Effetto della lunghezza del seme e dei motivi di legame sull'annealing sRNA-mRNA mediato da Hfq analizzato utilizzando FRET a molecola singola

Summary

Un saggio FRET a singola molecola consente un'analisi quantitativa del ricottura mediata da Hfq tra sRNA batterici e mRNA, consentendo la misurazione della cinetica e della stabilità delle interazioni. I risultati rappresentativi dimostrano come la lunghezza del seme, i motivi di legame Hfq e la spaziatura dei motivi influenzino la formazione duplex dell'RNA.

Abstract

Definire le regole che regolano l'annealing tra piccoli RNA batterici (sRNA) e i loro target di mRNA è una sfida perché questi RNA sono altamente eterogenei sia nella sequenza che nella struttura. Per districare il contributo delle singole caratteristiche, abbiamo sistematicamente variato i determinanti chiave, inclusi la resistenza del seme, i motivi di legame Hfq e la distanza tra di essi. Gli effetti di queste caratteristiche sulla stabilità duplex sRNA-mRNA sono stati testati utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di Förster a singola molecola (smFRET), che consente il monitoraggio di singole molecole di RNA su scala temporale di millisecondi e fornisce accesso a eventi dinamici spesso oscurati negli saggi di ensemble.

Dimostriamo che le regioni semi brevi (4-5 pb) formano complessi instabili e a breve durata, mentre semi più lunghi (8-10 pb) producono duplex stabili. Estendere i motivi di legame Hfq o introdurre uno spaziore tra i siti di legame sull'mRNA ha ulteriormente aumentato la durata delle interazioni, evidenziando l'importanza della resistenza dei motivi e della disposizione spaziale nell'efficienza di ricottura mediata da Hfq. Inoltre, questo approccio fornisce un quadro robusto e riproducibile per dissezionare la dinamica di interazione RNA-RNA a risoluzione singola e per sondare i meccanismi di chaperone RNA.

Introduction

L'espressione genica batterica è ampiamente regolata a livello post-trascrizionale da piccoli RNA. Questi RNA corti (tipicamente 50-300 nt) agiscono accoppiando basi con gli mRNA target¹. In molti casi, gli sRNA si annealzano ai siti di legame del ribosoma per reprimere la traduzione o innescare il decadimento dell'mRNA reclutando RNasi ^2,3. Sebbene queste interazioni siano state ampiamente studiate tramite saghi genetici e biochimici, la maggior parte degli approcci disponibili deduce una regolazione indiretta da effetti a regime stazionario sui livelli di RNA o sull'output proteico, rendendo difficile risolvere la dinamica di legame sottostante.

Una regolazione efficiente del bersaglio richiede spesso il chaperone RNA Hfq, una piccola proteina esamera simile allo^{Sm 4,5}. Hfq estende l'emivita degli sRNA schermandola dalle^{nucleasi 6} e promuove l'annealing con gli mRNA target ^7,8. Hfq svolge queste funzioni tramite tre distinte superfici di legame dell'RNA con preferenze differenti: il volto distale riconosce motivi AAN solitamente presenti negli mRNA, il volto prossimale lega sequenze ricche di U tipiche dei terminator sRNA, e il bordo interagisce elettrostaticamente con le spine dorsuali^{dell'RNA 9}. Hfq, tuttavia, è presente in abbondanza molto inferiore rispetto al pool totale di RNA^{interagenti 10,11}. Nonostante questa apparente limitazione, gli sRNA appena sintetizzati trovano rapidamente i loro bersagli e attivano la regolazione entro pochi minuti dalla^{trascrizione 12}. Questo paradosso suggerisce che le interazioni RNA-Hfq siano altamente dinamiche, con gli RNA che si associano e dissociano continuamente invece di rimanere legati in complessi stabili^13,14. Comprendere come tali interazioni transitorie producano una regolazione affidabile richiede l'accesso sperimentale agli eventi di legame individuali piuttosto che alle medie della popolazione.

Le interazioni tra sRNA e mRNA sono mediate da sequenze semi imperfettamente complementari, che devono localizzare i loro siti di corrispondenza all'interno di mRNA spesso lunghi e altamente strutturati. Inoltre, la distanza tra la regione seme di sRNA e il sito di legame Hfq sull'mRNA può variare^{considerevolmente di 15}, complicando ulteriormente il processo di ricottura. Hfq aiuta a superare queste sfide trasferendo in modo flessibile gli sRNA tra potenziali siti di legame sul bersaglio, aumentando così la probabilità di incontrare la corretta regione^{di accoppiamento 16}. L'accoppiamento mediato da Hfq può anche rimodellare le strutture locali degli mRNA, srotolando temporaneamente regioni di pareti di basi ed esponendo sequenze altrimenti inaccessibili. Tuttavia, tali rimodellazioni possono anche portare a eventi di ricottura non produttivi o abortivi. Queste interazioni transitorie possono talvolta essere stabilizzate da forti motivi di legame Hfq situati vicino al sito di^{accoppiamento 17}. Nonostante questa flessibilità, non tutti gli incontri sRNA-mRNA portano a una formazione duplex stabile, e i fattori che determinano l'efficienza del ricottatura restano poco compresi. In particolare, rimane poco chiaro come i determinanti singoli di sequenza contribuiscano quantitativamente alla durata del legame e alla stabilità complessa.

Qui, abbiamo stabilito un sistema minimo a singola molecola ricostituita che consente la manipolazione graduale dei determinanti di sequenza e la misurazione diretta della cinetica di ricottura usando smFRET. In questo sistema, abbiamo progettato coppie di RNA con ricottura inizialmente inefficiente e modificato sistematicamente caratteristiche chiave, tra cui la resistenza del seme, la resistenza del motivo di legame Hfq e la distanza tra questi siti, per analizzare come i singoli parametri influenzino la stabilità duplex. Isolando le caratteristiche di sequenza definite in un sistema controllato in vitro , questo approccio consente la dissezione meccanicistica delle regole di targeting degli sRNA difficili da districare in vivo a causa della complessità della rete e degli effetti regolatori indiretti.

Protocol

Questo protocollo descrive il test FRET a singola molecola per monitorare l'annealing sRNA-mRNA. Include procedure per la progettazione, sintesi, passivazione e funzionalizzazione di vetrine modelli, imaging a singola molecola e analisi quantitativa dei dati.

Preparazione degli RNA
Progetta le sequenze di sRNA e mRNA in silico. Ogni sRNA dovrebbe terminare con un terminator di trascrizione e contenere un motivo di legame Hfq ricco di U, oltre a una sequenza seme complementare all'mRNA bersaglio. L'mRNA corrispondente dovrebbe includere ripetizioni AAN che fungono da motivo di legame Hfq e una sequenza complementare alla regione seme di sRNA. Le sequenze al di fuori del binding Hfq sono randomizzate evitando motivi AAN e tratti ricchi di U per evitare interazioni Hfq non intenzionali. Aggiungere una sequenza complementare al cavo all'estremità 3' dell'mRNA per consentire l'immobilizzazione sulla superficie durante l'imaging. Prevedere strutture secondarie RNA escludendo la sequenza complementare del cavo utilizzando RNAstructure tramite il server web o^{localmente 18}. Per un'analisi web-basata, carica le sequenze FASTA sul Web Server RNAstructure (https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb) e seleziona Predire una Struttura Secondaria. Usa parametri predefiniti (temperatura 37 °C, senza vincoli di folding). Dopo il calcolo, ispezionare il diagramma strutturale e la probabilità di folding. Le regioni sono state classificate come occluse se i nucleotidi all'interno del motivo di legame seme o Hfq avevano probabilità di accoppiamento di basi previste >60%. Le sequenze che superavano questa soglia furono ridisegnate.

Prepara modelli di DNA per la trascrizione in vitro estendendo oligonucleotidi sovrapposti usando DNA polimerasi, seguendo il protocollo del produttore. La concentrazione dell'innesco era di 3 μM ciascuno. Il programma termociclatore fu utilizzato come raccomandato dal produttore, tranne che il numero di cicli di amplificazione fu ridotto a 8, sufficiente a estendere gli innessi.

Trascrivere l'RNA a 37 °C per 3 ore fino a una notte usando la polimerasi di RNA T7 in tampone di trascrizione 1× (80 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM spermidina, 10 mM NaCl), integrato con 1 mM ciascuno NTP, 40 mM DTT e 30 mM_{MgCl 2}. Fermare la reazione aggiungendo EDTA a una concentrazione finale di 30 mM. Per la precipitazione dell'RNA, aggiungere 1/10 di volume di 3 M NaOAc (pH 5,4), seguito da 2,5-3 volumi di ≥99% etanolo. Mescola bene e incuba a -80 °C per 1 ora. RNA del pellet per centrifugazione a ≥20.000 × g per 35 minuti a 4 °C. Rimuovere il sovrandante, lavare il pellet con etanolo al 70% e asciugare brevemente all'aria. Sciogliere il pellet di RNA in 20 μL di 8 M urea e riscaldare a 90 °C per 2 minuti. Purificare l'RNA su gel di poliacrilammide all'8% contenenti 8 M urea. Eliminare le bande di interesse ed eluire l'RNA durante la notte nel tampone di eluzione (0,3 M di acetato di sodio, pH 5,4, 1 mM EDTA). Recuperare l'RNA tramite precipitazione da etanolo (segui le istruzioni per la precipitazione del DNA) e sciogliere la pellet in acqua priva di nucleasi.

Per preparare gli RNA alla marcatura fluorescente, eseguire la trascrizione in vitro come descritto, integrando la reazione con 32 mM di GMP per generare trascritti contenenti un monofosfato 5'. Trattare l'RNA con 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil], carbodiimide^{cloridrato 19} (EDC) e imidazolo per introdurre un gruppo amminato all'estremità 5'. Incubare l'sRNA in un tampone carbonato-bicarbonato (pH 8,5) con Alexa Fluor 555 o Cy3 NHS ester, seguendo le istruzioni del produttore. Purificare l'RNA modificato utilizzando colonne di spin cromatografia, precipitare con etanolo e sciogliere la pellet in acqua priva di nucleasi. Determinare l'efficienza dell'etichettatura spettrofotometricamente misurando l'assorbanza a 260 nm e al massimo di assorbimento specifico per colorante utilizzando uno spettrofotometro Nanodrop o equivalente. Calcola le concentrazioni di RNA e coloranti utilizzando la legge di Beer-Lambert e i corrispondenti coefficienti di estinzione forniti dal produttore dei fluorofori. L'efficienza di marcatura è definita come il rapporto molare tra colorante e RNA ed era abitualmente vicina al 100%. Gli RNA marcati possono essere conservati a -20 °C.

Ordina gli oligonucleotidi del DNA che trasportano una parte di 3′-biotina e un collegamento C6 5′-ammino. Precipitare il DNA utilizzando etanolo e acetato di sodio come descritto sopra. Etichetta il gruppo amminaccio con estere Cy5 NHS in tampone carbonato-bicarbonato (pH 8,5) secondo le istruzioni del produttore. Determinare la concentrazione di DNA marcato spettrofotometricamente come descritto sopra. I DNA marcati possono essere conservati a -20 °C.

Purificazione Hfq
Coltivare cellule Escherichia coli BL21 (DE3) Δhfq::cat-sacB che portano il plasmide di espressione Hfq pET21b-EcHfq, in cui il gene hfq di E. coli è espresso da un promotore indotto da IPTG. Hfq è espresso senza un tag di affinità; la proteina nativa contiene residui di istidina esposti superficialmente sufficienti per consentire la purificazione tramite cromatografia di affinità Ni²⁺ . Coltivare cellule in 1 L di mezzo LB-Miller integrato con 100 μg/mL di ampicillina a 37 °C fino a un OD₆₀₀ di 0,6. Indurre l'espressione di Hfq aggiungendo IPTG a una concentrazione finale di 1 mM e incubare per 4 ore a 37 °C. Prelevare le celle tramite centrifugazione a 5.000 × g per 10 minuti, poi risospendere il pellet in 50 mL di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NH₄Cl, 250 mM_{MgCl 2}, 1 mM 2-mercaptoetanolo, attenzione: il 2-mercaptoetanolo è tossico, maneggiare in una cappa fumi). Lisare le celle tramite sonicación su ghiaccio utilizzando un impostazione a impulsi del 50% del ciclo di lavoro. Applica tre impulsi da 40-s con intervalli di raffreddamento di 1 minuto sul ghiaccio tra un impulso e l'altro. Centrifugare il lisato a 27.000 × g per 20 minuti a 4 °C. Riscaldare il soprantantante a 85 °C per 45 minuti, poi centrifugare di nuovo nelle stesse condizioni. Trattare il soprantantante risultante con RNasi A (30 μg/mL) e DNase I (5 U/mL) per 1 ora a temperatura ambiente con lieve scuotimento scosso, seguito da una filtrazione attraverso un filtro da 0,45 μm. Applicare il lisato chiarificato a una colonna di cromatografia di affinità precaricata con_{NiSO 4}. Lavare la colonna con il tampone (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NH₄Cl, 0,5 mM 2-mercaptoetanolo). Eludi la proteina usando lo stesso tampone con una concentrazione di gradiente lineare di imidazolo da 10 mM a 1 M. Raccogli le frazioni contenenti Hfq e caricale su una colonna di cromatografia HiLoad 16/600 Superdex 200 per esclusione di dimensione bilanciata con buffer HB (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 250 mM NH₄Cl, 1 mM EDTA, 10% glicerolo). Fai funzionare la colonna secondo le istruzioni del produttore. Un'analisi rappresentativa SDS-PAGE della purificazione di Hfq è mostrata nella Figura Supplementare 1. Concentrare la proteina purificata, se necessario, utilizzando filtri centrifughi (MWCO da 3 kDa). Le aliquote purificate di Hfq possono essere conservate a -80 °C.

Esperimenti con singola molecola
Passivazione delle vetri di quarzo²⁰
Prepara i vetri in quarzo con cinque fori paralleli (0,8 mm di diametro) praticati vicino a ciascun bordo lungo. Inserire vetrini e coperchie in quarzo in un barattolo per colorazione Hellendahl (portavetri) e sonicare l'acetone per 20 minuti (attenzione: l'acetone è infiammabile e volatile; lavora in una cappa a vapore). Ripeti il passaggio di pulizia usando metanolo (Attenzione: il metanolo è tossico e infiammabile; manico in una cappa fumi). Risciacqua accuratamente i vetri con acqua e fai il sonic in 1 M KOH per 1 ora (Attenzione: il KOH è caustico, indossa guanti e protezione per gli occhi). Risciacqua le vetrine con acqua, poi sonica in sequenza con acetone e metanolo per 20 minuti ciascuno. Ripeti la pulizia del KOH usando 5 M KOH per 1 ora, seguita da un accurato risciacquo con acqua (Attenzione: maneggiare il KOH concentrato con l'attrezzatura protettiva appropriata). Asciuga all'aria i diapositive. Prepara un set pulito di barattoli per le macchie Hellendahl e risciacquali con esano (Attenzione: l'esano è altamente infiammabile; maneggiare in una cappa a fumo), poi lasciali asciugare all'aria. Metti i vetri nel portavetri e risciacqua due volte con esano. Aggiungere 75 mL di esano al portavetrino e iniettare con cura 50 μL di diclorodimetilsilano (DMDCS) sotto la superficie dell'esano (NOTA: evitare di esporre il DMDCS all'aria). Incuba i slide con un dondolio leggero per 1,5 ore. Risciacqua e sonica i vetri in esano per 1 minuto e ripeti questo passaggio tre volte per rimuovere il DMDC residuo. Asciugare all'aria i vetrini e sigillarli sottovuoto in tubi da 50 mL (ad esempio, Falcon o tubi conici). Le vetrine preparate possono essere conservate a −20 °C fino a un ulteriore utilizzo.

Assemblaggio e funzionalizzazione dei canali di flusso
Un semplice canale di flusso può essere assemblato utilizzando un vetrino al quarzo, un copertino in vetro, nastro a doppia faccia, punte di pipetta ed epossidica. Applica sottili strisce di nastro a doppia faccia tra i fori del carrello al quarzo e posiziona il copertino sopra. Sigilla i bordi più lunghi con resina epossidica. Taglia circa 5 mm segmenti da una punta di pipetta (sia la punta stretta che quella più larga) e inserisci uno in un foro per servire da uscita e l'altro in un foro parallelo per formare un serbatoio di ingresso. Fissa entrambi con resina epossidica. Il serbatoio di ingresso dovrebbe trattenere liquido senza perdite prima dell'iniezione. Per prelevare soluzioni attraverso il canale, collega il tubo da una siringa da 1 mL all'uscita.

Pretratta i canali in sequenza con i seguenti reagenti per funzionalizzare la superficie: BSA biotinilata (0,2 mg/mL) per 5 minuti, Tween-20 (0,2%) per 10 minuti e NeutrAvidin (0,1 mg/mL) per 1 minuto. Circa 100 μL di ciascuna soluzione sono sufficienti per canale. Evitare di aspirare più liquido di quello presente nel serbatoio di ingresso, poiché questo introdurrebbe aria nel canale e genererà bolle. Lascia un piccolo volume di soluzione nel serbatoio tra un passaggio e l'altro per evitare che il canale si secchi. Risciacquare accuratamente con 1× tampone TNK (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl) tra ogni passaggio. Questo trattamento stabilisce una superficie biotina-NeutrAvidin per l'immobilizzazione dell'RNA.

Preparare i duplex mRNA-tether immediatamente prima dell'immobilizzazione, mescolando mRNA da 40 nM con un DNA tether marcato con Cy5 biotinilato da 20 nM. Denatura la miscela a 75 °C per 5 minuti in 1× tampone TNK (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl), poi riaffidare a 37 °C per 15 minuti e bilanciare a 20 °C.

Diluire il campione 50 volte in un tampone di imaging (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl, 4 mM 6-idrossi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-acido carbossilico, 0,01% ottaetilenico glicole monododecilico, 0,8% glucosio, inibitore RNasi 2 U/mL) e iniettarlo nel canale di flusso per immobilizzare gli mRNA. Incubare per 1 minuto, poi lavare con un tampone d'imaging integrato da un sistema di recupero di ossigeno (165 U/mL glucosio ossidasi e 2170 U/mL catalasi) per ridurre il fotosbiancamento.

Preparare i complessi sRNA-Hfq mescolando i componenti in un rapporto 1:1 fino a una concentrazione finale di 250 nM in un tampone 1× TNK e incubare per 5-15 minuti a temperatura ambiente. Diluire i complessi 50 volte nel buffer di imaging contenente il sistema di recupero dell'ossigeno e iniettarli nel canale di flusso immediatamente prima dell'imaging .

Acquisizione di dati a singola molecola
Installare il microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) basato su prisma accendendo la telecamera EMCCD e i laser. Montare il vetrino preparato con canali di flusso assemblati sul palco del microscopio e posizionare il prisma sopra. Usa un singolo software (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab) per acquisire dati. Nel software, determina il livello di background selezionando AutoScale e copia il valore ottenuto nel campo Background. Imposta il frame rate di acquisizione a 100 ms. Excite Alexa Fluor 555 o Cy3 usando un laser da 532 nm e Cy5 con un laser da 633 nm. Raccogliere simultaneamente le emissioni da entrambi i canali attraverso un obiettivo di immersione in acqua del 60×. Per ogni film, si inizia con dieci fotogrammi di eccitazione a 633 nm per localizzare gli mRNA marcati con Cy5 nel campo visivo. Continua a registrare per 5 minuti con eccitazione a 532 nm. Concludi l'acquisizione con 1 s di eccitazione a 633 nm per verificare il fotosbiancamento Cy5. Questo produce il file filmato .pma, che può essere utilizzato per l'analisi.

Analisi dei dati a singola molecola
Analizzare file .pma grezzi utilizzando script IDL personalizzati per eseguire la mappatura dei canali donatore-accettore ed estrarre traiettorie di intensità di fluorescenza. Per prima cosa, registrare un film di calibrazione utilizzando sfere fluorescenti multicolori rilevabili sia nei canali donatori che in quelli accettanti durante l'eccitazione con il laser da 532 nm o da 633 nm. Usa questo filmato di calibrazione per generare un file di mappatura che allinea i canali donatore e accettore. Applicare il file di mappatura risultante a tutte le registrazioni sperimentali per identificare le coppie donatore-accettore corrispondenti, rilevare macchie fluorescenti ed esportare tracce di tempo di intensità per l'analisi FRET a valle. Istruzioni dettagliate passo dopo passo sono fornite insieme allo script (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab).

Tracce di intensità di processo in MATLAB usando lo script s_tr_E.m. Avvia lo script e inserisci la directory contenente i file .traces e .pks, seguita dall'indice dei file e dalla risoluzione temporale. Seleziona la finestra del telaio utilizzata per l'identificazione dei punti quando richiesto. Lo script mostra quindi le intensità del donatore e dell'accettore per ogni singolo punto. Naviga tra le molecole usando comandi da tastiera (b per tornare indietro, g per saltare a una molecola specifica). Definisci le linee di base del donatore e dell'accettatore (k) e correggi la perdita (l) cliccando sui grafici quando necessario. Salva le tracce accettate singolarmente come file .dat contenenti intensità di tempo, donatore e accettatore premendo s. Usa i file esportati per l'analisi quantitativa a valle.

Utilizzare il programma peak-finder per analizzare le singole tracce smFRET ed estrarre eventi di legame per la quantificazione, inclusa l'analisi del tempo di permanenza e le distribuzioni degli stati dei FRET. Avvia il programma e apri la cartella contenente i file di traccia .dat esportati usando il menu File. Imposta i valori di base e i valori di fuga da donatore a accettore determinati in precedenza utilizzando lo script MATLAB. Successivamente, imposta le soglie di intensità per guidare il rilevamento automatico dei picchi in modo che tutti gli eventi di legame verificati visivamente si trovino sopra i valori selezionati. Se il rumore fa suddividere un singolo evento in più picchi, uniscili manualmente usando la funzione di fusione integrata. Clicca Salva picchi per esportare gli eventi rilevati come file .csv contenenti l'ora di inizio, l'orario di fine e l'efficienza media dei FRET per ogni evento. I file di output sono salvati nella directory peaks, mentre i valori FRET risolti nel frame per ogni evento vengono scritti nella directory peak-fret. L'efficienza dei FRET viene calcolata dividendo l'intensità della fluorescenza dell'accettore per la somma delle intensità di donatore e accettore, utilizzando valori corretti per la perdita di fondo e del donatore nel canale accettore. Ispezionare manualmente le tracce per la fotosbiancamento Cy5, identificate da una brusca diminuzione dell'efficienza FRET accompagnata da un aumento dell'intensità Cy3. Quando avviene il fotosbiancamento, si assume che il legame persista finché la fluorescenza Cy3 rimane rilevabile e correggi le durate dei picchi modificando i corrispondenti file .csv.

Importare valori di efficienza FRET risolti nel frame dai file peak-fret in GraphPad Prism. Generare istogrammi FRET utilizzando la funzione di distribuzione di frequenza e adattare le distribuzioni con modelli gaussiani per identificare la popolazione dominante di FRET.

Determina i tempi di permanenza per gli eventi di legame individuali sottraendo l'associazione dai punti di tempo di dissociazione usando un foglio di calcolo. Calcola la frazione di eventi transitori (<10 s) per ogni ripetizione sperimentale. Analisi statistiche sono state effettuate in GraphPad Prism. I confronti tra due condizioni sono stati valutati utilizzando test t non accoppiati, e confronti tra tre o più condizioni sono stati analizzati utilizzando ANOVA unidirezionale con il test post-hoc di Tukey.

Results

La lunghezza del seme determina il regime dinamico dell'accoppiamento sRNA-mRNA
Abbiamo stabilito un saggio a molecola minima singola per testare come le caratteristiche di sequenza governino l'annealing mediato da Hfq. Gli RNA modello sono stati progettati seguendo le architetture precedentemente descritte delle coppie ^sRNA-mRNA dipendenti da^{Hfq 16,17} e portavano un motivo di legame Hfq ricco di adenosina sull'mRNA e un sito di legame al bordo ricco di uridina sullo sRNA (Figura 1A). L'sRNA è stato marcato con Alexa Fluor 555 (donatore) all'estremità 5ʹ e il collegamento mRNA-DNA con Cy5 (accettore), permettendo la rilevazione della prossimità indotta dall'accoppiamento di basi tramite FRET.

Variando la complementarità del seme da 4, 5, 8 a 10 punti base si producevano comportamenti dinamici distinti. Con un seed a 4 punti, le interazioni sono state prevalentemente transitorie e hanno mostrato efficienze eterogenee dei FRET, suggerendo un accoppiamento di basi incompleto (Figura 1B-D). Al contrario, semi a 8 e 10 punti base hanno prodotto duplex stabili che spesso persistevano durante la finestra di osservazione (Figura 1C). Le interazioni hanno prodotto lo stato atteso di freti elevati (_FRET E ^≈ 0,79-0,80, Figura 1D), coerente con l'accoppiamento completo di basi tra RNA. Un seme a 5 punti base ha prodotto eventi di legame di breve durata ma ben definiti (_{E FRET} ^≈ 0,66), fornendo un intervallo dinamico praticabile per modifiche successive nella sequenza RNA (Figura 1B-D). Abbiamo quindi utilizzato la complementarità a 5 punti base per tutti i test a valle.

Motivi di legame Hfq più forti aumentano la stabilità del complesso sRNA-mRNA
Successivamente abbiamo chiesto come la resistenza del legame Hfq moduli la durata del legame a una complementarità fissa di 5 bp. L'estensione del motivo mRNA da AAN4 ad AAN6 ha aumentato significativamente la probabilità di formare complessi stabili (p < 0,001). La durata media della vita è passata da 7,5 s a 18 s, e la frazione di eventi instabili < 10 s è diminuita da 80 ± 2% a 68,3 ± 2,9% (Figura 2A-C).

Abbiamo quindi testato l'effetto del motivo di legame Hfq sullo sRNA. Accorciare il sito di legame del bordo da UUAUUUUUUU a CUUC (sRNA-SR, "bordo corto") ha prodotto interazioni altamente instabili (vita media 1,9 s con AAN4), e rafforzare il motivo dell'mRNA in quel contesto ha avuto solo un effetto modesto (media 3,0 s con AAN6, non significativa, Figura 2B,C). Così, entrambi i partner contribuiscono alla stabilità del complesso prodotto, ma i contatti sRNA-Hfq deboli limitano i guadagni derivanti da un motivo mRNA più forte.

Uno spaziore tra siti Hfq e siti seme sull'mRNA favorisce complessi a vita più lunga
Hfq può rimanere legato alla regione AAN utilizzando la superficie del bordo per facilitare la ricerca del sito di accoppiamento ottimale di^{sRNA 16}. Questa proprietà suggeriva che una distanza aggiuntiva tra le due regioni di legame sull'mRNA potesse influenzare la stabilità dell'interazione.

Per testare ciò, abbiamo introdotto uno spaziatore a singolo filamento di 15 nt tra i siti di legame Hfq e sRNA (N15). Questa modifica aumentò significativamente la durata degli eventi di ricottura stabile da 7,5 s (AAN4) a 47 s (AAN4-N15) (p < 0,01) (Figura 3A,B). La percentuale di eventi di legame che durano meno di 10 s è diminuita dall'80 ± 2% a 44 ± 6% (Figura 3C). Questi dati indicano che una maggiore flessibilità tra i moduli di legame può stabilizzare gli intermedi di ricottura e favorire duplex a durata più lunga.

DISPONIBILITÀ DEI DATI:
Tutti i dati a supporto dei risultati di questo studio, inclusi le traiettorie FRET a singola molecola, i dataset processati e gli script di analisi, sono disponibili pubblicamente nel database Mendeley Data all'indirizzo: doi:10.17632/3z8fng2c8g.1

Figura 1: Effetto della complementarità sRNA-mRNA sull'efficienza del legame. (A) saggio smFRET per l'annealing sRNA-mRNA. L'accoppiamento di basi tra lo sRNA marcato con Alexa Fluor 555 e il complesso mRNA-Cy5-DNA immobilizzato produce un segnale FRET elevato. Gli mRNA modello contengono un sito di legame Hfq (AAC₎₄ (blu) e un sito di legame sRNA (S5, rosso), seguiti da cinque nucleotidi e dalla regione ibrida RNA-DNA. Gli sRNA includono un sito di legame al bordo (arancione). I pannelli in (B-D) sono raggruppati per condizione sperimentale (lunghezza del seme). (B) Evento rappresentativo di legame dell'sRNA su una singola molecola di mRNA. Sono mostrate tracce di intensità di fluorescenza di sRNA marcato con Alexa Fluor 555 (donatore, verde) e del tethering Cy5-DNA (accettore, rosso). Cy5 è stato immediatamente entusiasmato durante il primo e l'ultimo dieci fotogrammi della registrazione. (C) Rastergrammi che raffigurano 50 molecole rappresentative di mRNA legate da sRNA-Hfq. Ogni barra orizzontale rappresenta una singola interazione sRNA-mRNA. (D) Istogrammi delle efficienze FRET per interazioni tra mRNA e sRNA contenenti 4 bp (N = 416 mRNA), 5 bp (N = 513 mRNA), 8 bp (N = 191 mRNA) o 10 bp (N = 105 mRNA) regioni complementari. Le efficienze FRET sono state calcolate a partire dalle intensità di donatore e accettatore corrette in base e per perdita per eventi di legame individuali a intervalli di 0,1 s. Gli adattamenti gaussiani (blu) indicano la popolazione dominante di FRET e non sono stati utilizzati per calcolare i valori E_FRET. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Effetto della lunghezza del motivo di legame Hfq sulle interazioni sRNA-mRNA. La regione di accoppiamento di basi in tutte le varianti è lunga 5 punti base. (A) Rastergrammi che mostrano 50 mRNA rappresentativi legati da complessi sRNA-Hfq. Ogni barra orizzontale rappresenta una singola interazione. I diagrammi a cartone animato sopra illustrano i corrispondenti disegni di RNA con variazioni nel numero di ripetizioni (AAC) nell'mRNA e nella lunghezza della regione di legame del bordo nell'sRNA (SR = "bordo corto"). Colorazione come nella Figura 1A. (B) Diagrammi di scatter della durata del legame sRNA-mRNA. Ogni punto rappresenta un singolo evento di vincolatura. Durate medie (linea orizzontale rossa): 7,5 s per mRNA-AAN4 + sRNA (N = 188 mRNA), 18 s per mRNA-AAN6 + sRNA (N = 142 mRNA), 1,9 s per mRNA-AAN4 + sRNA-SR (N = 85 mRNA) e 3 s per mRNA-AAN6 + sRNA-SR (N = 149 mRNA). (C) Grafico a barre che mostra la percentuale di eventi di legame inferiori a 10 s. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard da due dataset indipendenti. Analisi statistica tramite ANOVA unidirezionale con il test post-hoc di Tukey per confronti multipli. p < 0,001, ****p < 0,0001; NS, non significativi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Effetto della lunghezza dello spaziore tra siti di legame Hfq e sRNA sulle interazioni sRNA-mRNA. La regione di accoppiamento di basi in tutte le varianti è lunga 5 punti base. (A) Rastergrammi che raffigurano 50 mRNA rappresentativi legati dal complesso sRNA-Hfq. Ogni barra orizzontale rappresenta un singolo evento di legacolo. I diagrammi a cartone animato sopra illustrano il corrispondente disegno dell'RNA. N15 = 15 nt distanziatore di sequenza casuale. Colorazione come nella Figura 1A. (B) Diagrammi di scatter della durata del legame sRNA-mRNA. Ogni punto rappresenta un singolo evento di vincolatura. Durate medie (linea orizzontale rossa): 7,5 s per mRNA-AAN4 + sRNA (N = 188 mRNA) e 47 s per mRNA-AAN4-N15 + sRNA (N = 289 mRNA). (C) Grafico a barre che mostra la percentuale di eventi di legame inferiori a 10 s. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard da due dataset indipendenti. Analisi statistica tramite t-test non accoppiato. **p < 0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Purificazione di E. coli Hfq. Analisi SDS-PAGE dell'espressione e purificazione di Hfq. (Alto) Campioni raccolti durante la purificazione su una colonna di affinità Ni²⁺ (HiTrap), inclusi prima dell'induzione, dopo l'induzione, pellet, lisato, carico, flow-through, frazioni di lavaggio e frazioni di picco eluzionate. (In fondo) SDS-PAGE delle frazioni di picco dopo cromatografia a esclusione di dimensioni su una colonna HiLoad 16/600 Superdex 200. Sono indicate forme monomeriche (~11 kDa) ed esameriche (~66 kDa) di Hfq. Clicca qui per scaricare questo File.

Discussion

Questo studio stabilisce un saggio a molecola minima singola per analizzare come specifiche caratteristiche della sequenza di RNA determinino l'efficienza dell'annealing sRNA-mRNA mediato da Hfq. Variando la lunghezza del seme, la forza del motivo di legame Hfq e la distanza tra i moduli di legame, abbiamo quantificato direttamente come ogni parametro contribuisce alla stabilità duplex a risoluzione singola di molecola. A differenza delle misurazioni di ensemble, che riportano effetti medi della popolazione, questo approccio risolve direttamente gli eventi di legame e dissociazione individuali, consentendo la misurazione dell'eterogeneità cinetica e delle interazioni transitorie. I nostri risultati mostrano che anche le regioni dei semi brevi possono impegnarsi temporaneamente, mentre i semi più lunghi producono duplex stabili con durate prolungate. Questi risultati sono coerenti con dati precedenti in vivo e in ensemble che dimostrano che le regioni naturali dei semi negli sRNA batterici tipicamente comprendono da 6 a 12 nucleotidi e raramente formano duplex completamente^{complementari 21,22,23}.

Abbiamo inoltre riscontrato che sia i motivi di legame Hfq dell'mRNA che quelli dell'sRNA influenzano fortemente la stabilità duplex. Estendere il motivo AAN sull'mRNA aumentava la durata del legame, mentre accorciare il sito di legame del bordo dell'sRNA li destabilizzava notevolmente. Questo supporta un modello cooperativo in cui il volto distale di Hfq ancorano motivi di mRNA ricchi di adenosina, e il bordo recluta sRNA ricchi di uridina per promuovere un allineamento efficiente delle regioni^{complementari 9,17}. A differenza degli saggi genetici o basati su reporter, che tipicamente rilevano solo risultati regolatori produttivi, questo sistema separa quantitativamente la stabilità del legame dagli effetti a valle, permettendo il confronto diretto di come le singole caratteristiche della sequenza modulano la durata delle interazioni fisiche. Un forte motivo di legaggio al bordo è particolarmente importante quando sono necessari riarrangiamenti strutturali per l'accoppiamento sRNA-mRNA, poiché migliora la ritenzione dell'RNA su Hfq¹⁷. Si ritiene inoltre che il bordo promuova la scansione laterale degli mRNA da parte dei complessi^{sRNA-Hfq 16}, una proprietà che può essere particolarmente importante quando i siti bersaglio sono lontani dalla regione di legame Hfq. I nostri risultati con uno spaziatore di 15-nt tra i siti di legame supportano questa visione, mostrando che una flessibilità aggiuntiva tra il motivo seme e Hfq aumenta la stabilità dell'accoppiamento, probabilmente riducendo i vincoli sterici durante lo scambio dei fili.

Oltre ai sistemi naturali, i risultati sono rilevanti per la progettazione di sRNA sintetici o ingegnerizzati. La maggior parte delle strategie di progettazione esistenti si concentra sull'ottimizzazione di una regione seed o di un impalcatura generale 23,24,25, ma i nostri dati evidenziano ulteriori determinanti come la distanza tra il motivo di legame Hfq e la regione target. Poiché le caratteristiche della sequenza vengono introdotte in modo controllato e modulare, il saggio fornisce un quadro sperimentale sistematico per testare le regole di progettazione. Questo principio potrebbe guidare la futura costruzione di sRNA artificiali con una maggiore efficienza regolatoria.

Sebbene l'approccio consenta un'analisi quantitativa e riproducibile delle interazioni RNA-RNA, presenta anche delle limitazioni. Il saggio indaga le regioni completamente complementari, mentre la maggior parte delle interazioni fisiologiche sRNA-mRNA contiene disadattamenti e rigonfiamenti che possono influire sul riconoscimento e la regolazione. Il metodo misura la durata del legame sRNA-mRNA ma non affronta direttamente gli esiti regolatori a valle, come l'inibizione della traduzione o il decadimento dell'mRNA. Futuri adattamenti di questo saggio potrebbero includere regioni dei semi non corrispondenti, vari contenuti di GC, o ribosomi e degradosomi per indagare sistematicamente come questi fattori modellano la cinetica di legame.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,45 μ Filtro M	Millipore	HABG04700
Colonna Hi-Trap da 5 mL	Cytiva	GE17-0408-01
Acetone	Merck	270725	Grado HPLC
Soluzione di acrilammide:bis-acrilammide	Merck	A2792-100ML
ALEXA555 estere succinimidile NHS	Thermo Fischer	A20009
Filtri centrifughi Amicon Ultra (NMWL, 3 kDa)	Merck	UFC900308
Cloruro di ammonio	Merck	1330-500G
Ampicilina	Merck	A9518-5G
ATP	Linegal Chemicals	K054.1
Beta-mercaptoetanolo	Merck	M3148-500ML
BIO-BSA	Merck	A8549-10MG
Colonne Bio-Spin con Bio-Gel P-30	Bio Rad	7326231	Per purificare l'RNA marcato
Catalasi	Merck	C9322
CTP	Linegal Chemicals	K057.4
Estere HNS Cy3	Cytiva	PA13105
Estere succinimidile del NHS Cy5	Cytiva	PA15101
DDT	Thermo Fischer	R0861
Diclorodimetilsilano	Merck	440272
Oligomeri del DNA (tether): un 5′-ammino-linker C6	Termoscientifica	n/a
Dnase I	Thermo Scientific	18047019
EDC	Termoscientifica	PG82079
EDTA	Merck	ED2SS-1KG
Camera EMCCD	Andor
Etanolo	Merck	1085430250
Glucosio	Merck	D9434-1KG
Glucosio ossidasi	Merck	G2133-50KU
Glicerolo	Merck	G5516-1L
GMP	Merck	G8377
GTP	Linegal Chemicals	K056.4
Hcl	Merck	1.00318
Esano	Thermo Fischer	045652.M1
Colonna di esclusione della dimensione HiLoad 16/60 Superdex 200	Cytiva	GE28-9893-35
IPTG	Merck	420322-1GM
KCl	Merck	P9541-1KG
KOH	Merck	484016-1KG
Cloruro di magense	Merck	M8266-1KG
Metanolo	Merck	34885-M	Grado HPLC
Neutravidina	Thermo Fischer	31000
Solfato di nichel	Merck	1067261000
Nikkol	Merck	P8925-1G
Q5 Polimerasi	NEB	M0491S	Utilizzato per la produzione di template di trascrizione in vitro
RNase A	Termoscientifica	EN0531
RNasin Plus	Promega	N2611
Acetato di sodio	Merck	S7545-100G
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S3014-1KG
Spermidina	Merck Life Science	S2626
Tris Base	Thermo Scientific	17926
Trolox	Merck	238813-1G
Urea	Merck	U1250-5KG
UTP	Linegal Chemicals	K055.3