquidi. Sono stati identificati i meccanismi molecolari alla base di questa disfunzione, mostrando in particolare che l'aumento dell'espressione di VEGF-A unito a una diminuzione dell'espressione di VEGF-C alimenta queste alterazioni ^{strutturali 5,6,7}.

Sebbene le tecniche di visualizzazione tridimensionale abbiano significativamente fatto avanzare la comprensione della rete linfatica nei modelli^{murini 8,9}, un'analisi strutturale comparabile dei vasi linfatici umani è rimasta una sfida. Questa lacuna analitica deriva dalle difficoltà nel lavorare con i tessuti umani, inclusa la limitata disponibilità di campioni e le problematiche tecniche necessarie per ottenere un'imaging tridimensionale completo. In particolare, la pelle, caratterizzata da una struttura a tre strati composta da epidermide, dermide e grasso sottocutaneo, e che funge da barriera all'ambiente esterno, presenta sfide maggiori rispetto ad altri organi molli. Inoltre, la pelle umana presenta sfide analitiche distinte rispetto ai modelli murini, tra cui uno spessore tessutale maggiore, che ostacola la penetrazione profonda dell'imaging. Inoltre, le abbondanti componenti della matrice extracellulare, in particolare il collagene, insieme alle loro alterazioni strutturali legate all'età, creano barriere ottiche che riducono l'efficacia delle tecniche emergenti di pulizia dei tessuti che hanno rivoluzionato l'imaging linfatico^{nei topi 10}.

Vari agenti dissuferitori dei tessuti sono stati precedentemente testati per visualizzare i capillari della pelle umana, dimostrandone la compatibilità^{tissutale 11}. A seguito di questo lavoro, sono stati utilizzati con successo reagenti per purificare i tessuti per visualizzare i vasi linfatici della pelle umana in tre dimensioni¹². Concentrandosi sulle giunzioni aderenti delle cellule endoteliali linfatici, sono state identificate modifiche strutturali nei vasi linfatici associate alla progressione del^{linfedema 13}. Lo scopo di questo articolo è descrivere in dettaglio le procedure per la visualizzazione tridimensionale dei vasi linfatici della pelle umana utilizzando combinazioni di tre tecniche di pulizia della pelle, insieme a microscopia confocale e microscopia a foglio luminoso, e colorazione immunoistochimica adattata a specifici obiettivi di ricerca. In questo studio, sebbene ci concentriamo esclusivamente sui tessuti cutanei umani freschi che sono stati sistemati il giorno dell'escissione e non hanno subito cicli di congelamento-disgelo, queste tecniche forniscono informazioni non solo sui cambiamenti strutturali dei vasi linfatici durante la malattia e l'invecchiamento, ma anche sulle relative alterazioni funzionali.

Protocol

Campioni di pelle di soggetti umani sono stati prelevati dall'Ospedale Universitario di Chiba (Chiba, Giappone). Tutte le procedure che coinvolgono soggetti umani sono state approvate dal Consiglio di Revisione Istituzionale dell'Ospedale Universitario di Chiba e dal Centro Globale di Innovazione Shiseido, e tutti i soggetti hanno fornito un consenso scritto e informato. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Pretrattamento dei campioni di pelle umana

1. Rimuovere il tessuto sottocutaneo dei campioni essiccati al momento dell'acquisizione.
   NOTA: L'intervallo tra l'escissione e l'acquisizione della pelle era di circa h. Durante il trasporto, il tessuto veniva immerso nel DMEM e mantenuto su impacchi di ghiaccio.
2. Posiziona i campioni con il lato epidermico verso il basso su una piastra calda a 60 °C per 45 secondi per separare epidermide e derma.
3. Immergi immediatamente i campioni in PBS gelido.
4. Separare epidermide e derme con una pinzetta.
5. Fissare le parti dermiche con paraformaldeide al 4°C per 16 ore, poi lavare con PBS prima dell'uso.
   NOTA: Dopo la fissazione, i campioni sono stati conservati in PBS a 4 °C e le fasi di immunocolorazione sono state avviate entro pochi mesi.
   ATTENZIONE: La soluzione PFA è tossica. Tutta la preparazione e la maneggiatura devono essere effettuate in una cappa fumaria indossando l'attrezzatura di protezione personale appropriata.

2. Immunocolorazione a montaggio intero combinata con reagenti di pulizia

1. Tecnica iDISCO
   1. Ritaglia gli esemplari a circa 5 mm × 5 mm × 5 mm di dimensione.
   2. Trasferire i campioni in 5% di Triton X-100 e 2,5% Tween 20 in PBS su uno shaker orbitale impostato a 50 giri/min a 24 °C per 16 ore per la permeabilizzazione.
   3. Lavare i campioni con PBS a 24 °C per 1 ora, ripetendo il processo tre volte.
   4. Immergi i campioni nel buffer di blocco A appena preparato (1% BSA, 0,1% Tween 20, 0,03% azide di sodio in PBS) su uno shaker orbitale impostato a 50 giri/min a 24 °C per 72 ore.
   5. Incubare i campioni con anticorpi primari contro la podoplanina (1:100) in un buffer bloccante A su uno shaker orbitale impostato a 50 giri/min a 37 °C per 72 ore.
   6. Lavare i campioni con il tampone di lavaggio A (0,1% Tween-20 in PBS) a 24 °C per 1 ora, ripetendo il processo tre volte. Poi, mantenere i campioni nel tampone di lavaggio A su uno shaker orbitale impostato a 50 giri/min a 4 °C per 72 ore.
   7. Incubare i campioni con un anticorpo secondario contro l'IgG del topo coniugato ad Alexa Fluor 647 (1:1000) in un buffer bloccante A su uno shaker orbitale impostato a 50 giri/min a 37 °C per 72 ore.
   8. Ripeti il passo 1.6.
   9. Incubare i campioni con il 50% di MeOH a 24 °C per 3 ore.
   10. Incubare i campioni con il 70% di MeOH a 24 °C per 3 ore.
   11. Incubare i campioni con MeOH al 100% a 24 °C per 16 ore.
   12. Incubare i campioni con diclorometano a 24 °C per 15 minuti, ripetendo il processo due volte.
   13. Liberare i campioni con dibenzilo etere a 24 °C per 16 ore.
       NOTA: Se il tessuto non è diventato trasparente a questo punto, un'attesa ulteriore non porterà a miglioramenti significativi.
   14. Cattura immagini dei campioni con un microscopio a foglio luminoso.
       NOTA: Usa un Lightsheet con un obiettivo EC Plan-Neofluar 5×/0.16; impostare l'illuminazione (eccitazione) a 63 nm e la rilevazione a 648 nm; acquisire uno stack Z con una dimensione di passo di 5,8 μm.
       ATTENZIONE: Metanolo, diclorometano ed etere dibenzilico sono pericolosi. Tutta la preparazione e la maneggiatura devono essere effettuate in una cappa fumaria indossando l'attrezzatura di protezione personale appropriata.
2. Reagente Rapiclear 1.52
   1. Taglia gli esemplari a circa 5 mm × 5 mm × 2 mm di dimensione.
   2. Trasferire i campioni in Triton-X 100 al 2% in PBS su uno shaker orbitale impostato a 50 giri/min a 24 °C per 16 ore per la permeabilizzazione.
   3. Immergi i campioni nel buffer bloccante B appena preparato (5% siero d'asino e 1% Triton-X 100 in PBS) su uno shaker orbitale impostato a 50 giri/min a 4 °C per 16 ore.
   4. Incubare i campioni con anticorpi primari contro podoplanina e VE-cadherin (entrambi a 1:100) in un buffer bloccante B su uno shaker orbitale impostato a 50 giri/min a 4 °C per 72 ore.
   5. Lavare i campioni con il tampone di lavaggio B (3% NaCl e 0,2% Triton-X 100 in PBS) a 24 °C per 1 ora, ripetendo il processo tre volte. Poi, mantenere i campioni nel buffer di lavaggio B su uno shaker orbitale impostato a 50 giri/min a 4 °C per 16 ore.
   6. Lavare i campioni con PBS a 24 °C per 1 ora.
   7. Incubare i campioni con anticorpi secondari contro l'IgG del topo e l'IgG del coniglio, coniugati rispettivamente ad Alexa Fluor 647 e 568 (entrambi a 1:1000), bloccando il buffer B su uno shaker orbitale impostato a 50 giri/min a 4 °C per 16 ore.
   8. Ripeti i passaggi 1.5. e 1.6.
   9. Rimuovere i campioni con almeno 5 volte il volume di campione di Rapiclear 1,52 a 24 °C per 16 ore.
      NOTA: La pulizia delle regioni periferiche del tessuto è stata osservata in meno di 1 ora.
   10. Immergere i campioni liberati in una camera gel di polidimetilsilossano posta su un copertura con il reagente Rapiclear 1.52 fresco.
   11. Immagini i campioni con un microscopio confocale.
       NOTA: Utilizzare un microscopio confocale con obiettivo Plan-Apochromat 10×/0,45 M27; imposta l'eccitazione a 633 nm e 561 nm, e la portata di rilevamento 641-754 nm e 566-628 nm, con un rivelatore GaAsP; acquisire uno Z-stack con una dimensione di passo di 3,15 μm.
3. Tecnica CUBIC
   1. Ritaglia gli esemplari a circa 5 mm × 5 mm × 3 mm di dimensione.
   2. Immergere i campioni nel 50% CUBIC-L a 24 °C per 24 ore come pretrattamento per la delipidazione.
   3. Trasferire i campioni al 100% CUBIC-L su uno shaker orbitale impostato a 50 giri/min a 37 °C per 7 giorni per la delipidazione.
   4. Lava i campioni con PBS a temperatura ambiente per 24 ore.
   5. Immergi i campioni in un buffer di blocco A appena preparato su uno shaker orbitale impostato a 50 giri al minuto a 24 °C per 72 ore.
   6. Incubare i campioni con anticorpi primari contro VE-cadherina, podoplanina e CD31 (rispettivamente 1:100, 1:100 e 1:200) in un buffer di blocco A su uno shaker orbitale impostato a 50 giri/min a 37 °C per 72 ore.
   7. Lavare i campioni con il tampone di lavaggio A a 24 °C per 1 ora. Ripetere il processo tre volte, poi mantenere i campioni nel tampone di lavaggio A su uno shaker orbitale impostato a 50 giri/min a 4 °C per 72 ore.
   8. Incubare i campioni con anticorpi secondari contro IgG di topo, IgG di coniglio e IgG di pecora, coniugati rispettivamente con Alexa Fluor 647, 568 e 488 (tutti a 1:1000), bloccando il buffer A su uno shaker orbitale impostato a 50 giri/min a 37 °C per 72 ore.
   9. Ripeti il passo 3.7.
   10. Pre-clearare i campioni con il 50% CUBIC-R+(M) a 24 °C per 16 ore.
   11. Rimuovere i campioni con 100% CUBIC-R+(M) a 24 °C per 16 ore.
       NOTA: Se il tessuto non è diventato trasparente a questo punto, un'attesa ulteriore non porterà a miglioramenti significativi.
   12. Immagini i campioni con un microscopio confocale.
       NOTA: Utilizzare un microscopio confocale con obiettivo Plan-Apochromat 20×/0,8 M27; impostare l'eccitazione a 633 nm, 561 nm e 488 nm, e la portata di rilevamento 641-754 nm, 566-628 nm e 479-550 nm, con un rivelatore GaAsP; acquisire uno stack Z con una dimensione di passo di 0,78 μm.

Results

Differenza nella trasmittenza luminosa del tessuto cutaneo umano purificato con e senza epidermide
La Figura 1 mostra fotografie rappresentative di campioni di pelle umana con e senza epidermide, dopo permeabilizzazione e pulizia con il reagente Rapiclear 1.52. La rimozione epidermica migliora la trasparenza tissutale eliminando la melanina, un potente assorbente di luce, come confermato dalla maggiore visibilità della linea nera sotto i...

Discussion

La visualizzazione tridimensionale delle reti linfatiche nei tessuti biologici è di importanza cruciale per comprenderne le caratteristiche strutturali e le funzioni fisiologiche, nonché i cambiamenti patologici. Questo protocollo presenta tre metodi distinti di pulizia dei tessuti ottimizzati per il tessuto cutaneo umano, ciascuno su misura per specifici obiettivi osservativi.

La rimozione epidermica è considerata un passaggio fondamentale per eliminare la me...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorpo anti-CD31	R& Sistemi D	AF806	diluizione a 1:200
Anticorpo anti-Podoplanin	Dako	M3619	diluizione a 1:100
Anticorpo anti-VE-cadherina	Tecnologia di segnalazione cellulare	#2500	diluizione a 1:100
CUBIC-L	Industria chimica di Tokyo	T3740
CUBIC-R+(M)	Industria chimica di Tokyo	T3741
DMEM, basso livello di glucosio, piruvato	Thermo Fisher SCIENTIFIC	11885084
Anticorpo secondario anti-topo IgG (H+L) Asino Altamente Adsorbito, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher SCIENTIFIC	A-31571	diluizione a 1:1000
Anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorpo secondario altamente adsorbito incrociatato, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher SCIENTIFIC	A10042	diluizione a 1:1000
Anticorpo secondario adsorbito incrociato anti-Ogg per Asino (H+L), Alexa Fluor 488	Thermo Fisher SCIENTIFIC	A-11015	diluizione a 1:1000
Rapiclear 1.52	Laboratorio Sunjin	RC152001
Microscopio ZEISS Lightsheet Z.1	Carl Zeiss
Microscopio laser confocale ZEISS LSM 880	Carl Zeiss