Un flusso di lavoro per immagini dal vivo e analisi quantitativa delle reti microtubulari acentrosomali negli ovociti di Drosophila

Summary

Qui presentiamo un protocollo che combina l'imaging dal vivo con strumenti di analisi automatizzato per analizzare la dinamica dei microtubuli nell'ovocita di Drosophila . Questo flusso di lavoro consente una misurazione efficiente e riproducibile del comportamento dei microtubuli, inclusi crescita, orientamento, velocità e organizzazione spaziale, e può essere adattato ad altri tipi cellulari una volta ottimizzato.

Abstract

Il citoscheletro del microtubulo (MT) è essenziale per molte funzioni cellulari, tra cui la forma cellulare, la polarità, la migrazione e la divisione. Mentre i centrosomi funzionano come principale centro organizzatore MT (MTOC) nelle cellule animali in divisione, molte cellule differenziate, inclusi gli ovociti di Drosophila , si affidano a vie acentrosomali per assemblare reti MT. A differenza dell'ampia conoscenza dell'organizzazione della MT nelle cellule proliferanti, si sa poco su come le reti MT si assemblano senza centrosomi. Gli ovociti di Drosophila forniscono un modello potente per studiare l'organizzazione e la dinamica della MT acentrosomale. Tuttavia, la loro densa rete MT sfida l'imaging convenzionale. L'imaging in tempo reale consente la visualizzazione in tempo reale della crescita e dell'orientamento della MT, tuttavia i metodi di analisi standardizzati rimangono limitati. Qui presentiamo un protocollo basato su immagini dal vivo per analizzare la dinamica di crescita della MT negli ovociti di Drosophila utilizzando la Proteina End-Binding 1 (EB1)-Proteina Fluorescente Verde (GFP), una proteina di tracciamento plus-end che marca i siti di polimerizzazione attiva della MT. La microscopia confocale Airyscan ad alta risoluzione consente la rilevazione delle comete EB1, mentre macro personalizzate Fiji e script Python forniscono una quantificazione snellita e riproducibile della densità, velocità, lunghezza e orientamento delle comete. Abbiamo validato questo metodo confrontando gli ovociti di controllo con quelli sottoposti a una depolimerizzazione MT indotta dal freddo, così come con i mutanti Patronin (CAMSAP negli esseri umani), uno stabilizzatore conservato della MT a estremità inferiore e un componente centrale dei centri organizzatori microtubulari non centrosomali (ncMTOC), come controllo positivo per la dinamica MT compromessa. Le nostre analisi hanno rivelato dinamiche MT specifiche per regione, inclusi l'arricchimento anteriore delle comete EB1 e i bias di orientamento caratteristico, e hanno confermato la sensibilità del flusso di lavoro nel rilevare sottili perturbazioni nella crescita della MT. Questo approccio fornisce un quadro affidabile e facile da usare per studiare il comportamento della MT negli ovociti. Il protocollo passo dopo passo consente l'indagine dei regolatori MT in questo contesto e può essere adattabile ad altri tipi cellulari differenziati, come neuroni ed epiteliali, con l'adeguata ottimizzazione. Più in generale, supporta studi meccanicistici e screening genetici che esaminano come diverse architetture MT siano alla base di funzioni cellulari specializzate.

Introduction

Il citoscheletro del microtubulo (MT) è un componente essenziale della cellula eucariota, svolgendo ruoli essenziali nell'identificazione e nel mantenimento della forma, polarità e divisione cellulare. Il comportamento dinamico dei polimeri MT, caratterizzato da crescita e ritiro, è cruciale per molti processi basati su MT ^1,2. L'assemblaggio dei diversi array di MT si basa sull'azione combinata dei centri organizzatori di microtubuli (MTOC), da cui vengono nucleate le MT, e sull'attività di diverse proteine regolatorie MT che controllano la stabilità, l'orientamento e la dinamica della MT ^1,2,3. L'MTOC meglio studiato è il centrosoma, che genera array radiali di MT importanti per regolare la forma e la polarità cellulare in interfase e per l'assemblaggio del fuso mitotico nella^{mitosi 4,5}. Tuttavia, all'uscita o differenziazione mitotica, come nei neuroni e nelle cellule epiteliali, l'attività centrosomale del MTOC è spesso attenuata e, nei casi estremi, come negli ovociti, può essere^{eliminata 6,7}. Questo è spesso associato al rimodellamento specifico per tipo cellulare del citoscheletro MT, con l'assegnazione della funzione MTOC ad altri siti^{cellulari 2,3,8}, solitamente chiamati MTOC non centrosomali (ncMTOCs). Sebbene siano stati fatti progressi sostanziali nell'elucidare l'organizzazione delle MT nelle cellule mitotiche, si sa relativamente poco su come le MT vengano nucleate, stabilizzate e spazialmente disposte nelle cellule animali che escono dalla mitosi o sono sottoposte a^{differenziazione 2}. In particolare, negli organismi viventi, la maggior parte delle cellule non si divide; Sono usciti dal ciclo cellulare e/o si sono differenziati. Pertanto, è fondamentale comprendere come il citoscheletro MT viene assemblato e regolato in questi contesti. Questa conoscenza è essenziale per scoprire come vengono stabilite architetture MT distinte per supportare funzioni cellulari specializzate.

L'ovocita di Drosophila melanogaster fornisce un potente sistema per studiare l'organizzazione e la funzione della MT acentrosomale. Nelle fasi medie dell'oogenesi, l'attività del centrosomico è^{attenuata 9}, e le MT sono generate da ncMTOC localizzate nella corteccia antero-laterale dell'ovocita (Figura 1B). Questa rete MT è essenziale per la localizzazione degli mRNA, proteine e organelli materni, che a loro volta sono fondamentali per l'istituzione dei futuri assi embrionali^{e lo sviluppo 10,11}. Lavori precedenti hanno dimostrato che gli ncMTOC dell'ovocita sono composti dalla proteina MT a estremità negativa Patronina, che forma un complesso con la proteina spectraplakina Shot, ancorata al citoscheletro corticalo di actina. È stato proposto che i MT crescano da brevi frammenti di MT generati da enzimi di taglio come la Katanina, che possono fungere da semi per una ulteriore polimerizzazione MT¹². Meccanismi simili sono stati proposti in altre cellule differenziate, come i^{neuroni 13}, dove l'attività centrosomale è ridotta. Tuttavia, i meccanismi con cui il taglio genera reti MT complesse, come nell'ovociti, restano poco compresi. Non è ancora chiaro se le MT in questi contesti si formino principalmente tramite riarrangiamento basato sulla sepolazione o una combinazione di separazione e nucleazione de novo della MT. La complessità della rete MT degli ovociti la rende un sistema ideale per studiare come i MT vengono generati e organizzati al di fuori del noto contesto centrosomale. In particolare, ciò rappresenta anche una sfida per l'imaging e l'analisi: la rete DT densa all'interno dell'ovocita rende difficile risolvere le MT individuali utilizzando approcci convenzionali di immunocolorazione o imaging^{statico 2,14}.

L'imaging live ha notevolmente migliorato la capacità di studiare le reti MT, poiché consente la visualizzazione degli eventi di polimerizzazione MT in tempo reale, offrendo intuizioni chiave sulla dinamica e l'orientamento della crescita MT. Studi precedenti hanno analizzato con successo la dinamica della crescita della MT negli ovociti utilizzando immagini in tempo reale dei marcatori a estremità^{positiva 14, 15, 16}. Tuttavia, in molti casi, le procedure di analisi delle immagini utilizzate per quantificare la dinamica della MT sono descritte solo brevemente, si basano su implementazioni personalizzate o specifiche per laboratorio, oppure non sono rese pubbliche, limitando così la riproducibilità e l'adozione più ampia. Il nostro metodo si basa su questi approcci precedenti fornendo una pipeline di analisi completamente documentata, apertamente disponibile e facile da usare che consente la quantificazione standardizzata dei parametri di crescita della MT tra dataset e condizioni sperimentali. In questo protocollo, la dinamica della MT viene immagiata a metà oogenesi, quando il citoscheletro della MT è organizzato dalle reti MT acentrosomali. I MT in crescita sono visualizzati utilizzando EB1-GFP, una proteina di tracciamento più estremo^{MT 17,18}, e vengono acquisiti tramite microscopia confocale a scansione laser con un rilevatore ad array in modalità ad alta velocità. La novità del nostro approccio risiede nella sua analisi delle immagini: una pipeline completamente documentata, user-friendly, passo dopo passo, che richiede agli utenti di selezionare solo le regioni di interesse. L'elaborazione e la quantificazione delle immagini sono facilitate da macro personalizzate di Fiji e script Python, che consentono una rilevazione efficiente e riproducibile delle comete EB1 e l'estrazione di parametri, tra cui orientamento di crescita, velocità e organizzazione spaziale. Questo quadro fornisce uno strumento standardizzato e accessibile per confrontare la dinamica della MT tra condizioni sperimentali.

In questo manoscritto, applichiamo questo metodo per confrontare la crescita della MT negli ovociti di controllo e negli ovociti depolimerizzati tramite trattamento a freddo. Questo serve sia a convalidare il protocollo sia a supportare studi futuri volti a analizzare il ruolo delle proteine candidate nella regolazione della MT.

Protocol

1. Genetica delle mosche

NOTA: Per visualizzare le MT nell'ovocito, questo protocollo utilizza un transgene pubblicamente disponibile (Table of Materials) che esprime la proteina di tracciamento plus-end MT EB1 contrassegnata con un tag GFP (Green Fluorescent Protein^{) 19}. EB1-GFP si lega specificamente alle MT in crescita più le estremità, apparendo come "comete" fluorescenti che si muovono lungo la direzione della^{polimerizzazione 17,18}. Questo permette la visualizzazione e la quantificazione della dinamica della crescita MT, inclusa orientazione di crescita, velocità e distribuzione spaziale all'interno^{dell'ovocita 14,20}.

1. Mantenere tutti i ceppi di mosche su un mezzo standard di farina di mais e agar a 25 °C utilizzando le tecniche standard di allevamento di Drosophila .
2. Incrociare 8–12 femmine vergini di mosca portanti un transgene UAS-RNAi che mira l'espressione di una proteina di interesse, con 5 maschi del genotipo matα4-Gal4-VP16; EB1-GFP.
   NOTA: Per semplificare gli incroci genetici, si genera un stock di mosche incrociando la linea V32-Gal4 (inserimento sul secondo cromosoma) con la linea EB1-GFP (inserimento sul terzo cromosoma). Poiché EB1-GFP è sotto il controllo di un promotore UASp, il driver V32-Gal4 induce l'espressione di EB1-GFP così come di qualsiasi transgene UAS-RNAi introdotto in incroci successivi se desiderato.
3. Dopo la schiusa della prole F1, si selezionano 10–15 femmine di genotipo desiderato (meno di una settimana).
4. Trasferire le femmine, insieme a 2–3 maschi, in una fiala fresca contenente una piccola quantità di pasta di lievito sulla superficie del cibo. La pasta di lievito stimola l'oogenesi e favorisce la progressione dello sviluppo della camera delle uova. La presenza dei maschi garantisce l'accoppiamento, che favorisce anche la maturazione degli ovociti e la deposizione delle uova. Mantieni le mosche a 25 °C per 2 giorni.
   NOTA: Per indagare il ruolo di geni specifici nella dinamica della MT, il knockdown proteico può essere ottenuto utilizzando il sistema UAS/GAL4²¹, con il driver materno pubblico matα4-Gal4-VP16 (noto anche come V32-Gal4; Tabella dei materiali), che avvia l'espressione di Gal4 nella linea germinale dagli stati 3–4 dell'oogenesi. Come descritto sopra, questo fattore induce l'espressione di EB1-GFP così come di costrutti UAS-RNAi, permettendo l'esaurimento delle proteine di interesse solo dopo la fase del germarium. Questa strategia bypassa le potenziali funzioni iniziali delle proteine bersaglio durante le divisioni mitotiche iniziali e la specificazione degli ovociti. Quando si effettuano tali esperimenti, le mosche devono essere preparate come descritto in precedenza.

2. Dissezione ovarica

1. Anestetizzare le femmine F1 usando CO₂ su un pad volante standard e selezionare una femmina per la dissezione.
2. Trasferire direttamente la femmina selezionata su una piastra di vetro da 35 mm (con spessore di vetro 0,13–0,15 mm) e mettere una goccia di olio di imaging sopra la mosca.
3. Posiziona la mosca rivolta verso il lato ventrale verso l'alto (ali rivolte verso il basso). Usando una pinzetta, tieni delicatamente la parte inferiore del torace con una pinzetta e, con una seconda pinzetta, pizzica un po' la cuticola addominale dalla parte posteriore dell'addome.
4. Estrai delicatamente il tratto riproduttivo tirandolo fuori con attenzione attraverso l'apertura.
5. Isola le ovaie e poi i singoli ovarioli facendoli scorrere delicatamente attraverso l'olio con la pinzetta. Quando manipolano le ovaie, teneteli sempre vicino alle camere ovuli più vecchie (stadio 13–14) per evitare di danneggiare le fasi centrali più fragili (stadi 6–9), che sono quelle di interesse per l'imaging (Figura 1A,B).
6. Afferra la punta anteriore dell'ovaio, dove si trovano il germarium e le camere dell'ovulo in fase iniziale (Figura 1A,B). Applica una tensione lenta e costante per separare le singole ovaiole. Mentre tiri le mani, emergeranno camere delle uova in vari stadi dello sviluppo. Questo processo può essere ripetuto più volte per ovaio per isolare ulteriori ovari²² (vedi video per la dimostrazione).
   NOTA: Per gli ovociti sottoposti a trattamento a freddo per depolimerizzare la MT, sono state eseguite le dissezioni come descritto in precedenza, ma utilizzando tampone BRB-80 invece dell'olio di immagini. Le ovaie dissezionate sono state poi trasferite in microtubi contenenti BRB-80 e incubate sul ghiaccio per 15^{minuti e 23}. Dopo l'incubazione, le ovaie sono state trasferite in una ciotola a fondo di vetro con olio di imaging e il protocollo è stato ripreso dal passaggio 3.1.

3. Imaging dal vivo

1. Posiziona il piatto con fondo di vetro sul palco del microscopio usando il portavetrini appropriato.
2. Seleziona camere ovuli di stadio 7 o 8 per l'imaging.
   NOTA: Le camere degli uova in queste fasi possono essere identificate in base alla dimensione dell'ovocita e alla posizione nucleare. L'ovocita è chiaramente più grande delle singole cellule infermiere e occupa circa un terzo (stadio 7) a metà (stadio 8) della camera dell'uovo. Il nucleo dell'ovocita è posizionato nella corteccia anteriore dell'ovocito, adiacente alle cellule^{infermiere 24}.
3. Evita le camere ovuli per immagini che mostrano discontinuità nello strato cellulare follicolo esterno o altri segni di danno, che potrebbero indicare un disturbo meccanico causato dalla pinza. Per una qualità dell'immagine ottimale, utilizza un sistema di imaging confocale veloce con un alto rapporto segnale-rumore (SNR) e un obiettivo 63x (1,40 NA, immersione in olio). Assicurati di seguire i criteri di campionamento Nyquist-Shannon.
4. Regola la messa a fuoco e determina l'esposizione appropriata, poiché può variare a seconda del costrutto EB1 utilizzato (ad esempio, diversi promotori o etichette fluorescenti) e del sistema microscopico. Il segnale dovrebbe essere abbastanza brillante da tracciare la dinamica delle comete, ma non saturo o oscurato dalla fluorescenza di fondo.
5. Imposta il laser a 488 nm per eccitare il fluoroforio GFP (potenza laser del 10%; guadagno del rivelatore = 750 V). Seleziona una finestra di emissione appropriata da 500–550 nm o un set di filtri equivalenti per il fluoroforio GFP.
6. Acquisire video time-lapse di almeno 4 minuti di durata, utilizzando un intervallo di fotogrammi di 500 ms (2 fotogrammi/s) per ottenere dati sufficienti per tracciare i singoli MT più le finali. (Il video supplementare 1 illustra un'acquisizione rappresentativa in time-lapse adatta per un'analisi successiva di tracciamento MT).
7. Elaborare le immagini acquisite utilizzando il processore del rilevatore a matrice nel software di acquisizione del microscopio con la forza del filtro di elaborazione predefinita.
   NOTA: Una volta immersi nell'olio per immagini, le ovaie dissezionate rimangono vitali fino a 90 minuti. Durante questo periodo, le camere delle uova possono essere fotografate senza segni significativi di degenerazione. Dopo questo periodo, una nuova femmina dovrebbe essere dissezionata e le camere delle uova fresche preparate per l'imaging²⁰.

4. Elaborazione delle immagini

Esegui il seguente flusso di lavoro per generare grafici e statistiche al fine di quantificare vari parametri associati alla dinamica della MT. Esegui ogni passaggio automaticamente tramite macro/script o manualmente seguendo il protocollo (Figura 2). Tutte le macro Fiji, gli script di tracciamento e il codice di analisi Python utilizzati in questo flusso di lavoro sono forniti come File di Codifica Supplementare 1–7.

1. Pre-elaborazione delle immagini - PASSO 1
   I passaggi seguenti preparano le immagini in time-lapse grezze correggendo il fotosbiancamento e riducendo il rumore di fondo, garantendo la stabilità del segnale per il tracciamento. Innanzitutto, la visibilità EB1 è migliorata tramite un filtro Difference of Gaussians (DoG), che funziona come filtro passa-banda spaziale. Sottraendo un'immagine fortemente sfocata da una leggermente sfocata, questo processo sopprime la foschia citoplasmatica a bassa frequenza e il rumore dei pixel ad alta frequenza, isolando al contempo il segnale limitato dalla diffrazione delle comete EB1. In secondo luogo, viene applicato un filtro a gradiente temporale per valorizzare in particolare le punte MT in crescita. La pila di immagini viene ritagliata per mappare la dimensione temporale all'asse spaziale Y. Viene quindi applicata una convoluzione 1D con un nucleo [-1 0 1] per calcolare la derivata temporale di ogni pixel, evidenziando il bordo d'attacco delle comete in movimento dove l'intensità aumenta più rapidamente. Lo stack viene quindi rifatto rifatto alle dimensioni originali, unito in un'immagine composita ed esportato per l'analisi.
   NOTA: Questo passaggio può essere eseguito in batch per tutti i file di una cartella trascinando il file macro File1.Step1_MTs_macro.ijm (File di codifica supplementare 1) nelle Fiji e la gestione della macro.
   1. Installazione prerequisita di plugin (Configurazione una tantum)
      1. Lancia, Fiji. Naviga su Plugin > Installa nella barra dei menu.
      2. Nel file browser, seleziona il file File_7_Kalman_Stack_Filter_Compiled.jar (Supplementary Coding File 7) fornito con questo protocollo.
      3. Quando ti viene chiesto di salvare il plugin, assicurati che la destinazione sia la cartella predefinita dei plugin all'interno della cartella di installazione Fiji e clicca su Salva.
      4. Riavvia Fiji per completare l'installazione.
         NOTA: Questa versione compilata del plugin è identica a quella integrata di Fiji, ma elimina la necessità di un'installazione separata del Java Development Kit (JDK), snellendo il processo di configurazione.
   2. Correzione della candeggina e riduzione del rumore:
      1. Apri Fiji, poi apri ogni file usando il plugin importatore Bio-Formats
      2. Compensare il decadimento della fluorescenza nel tempo eseguendo il plugin Bleach Correction, utilizzando la correzione Simple-Ratio (background = 0).
      3. Esegui il Kalman Stack Filter Compiled (acquisition_noise = 0.1; bias = 0.7) per sopprimere il rumore casuale dei fotoni preservando la vera dinamica del segnale nel tempo
      4. Ritaglia la dimensione temporale risultante dell'immagine per ridurre i tempi di elaborazione, se desiderato.
         NOTA: Questi passaggi generano un'immagine deno, che poi appare come canale 1 alla fine del passaggio 1 (4.1.5) (Figura 3A). Si raccomanda di escludere i primi 5-10 fotogrammi (punti temporali), poiché la finestra mobile del filtro di Kalman filtra solo parzialmente questi fotogrammi iniziali.
   3. Differenza di miglioramento delle caratteristiche dei Gaussian (DoG):
      1. Duplica l'immagine della 4.1.2.4 due volte (clicca con il tasto destro sull'immagine e clicca su Duplica).
      2. Applica il plugin Gaussian Blur a una copia usando una sigma bassa (σ = 1).
      3. Applica il plugin Gaussian Blur all'altra copia usando un high sigma (σ = 8).
      4. Apri il plugin Image Calculator e sottrai l'immagine ad alta sigma da quella a bassa sigma (= Basso – Alto) per isolare i dettagli fini.
      5. Rimuovere lo sfondo utilizzando il Math > Sottrazione delle Fiji e selezionare un valore (soglia DoG = 100) per mantenere solo il segnale reale se necessario.
         NOTA: Questi passaggi generano un'immagine a differenza di Gauss, che poi appare come canale 2 alla fine del passaggio 1 (4.1.5) (Figura 3B).
   4. Miglioramento del segnale EB1-GFP:
      1. Seleziona l'immagine dalla 4.1.2.4 e usa il plugin Reslice con impostazioni: in alto, nessuna interpolazione.
      2. Usa il plugin Convolve 2D con kernel [–1 0 1] per migliorare le punte MT.
      3. Usa di nuovo il plugin Reslice con le stesse impostazioni per ripristinare le dimensioni originali dell'immagine.
      4. NOTA: Questi passaggi genereranno un'immagine con un segnale EB1-GFP potenziato. Questa immagine apparirà successivamente come canale 3 alla fine del passaggio 1 (4.1.5) (Figura 3C).
      5. Unisci i canali ed esporta immagine:
         1. Unisci l'immagine MT EB1-GFP (4.1.2.4) con l'immagine Difference of Gaussians (4.1.3.5) e l'immagine di potenziamento del segnale EB1-GFP (4.1.4.3) utilizzando il plugin Merge Channels. Assicurarsi che l'immagine da utilizzare per ulteriori analisi venga inserita sul Canale 3 durante il processo di fusione.
         2. Salva il file risultante come file .tif, utilizzando il formato di denominazione: "filename"_processed.tif. Assicurati che l'immagine utilizzata per l'analisi a valle termini con _processed.tif
2. Regioni di Interesse (ROI) - STEP 2
   In questo passaggio saranno definiti tre ROI lungo l'asse anteroposteriore dell'ovocito: anteriore (ROI1), medio (ROI2) e posteriore (ROI3). Esegui questa segmentazione spaziale per consentire l'analisi della dinamica della MT tra diverse regioni dell'ovocito.
   NOTA: Questo Passaggio 2 può essere eseguito per ogni "nome file"_processed.tif trascinando il file macro File_2_Step2_MTs_macro.ijm (Supplementary Coding File 2) a Fiji e premendo Run. La macro inviterà l'utente a disegnare manualmente un rettangolo nell'ovocito. La regione più vicina all'inizio del poligono (primo clic) corrisponde al primo ROI. La regione rettangolare selezionata sarà automaticamente suddivisa in ROI rettangolari uguali. Se non si salvano ROI, i passaggi successivi verranno eseguiti nell'immagine completa.
   1. Definizione dei ROI:
      1. Apri il file di destinazione tramite Plugin → Bio-Formats → Bio-Formats Importer.
      2. Usa lo strumento Polygon per disegnare una regione di interesse che copre la regione desiderata.
      3. Aggiungi la regione selezionata al ROI Manager (premi il tasto T).
      4. Ripeti il passo 4.2.1 per vedere quanti ROI ti servono.
   2. Misura e area di esportazione:
      1. Seleziona il primo ROI
      2. Esegui Analyze → Measure e salva il valore Area come file chiamato: "filename_processed_RoiArea.csv
         NOTA: Il nome del file deve corrispondere al nome originale dell'immagine e terminare con: _processed_RoiArea.csv
      3. Usa il ROI Manager per risparmiare i ROI. Usa lo stesso nome di file con il. Estensione del ROI per un singolo ROI, o l'estensione .zip per più ROI.
3. Rilevare e tracciare le comete EB1-GFP - PASSO 3
   Usa il plugin^{TrackMate 25} per rilevare le comete EB1-GFP e tracciare i loro movimenti nel tempo.
   NOTA: STEP 3 può essere applicato a ogni "nome file"_processed.tif trascinando il file macro File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py (Supplementary Coding File 3) nelle Fiji e premendo RUN. Poi seleziona una cartella da elaborare. I ROI verranno caricati automaticamente e l'analisi verrà eseguita per ogni file, generando output spot e track corrispondenti. Prima del processamento batch, si raccomanda di analizzare 2–3 immagini rappresentative per verificare visivamente che le impostazioni predefinite del rilevatore e del tracciatore siano appropriate per la dimensione e la dinamica delle comete. Se le impostazioni sono adeguate, l'utente può regolare i parametri rilevanti per tracciare accuratamente le punte EB1, minimizzando così falsi negativi e falsi positivi.
   1. Apri il file di destinazione tramite Plugin → Bio-Formats → Bio-Formats Importer
   2. Apri il plugin TrackMate. Seleziona SÌ se ti viene chiesto di scambiare T e Z.
   3. Seleziona rilevatore di log. Imposta il diametro della particella a 0,5 μm (regola secondo necessità)
   4. Imposta la soglia di qualità a 30 (aggiusta se necessario). Attiva sia la localizzazione Sub-pixel che il Pre-processing con un filtro mediano.
   5. Rimuovi eventuali filtri puntuali aggiuntivi. Seleziona il metodo di tracciamento di Kalman
   6. Imposta un raggio di ricerca iniziale a 0,5, un raggio di ricerca di 0,7 e un gap massimo di frame a 2 (aggiusta secondo necessità - Il raggio di ricerca iniziale genera il tracciatore, il raggio di ricerca controlla quanto lontano può muoversi un punto tra i fotogrammi, e il gap massimo del frame permette brevi sparizioni nella traiettoria).
   7. Salta il filtro delle tracce che apparirà. Una volta completata la traccia, vai su Spot → Esporta in CSV e nomina il file: "filename_ROI01_spots.csv
   8. NOTA: La denominazione dei file dovrebbe riflettere il numero di ROI analizzati. Se si utilizzano più ROI, si salva ogni file di output con un identificatore corrispondente, come _ROI01, _ROI02, ecc.
4. Visualizzazione dei dati e analisi quantitativa - PASSO 4
   Usa gli script Python per elaborare i dati di tracciamento e calcolare parametri chiave, tra cui numero di cometa, velocità, durata di vita, consistenza angolare e orientamento. Questi script generano tabelle riassuntive (file CSV), grafici e analisi statistiche per supportare l'analisi quantitativa della dinamica della MT (Figura 4).
   1. Configurazione dell'ambiente software:
      1. Installa la distribuzione Python (3.12). Assicurati che le seguenti librerie Python esterne siano installate (tramite pip install pandas numpy scipy matplotlib seaborn ipython statsmodels notebook): Pandas e NumPy (per la gestione delle strutture dati e calcoli numerici), SciPy e Statsmodels (in particolare scipy.stats, per statistiche circolari e test di ipotesi), Matplotlib e Seaborn (per generare rose plot e grafici a barre statistici), IPython (per gli strumenti di visualizzazione all'interno del notebook), Jupyter Notebook (per l'uso del notebook).
      2. Inserire i moduli di analisi personalizzati (File_5_MTModule1.py e File_6_MTModule2.py – File di Codifica Supplementare 5 e 6) nella directory radice accanto al quaderno di analisi (File 4_Step4_MTs_results.ipynb – File di Codifica Supplementare 4).
      3. Apri Jupyter notebook eseguendo il comando "jupyter notebook" nel terminale Python e carica il File 4_Step4_MTs_results.ipynb – Supplementary Coding File 4 notebook.
   2. Dati di input e definizione dei parametri:
      1. Compila il database per mappare le repliche biologiche ai loro metadati sperimentali.
      2. Fornire quanto segue per ogni esperimento: Nome base: La stringa identificativa unica trovata nei nomi dei file, Condizione: Il gruppo sperimentale (ad esempio, "Controllo", "Trattato"), Angolo di correzione: L'angolo necessario per allineare il ROI con l'asse biologico (ad esempio, Anteriore = 0°).
      3. Regolare i parametri: esportare formato immagine e dpi, tracciare i colori e la dimensione predefinita del bin per i calcoli angolari
      4. Imposta i parametri di filtraggio dei dati per escludere tracce brevi: Lunghezza minima del binario: le tracce più corte di questa durata vengono scartate
   3. Esecuzione della pipeline di analisi:
      1. Leggi ed esegue tutte le celle di codice per elaborare i dati grezzi di tracciamento. Lo script si sposta attraverso la lista del database per eseguire i seguenti passaggi procedurali:
         1. Identifica tutti i file CSV specifici per ROI associati a ciascun Nome Base.
         2. Traccia di filtro basata sulla lunghezza minima (vengono mantenute solo traiettorie che persistono per più di 3 fotogrammi), calcola velocità istantanee, calcola lo spostamento totale e applica la correzione dell'angolo di riferimento a tutte le traiettorie.
         3. Normalizzare il conteggio delle comete in base all'area ROI (caricata dai metadati) per calcolare la densità della cometa.
      2. Aggregare i dati processati in un dataset master (df_all) e calcolare statistiche generali riassuntive (velocità media, durata del tracciato e lunghezza del vettore di coerenza angolare) per ogni ROI.
      3. Esegui la funzione make_combined_rose_panel per generare appezzamenti di rose raggruppati. Questo crea un confronto affiancato a pannello delle distribuzioni angolari per tutti i ROI all'interno di ogni condizione sperimentale. Esegui create_comprehensive_analysis_plots_enhanced per creare grafici a barre per metriche scalari.
      4. Esegui la funzione run_angle_analysis_pipeline per eseguire un'analisi di orientamento specifica:
         1. Classifica i brani in bins di orientamento usando due strategie: Cardinal Binning (4 bins di larghezza 90°: Nord/Anteriore, Est/Destra, Sud/Posteriore, Ovest/Sinistra) e Anteriore/Posteriore (2 contenitori di 180° Anteriore vs. Posteriore).
         2. Calcola la percentuale di tracce che si muovono in ciascuna orientazione definita per ogni ovocito.
   4. Analisi statistica e generazione di output:
      1. Iterare attraverso metriche scalari definite: numero medio di comete per frame per area, durata media della traccia della cometa e velocità media della cometa. Per ogni metrica, esegue:
         1. Eseguire test Kruskal-Wallis o Mann-Whitney U per confronti indipendenti tra condizioni sperimentali.
         2. Esegui test di Friedman o Wilcoxon per valutare la coerenza tra i ROI.
         3. Eseguire test Friedman e Wilcoxon Signed-Rank (utilizzando il metodo Pratt) per valutare le preferenze di orientamento (ad esempio, Nord vs. Sud) all'interno di ogni ROI.
         4. Esporta i seguenti risultati nella directory Risultati : CSV riassuntivi (metrics_table.csv, track_table.csv, roi_metrics.csv), Rapporti statistici (ad esempio, Cometa media velocity_mwu.csv) e Grafici (file PNG ad alta risoluzione).
            NOTA: Il Passo 4 può essere eseguito solo in Python. Apri il File_4_Step4_MTs_results.ipynb ed leggi ed esegui tutte le celle. Ogni cella contiene istruzioni per l'esecuzione e il rispettivo esito atteso.

5. Analisi statistica:

NOTA: A causa della distribuzione non gaussiana dei dati di tracciamento, sono stati utilizzati test statistici non parametrici per tutti i confronti.

1. Valutare le differenze indipendenti tra condizioni sperimentali (ad esempio, Controllo vs. Trattate) utilizzando il test Mann-Whitney U (per due gruppi) o il test di Kruskal-Wallis, seguito da confronti post-hoc a coppie (per >2 gruppi)).
2. Valuta le preferenze orientazionali all'interno dello stesso ROI utilizzando il test di Friedman (differenza globale) seguito dal test Wilcoxon Signed-Rank (a coppie).
3. Gestire i legami a differenza zero usando il metodo Pratt.
4. Riportate i confronti a coppie come p-value non corretti per preservare la potenza statistica. Usa gli script forniti per riportare sia i p-valori grezzi che quelli corretti, con la significanza impostata a 0,05. Riporta tutte le statistiche riassuntive come Medio ± Errore Standard della Media (SEM), salvo diversa indicazione).

Results

Questo protocollo è stato utilizzato con successo per analizzare la dinamica della crescita e la polarità della MT negli ovociti di Drosophila melanogaster nelle fasi medie dell'oogenesi, utilizzando EB1-GFP, una proteina a tracciamento positivo che segna i siti di polimerizzazione attiva della MT^17,18. Quando viene fotografata tramite microscopia confocale a scansione laser, EB1-GFP appare come "comete" brillanti e punteggiate che si muovono nell'orientamento della crescita MT^17,18 (Figura 3A; Video supplementare 1). Il tracciamento e la quantificazione di queste comete permettono una valutazione precisa della nucleazione, dell'allungamento e dell'organizzazione della MT all'interno dell'ovocito. Utilizzando questo protocollo di workflow, la dinamica della MT è stata valutata negli ovociti di controllo e negli ovociti sottoposti a perturbazioni sperimentali della rete MT. In particolare, il comportamento della cometa EB1 è stato confrontato in tre condizioni: ovociti di controllo non trattati, ovociti di controllo trattati a freddo e ovociti mutanti diP-atronina trattati a^{freddo 12,26}. Il trattamento a freddo induce la depolimerizzazione della MT, permettendo la valutazione della ricrescita della MT durante il recupero. Ovociti mutanti dip-atronina eterozigoti (+/patr⁰⁵²⁵²) sono stati inclusi come controllo positivo per la compromessa della dinamica della MT. La patronina è uno stabilizzatore MT a estremità^{meno 27} conservato, ed è un componente centrale degli ncMTOC negli ovociti¹² e in altri^{tessuti 2}. Lavori precedenti hanno dimostrato che i mutanti della patronina sottoposti alla depolimerizzazione MT mostrano una significativa diminuzione del numero di comete EB1 dopo la ricrescita¹². Così, includere mutanti eterozigoti della patronina ha permesso la validazione del metodo rispetto a un noto background difettoso per la ricrescita della MT. Gli ovociti degli stadi 7-8 sono stati fotografiati quando i centrosomi sono attenuati e i MT vengono generati tramite vie acentrosomali.

In linea con osservazioni precedenti, la massima densità di comete EB1 è stata rilevata nella regione anteriore dell'ovocito, con una graduale diminuzione verso il^{posteriore 14,15} (Figura 5B; Tabella 1; Tabelle Supplementari 1 e 2). Per distinguere tra veri eventi di polimerizzazione MT e segnali stazionari o fuori piano, questo protocollo discrimina tra il numero totale di fochi EB1-GFP rilevati e il sottoinsieme di focoli mobili. La frazione immobile probabilmente rappresenta comete ferme o comete che si muovono prevalentemente nel piano assiale (Figura 5A,B). Le analisi della lunghezza della traccia MT e della velocità di crescita sono state effettuate esclusivamente sulle comete mobili EB1-GFP per evitare l'inclusione di segnali stazionari o movimenti assiali che potrebbero interferire con la stima della lunghezza e della velocità della traccia. I focus totali EB1-GFP e la frazione mobile sono presentati in grafici separati per consentire un confronto diretto tra rilevamento complessivo e comportamento dinamico (Figura 5A,B). Negli ovociti di controllo, il protocollo ha misurato rispettivamente 0,189 ± 0,02 comete mobili EB1 SEM/μm² (18,9 comete EB1/100^{μm 2}) nella regione anteriore, seguiti rispettivamente da 0,064 ± 0,02 SEM e 0,043 ± 0,01 SEM comete mobili EB1/μm² nelle regioni medie e posteriori, rispettivamente (6,4 e 4,3 comete EB1/100^{μm 2}) (Figura 5B; Tabella 1; Tabelle Supplementari 1 e 2). Uno studio^{precedente 28} che misurava comete EB1 nello stesso stadio di sviluppo ha rilevato 48,54 comete EB1/100μm², valori superiori ai valori rilevati qui per comete EB1-GFP mobili. Tuttavia, i valori misurati sono coerenti considerando il numero totale di comete EB1-GFP rilevate (Figura 5A; Tabella 1; Tabelle Supplementari 1 e 2). La sezione Materiali e Metodi di quello studio non specifica quanti z-stack siano stati utilizzati per visualizzare gli ovociti. È quindi possibile che più di uno z-stack sia stato incluso nell'analisi, il che potrebbe aver contribuito al maggior numero di comete EB1-GFP rilevate. Un altro fattore che può influenzare i valori riportati è la regione dell'ovocita selezionata per la quantificazione della cometa. Se fossero state scelte regioni di interesse più vicine al polo più anteriore, dove la densità della cometa EB1 è più alta, ciò avrebbe potuto aumentare la densità media della cometa rispetto alle misurazioni qui presentate. Tuttavia, i risultati ottenuti qui sono dello stesso ordine di grandezza e riflettono costantemente una diminuzione della densità della cometa EB1 verso la regione posteriore, come precedentemente^{riportato 14,15}.

Dopo la ricrescita della MT indotta dal freddo, gli ovociti di controllo hanno mostrato numeri di comete EB1 paragonabili a quelli dei controlli non trattati, indicando un recupero robusto della MT. Al contrasto, in linea con i precedenti^{rapporti 12}, i mutanti patronina hanno mostrato una significativa riduzione del numero di comete EB1 mobili nella regione anteriore (ROI1) rispetto a entrambi i controlli (Figura 5B; Tabella 1; Tabelle Supplementari 1 e 2). Sebbene anche il numero di comete nelle regioni medie e posteriori (ROI 2 e 3) abbia tendito a diminuire, queste differenze non sono state statisticamente significative (Figura 5B). La riduzione osservata qui è stata meno marcata rispetto a quella riportata negli saggi basati su^{nocodazolo 12}. Questo probabilmente riflette l'uso di mutanti patronina eterozigoti in cui un solo allele è mutato. Inoltre, il protocollo di depolimerizzazione indotta dal freddo potrebbe non depolimerizzare completamente tutte le MT, e l'intervallo di 5–15 minuti tra la rimozione dal ghiaccio e l'imaging probabilmente permette una nucleazione e una ricrescita delle MT prima dell'acquisizione dei dati. Al contrario, i test a base di nocodazolo vengono eseguiti immediatamente dopo l'inattivazione del colcemido, utilizzando un microscopio laser^{UV 12}. Tuttavia, questi risultati dimostrano che questo protocollo può rilevare alterazioni biologicamente rilevanti e specifiche per regione nell'organizzazione della MT. Essi si allineano anche all'arricchimento degli ncMTOC e di Patronina, un componente centrale del ncMTOC, situato nella parte anteriore dell'ovocito. La riduzione più debole del numero di comete nelle regioni medie e posteriori può anche riflettere l'esclusione evolutiva di ncMTOC e Patronin dalla corteccia posteriore in queste^{fasi 12}.

L'analisi della lunghezza delle tracce EB1 negli ovociti di controllo ha rivelato tracce di comete più lunghe nella regione anteriore dell'ovocita (0,613 μm ± 0,04 SEM) e comete più corte nelle regioni medie e posteriori (rispettivamente 0,463 μm ± 0,04 SEM e 0,488 μm ± 0,05 SEM) (Figura 5C; Tabella 1; Tabelle Supplementari 1 e 2). Questo risultato è coerente con dati precedenti che mostravano che le MT persistono per tempi più brevi al polo posteriore rispetto a quello anteriore, suggerendo che le MT al polo posteriore siano più^{corte 14}. Negli ovociti mutanti eterozigoti di patronina trattati a freddo, la lunghezza della cometa EB1 è stata significativamente ridotta rispetto ai controlli trattati a freddo nelle regioni anteriore e posteriore. Una tendenza simile non statisticamente significativa è stata osservata nella regione centrale (Figura 5C; Tabella 1; Tabelle Supplementari 1 e 2), suggerendo una riduzione parziale della stabilità della MT. Questi risultati insieme, supportano il ruolo noto della Patronina come stabilizzatore MT a estremità negativa e sono coerenti con osservazioni precedenti in cellule coltivate da Drosophila, dove la perdita di Patronin porta a fusi MT più^{corti 12,27}. Questi risultati evidenziano anche la sensibilità di questo protocollo nel rilevare perturbazioni sottili ma biologicamente significative nella dinamica della MT.

Misurando la velocità della cometa EB1 negli ovociti di controllo, l'analisi ha rilevato velocità medie di 0,208 ± 0,01 μm/sec, 0,207 ± 0,01 μm/sec e 0,202 ± 0,01 μm/sec rispettivamente nelle regioni anteriore, media e posteriore (Figura 5D; Tabella 1; Tabelle supplementari 1 e 2), coerenti con i lavori^{precedenti 14,15}. Gli ovociti di controllo hanno mostrato una leggera diminuzione della velocità di crescita della MT dalla regione anteriore a quella posteriore. Ciò potrebbe riflettere l'arricchimento degli ncMTOC, insieme ad altre potenziali proteine associate ai microtubuli (MAP) non identificate, nelle regioni antero-laterali, che facilitano la crescita e l'estensione della MT, contribuendo così alla diminuzione posteriore osservata. Negli ovociti trattati a freddo, i mutanti eterozigoti della patronina hanno mostrato una tendenza non statisticamente significativa verso una leggera riduzione della velocità di crescita della MT rispetto ai controlli, anche se questa differenza non ha raggiunto significatività statistica (Figura 5D; Tabella 1; Tabelle Supplementari 1 e 2). Questa scoperta è coerente con osservazioni precedenti in cellule staminali neurali di Drosophila che esprimono mutanti della^{patronina 29}.

La localizzazione degli ncMTOC nella regione antero-laterale dell'ovocito, insieme alla loro esclusione dalla parte posteriore, fa sì che la maggior parte delle MT venga cresciuta con le estremità negative ancorate nella corteccia antero-laterale. Di conseguenza, all'interno dell'ovocita si stabilisce un gradiente antero-posteriore di MT, con un modesto bias di orientamento: il 60% delle MT cresce verso la parte posteriore e il 40% verso la¹⁴ anteriore. Il nostro protocollo ha rilevato con successo questo bias negli ovociti di controllo in tutte le regioni dell'ovocita (Figura 5E). Il bias nell'orientamento della MT era più marcato nella regione posteriore, come precedentemente^{riportato 14}. In particolare, questo arricchimento posteriore del bias di orientamento è andato perso dopo il trattamento a freddo negli ovociti mutanti patronina di controllo e eterozigoti (Figura 5E,F). Negli ovociti di controllo trattati a freddo, l'orientamento della MT si è spostato verso una crescita orientata anteriormente in tutte le regioni. Questo spostamento apparve come una tendenza nelle regioni anteriori e medie e divenne statisticamente significativo nella regione posteriore (Figura 5F). Una possibile spiegazione per questa perdita di bias verso il lato posteriore è che, in condizioni trattate a freddo, le MT appena polimerizzate possono richiedere tempo per associarsi a MAP, come le proteine motorie, che promuovono la stabilizzazione e/o il reticolamento MT. Il ritardo nel reclutamento di questi fattori potrebbe compromettere il rinforzo delle MT orientate a posteriore. In sintesi, questo protocollo consente un'analisi sensibile e quantitativa della crescita, della lunghezza, della velocità e dell'orientamento della MT all'interno degli ovociti. Rileva in modo affidabile cambiamenti specifici per regione e biologicamente significativi nella dinamica della MT, in linea con studi precedenti, e dimostra sensibilità a risolvere differenze sottili nel comportamento della MT, come illustrato dalle osservazioni effettuate nei mutantieterozigoti della p-atronina.

Figura 1: Oogenesi di Drosophila melanogaster (A) Panoramica dell'oogenesi nell'ovaio di Drosophila . Ogni ovaio contiene 12–16 ovaioli, che funzionano come linea di produzione di uova. L'oogenesi inizia nel germario, dove 2–3 cellule staminali germinali si dividono asimmetricamente, dando origine a una cellula staminale e una cellula figlia che inizia a differenziarsi. Queste cellule subiscono 4 divisioni mitotiche per formare una cisti di 16 cellule collegata da canali ad anello. Da queste cellule, una diventerà l'ovocito, mentre le altre fungono da cellule nutrice, supportando la crescita e lo sviluppo dell'ovocita fino a un ovocita di stadio 14 all'estremità posteriore. (B) Schema della camera dell'uovo di Drosophila stadio 9. Le MT sono generate da ncMTOC localizzati nella corteccia antero-laterale, che sono esclusi dal lato posteriore^{dell'ovocita 12}. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Diagramma del flusso di lavoro del protocollo. Panoramica dei principali passaggi dalla dissezione ovarica e l'imaging dal vivo al tracciamento della cometa e all'analisi quantitativa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagini rappresentative generate dall'elaborazione degli ovociti di stadio 7–8. (A-E) Immagini rappresentative che illustrano il flusso di lavoro di elaborazione delle immagini nel passo 1 applicate agli ovociti dello stadio 7–8 da oociti trattati a freddo da patronina 05252 di controllo, controllo trattati a freddo e eterozigoti ^{patronina 05252}. I canali sono un'immagine rappresentativa da una proiezione massima di 2 fotogrammi da un film time-lapse di 150 fotogrammi acquisito a 0,5 secondi per fotogramma. (A) Canale 1, che corrisponde alla generazione di un'immagine denodatata dall'ovocita fotografica corrispondente. (B) Canale 2, che corrisponde alla generazione di una differenza di immagine gaussiana. (C) Canale 3, che corrisponde alla generazione di un'immagine in cui il segnale delle comete EB1-GFP è stato potenziato per mostrare le punte delle comete. (D) Fusione dei canali 2 e 3, che aiuta a visualizzare le punte delle comete risultanti dall'elaborazione del canale 2. (E) Traiettorie di comete EB1-GFP generate dal time-lapse C in FIJI utilizzando il plugin Temporal Color Code per illustrare la dinamica MT. Il codice colore indica la proiezione temporale per 20 fotogrammi (0,50 s tra i fotogrammi). Barra della scala = 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Screenshot di una sezione nel PASSO 4 di Jupyter Notebook. Il quaderno è strutturato con celle Markdown che forniscono istruzioni autoesplicative, seguite da celle di codice che producono risultati e log in tempo reale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Analisi della dinamica della cometa EB1-GFP negli ovociti di controllo e trattati a freddo degli stadi 7-8. I dati rappresentano la media ± SEM per ROI (ROI1–ROI3) per oociti trattati a freddo per controllo, controllo trattato a freddo e ^{patronina 05252} trattati a freddo. Le misurazioni della cometa EB1-GFP sono state ottenute da immagini time-lapse elaborate a FIJI; salvo diversa indicazione, le analisi venivano effettuate su immagini elaborate su Channel 3. Il numero totale di comete EB1-GFP è stato analizzato da immagini del Canale 2 (Immagine DoG). La significatività statistica è stata valutata utilizzando il test di Kruskal–Wallis seguito da confronti post-hoc di Mann–Whitney, oppure il test di Friedman seguito dai test di Wilcoxon a coppie abbinate, a seconda di quanto appropriato (p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001). (A) Grafico a punti a dispersione che mostra il numero medio di numeri totali di comete EB1-GFP. (B) Grafico di punti a scatter che mostra il numero medio di comete EB1-GFP mobili. (C) Grafico a punti a dispersione che mostra la lunghezza media della traccia della cometa EB1-GFP. (D) Grafico a punti a dispersione che mostra la velocità media della cometa EB1-GFP. (E) Grafici di Rose che mostrano l'orientamento delle tracce EB1-GFP all'interno di ROI1–ROI3 in controllo (n = 14), controllo trattato a freddo (n = 12) e ^{patronina 05252} oociti trattati a freddo (n = 11). La percentuale media di ogni traccia per ovocito, orientata verso l'anteriore (A) o posteriore (P), è indicata per ogni condizione e ROI. (F) Grafico a barre che mostra la percentuale media degli angoli di traccia della cometa EB1-GFP orientati verso i lati anteriore e posteriore dell'ovocita. Le percentuali sono state calcolate per oovocita e rappresentano la distribuzione relativa dell'orientamento della cometa all'interno di ogni ROI. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Metrica	ROI	Controllo (n=14)	Controllo del trattamento a freddo (n=12)	Patronin05252 trattato a freddo (n=11)
Numero totale della cometa EB1-GFP (#/μm2)	ROI 1 (anteriore)	0,667 ± 0,18	0,691 ± 0,20	0,570 ± 0,17
	ROI 2 (centro)	0,394 ± 0,11	0,532 ± 0,15	0,400 ± 0,12
	ROI 3 (posteriore)	0,353 ± 0,09	0,561 ± 0,16	0,378 ± 0,11
Numero cometa EB1-GFP motile (#/μm2)	ROI 1 (anteriore)	0,189 ± 0,02	0,175 ± 0,03	0,099 ± 0,03
	ROI 2 (centro)	0,064 ± 0,02	0,091 ± 0,02	0,056 ± 0,02
	ROI 3 (posteriore)	0,043 ± 0,01	0,104 ± 0,03	0,047 ± 0,02
Lunghezza della traccia della cometa EB1-GFP (μm)	ROI 1 (anteriore)	0,613 ± 0,04	0,621 ± 0,03	0,478 ± 0,07
	ROI 2 (centro)	0,463 ± 0,04	0,535 ± 0,03	0,410 ± 0,05
	ROI 3 (posteriore)	0,488± 0,05	0,543 ± 0,04	0,393 ± 0,05
Velocità della cometa EB1-GFP (μm/sec)	ROI 1 (anteriore)	0,208 ± 0,01	0,198 ± 0,01	0,188 ± 0,01
	ROI 2 (centro)	0,207 ± 0,01	0,199 ± 0,01	0,186 ± 0,01
	ROI 3 (posteriore)	0,202 ± 0,01	0,194 ± 0,01	0,177 ± 0,01

Tabella 1. Sommario delle misurazioni della cometa EB1-GFP nelle regioni antero-posteriori negli ovociti analizzati. Le misurazioni sono state ottenute da ovociti trattati a freddo da patronina eterozigoti e trattati a freddo da^{patronina 05252} . Le regioni di interesse erano definite come ROI1 (anteriore), ROI2 (centrale) e ROI3 (posteriore).

Tabella supplementare 1. Analisi statistica delle misurazioni della cometa EB1-GFP tra condizioni sperimentali. I valori p indicano differenze tra oociti di controllo, di controllo trattati a freddo e di patronina⁰⁵²⁵² trattati a freddo eterozigoti per ciascun ROI (ROI1-ROI3). I confronti globali tra le tre condizioni sono stati effettuati utilizzando il test di Kruskal–Wallis, seguiti da confronti post hoc di Mann–Whitney a coppie.  Clicca qui per scaricare questo file

Tabella supplementare 2. Confronto statistico delle misurazioni della cometa EB1-GFP tra ROI all'interno di ciascuna condizione sperimentale. I valori p indicano differenze tra ROI1 (anteriore), ROI2 (centrale) e ROI3 (posteriore) all'interno di oociti trattati a freddo con patronina 05252 in controllo, controllo trattato a freddo e eterozigote ^{patronina 05252}. Le differenze complessive tra i ROI all'interno di ciascuna condizione sono state valutate utilizzando il test di Friedman. Confronti a coppie tra ROI sono stati successivamente effettuati utilizzando test Wilcoxon con file a file con parete abbinate. Clicca qui per scaricare questo file

Video supplementare 1. Imaging in time-lapse della proteina plus-end-tracking EB1-GFP in un ovocita di controllo stadio 7–8, dimostrando un'acquisizione rappresentativa adatta a un'analisi successiva del tracciamento MT (relativo alla Figura 3). Clicca qui per scaricare questo file

Fascicolo di codifica supplementare 1: File_1_Step1_MTs_macro.ijm. Un macro Fiji/ImageJ per la pre-elaborazione delle immagini. Automatizza la correzione del fotosbiancamento, il filtraggio di Kalman e la sottrazione di fondo utilizzando un filtro Difference of Gaussians (DoG). Applica inoltre un miglioramento del gradiente temporale (relicing e convoluzione 1D) per affinare i bordi anteriori delle punte MT e migliorare la fedeltà del tracciamento. Clicca qui per scaricare questo file

Fascicolo di codifica supplementare 2: File_2_Step2_MTs_macro.ijm. Una macro Fiji/ImageJ per la definizione semi-automatizzata della Regione di Interesse (ROI). Invita l'utente a definire il confine dell'ovocita e segmenta automaticamente la selezione in zone equidistanti (nel nostro esempio 3 zone: Anteriore, Centrale e Posteriore) per consentire la stratificazione regionale dell'analisi. Clicca qui per scaricare questo file

Fascicolo di codifica supplementare 3: File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py. Uno script Python (eseguito all'interno di Fiji/ImageJ) che effettua il tracciamento automatico delle comete EB1 usando Trackmate. Elabora in batch immagini pre-elaborate, rileva comete usando parametri di qualità definiti, le collega in traiettorie ed esporta i dati grezzi delle coordinate come file CSV. Clicca qui per scaricare questo file

Fascicolo di codifica supplementare 4: File_4_Step4_MTs_results.ipynb. Un Jupyter Notebook che funge da interfaccia primaria per l'analisi quantitativa. Carica i dati grezzi di tracciamento, esegue la pipeline di analisi e genera tutti i risultati finali, inclusi grafici delle rose, tabelle statistiche riassuntive e grafici comparativi per la densità, la velocità e la durata della cometa. Clicca qui per scaricare questo file

Fascicolo di codifica supplementare 5: File_5_MTModule1.py. Un modulo Python personalizzato contenente funzioni di utilità fondamentali utilizzate per l'estrazione dei dati e i calcoli geometrici di base. Include funzioni per trovare file ROI, calcolare velocità istantanee e calcolare gli spostamenti angolari di base. Clicca qui per scaricare questo file

File di codifica supplementare 6: File_6_MTModule2.py. Un modulo Python personalizzato contenente funzioni avanzate di analisi e visualizzazione. Ospita gli algoritmi per la pipeline di analisi dell'orientamento (binning cardinale vs. assiale), test statistici robusti (metodo Friedman/Wilcoxon con Pratt) e la generazione di grafici polari (rose) di qualità pubblicazione. Clicca qui per scaricare questo file

File di codifica supplementare 7: File_7_KalmanStackFilterCompiled.jar. Un plugin compilato Java Kalman Filter per Fiji/ImageJ è necessario per i passaggi di riduzione del rumore nella macro di pre-elaborazione. Questa versione standalone elimina la necessità di un Java Development Kit (JDK) separato, semplificando la configurazione software dell'utente. Clicca qui per scaricare questo file

Discussion

L'imaging in tempo reale della dinamica della MT negli ovociti presenta sfide uniche, poiché sono necessari dataset di alta qualità e analisi quantitative per estrarre informazioni significative. Sebbene studi precedenti abbiano riportato approcci di imaging live^{14, 15, 16}, i passaggi di analisi delle immagini sono spesso altamente personalizzati e i protocolli non forniscono dettagli sufficienti per la riproducibilità. Di conseguenza, i ricercatori privi di un'ampia esperienza di imaging o computazionali possono incontrare ostacoli nella riproduzione di queste analisi. Per affrontare queste sfide, è stato sviluppato un flusso di lavoro semplificato, che combina immagini live Airyscan ad alta risoluzione con macro e script automatizzati e facilmente utilizzabili. Questa pipeline consente una rilevazione e un tracciamento efficienti delle comete EB1, seguiti da un'analisi quantitativa dell'orientamento, della velocità e dell'organizzazione spaziale della MT. Minimizzando l'intervento manuale e fornendo istruzioni chiare passo dopo passo, il flusso di lavoro promuove l'accessibilità e la riproducibilità dell'analisi della dinamica della MT negli ovociti.

La dissezione ovarica e la preparazione del campione sono passi fondamentali per iniziare. Gli ovociti devono essere sezionati con attenzione per evitare danni meccanici, e la durata delle immagini dovrebbe essere limitata a 90 minuti per mantenere la^{vitalità 20}. La selezione dello stadio è importante: dopo la metà dell'oogenesi, l'ovocita aumenta di dimensione e accumula tuorlo nel citoplasma, rendendo la visualizzazione del segnale EB1 sempre più difficile oltre lo stadio 9. Pertanto, non è raccomandata un'imaging oltre lo^{stadio 9 20}. Inoltre, per quantificazioni riproducibili, quando possibile, sono preferibili ovociti di dimensioni comparabili, poiché ciò garantisce che le regioni definite di interesse corrispondano a posizioni equivalenti anteriore-posteriori tra i campioni.

Il controllo della temperatura è essenziale per la riproducibilità. Le scorte di mosche devono essere mantenute a condizioni di coltura standard (25 °C) per supportare uno sviluppo normale e un'espressione costante di EB1-GFP, in particolare quando si utilizza il sistema GAL4/UAS, sensibile alle fluttuazioni di temperatura. La stabilità della temperatura durante l'imaging è altrettanto importante, poiché le variazioni possono influenzare la dinamica della MT. Sebbene non sia necessaria una camera a temperatura controllata, si raccomanda di evitare le fluttuazioni di temperatura durante l'acquisizione.

Per l'acquisizione dell'immagine, è stata selezionata la ripresa confocale con rilevatore di array per la sua elevata sensibilità e il miglioramento SNR, riducendo così la necessità di derumore post-acquisizione. Obiettivi numerici ad alta apertura (il più elevati possibile) in combinazione con un adeguato abbinamento dell'indice di rifrazione dovrebbero essere utilizzati per massimizzare la risoluzione laterale e assiale, fondamentale per risolvere singole comete in reti dense. Inoltre, i criteri di campionamento^{Nyquist-Shannon 30} devono essere seguiti in XYZ e tempo per evitare perdite di accuratezza nel tracciamento della cometa. Altrettanto importante è la selezione attenta del piano di imaging lungo l'asse z. Un'imaging troppo profonda provoca perdita di fluorescenza dovuta alla diffusione della luce, mentre limitare l'acquisizione alla superficie corticale non riesce a catturare la dinamica completa delle comete EB1. I dati più informativi si ottengono in una posizione intermedia z. Gli ovociti in cui il nucleo si trova nel piano selezionato dovrebbero essere evitati, poiché il compartimento nucleare sposta una grande parte del citoplasma e manca di tracce EB1, riducendo così il numero di comete rilevabili.

Sebbene ottimizzata per l'imaging confocale basato su rilevatori di matrice, questa pipeline di analisi è indipendente dall'hardware e compatibile con altre modalità, come la microscopia confocale a disco rotante. Tuttavia, gli utenti devono essere consapevoli che sistemi con NA o SNR più bassi potrebbero richiedere aggiustamenti ai parametri di preelaborazione del macro (ad esempio, tolleranza al rumore/sigma DoG) e possono portare a una riduzione della densità di rilevamento comete rispetto ai valori presentati in questo studio. Tuttavia, sebbene i valori assoluti possano variare tra i sistemi, le tendenze relative osservate tra condizioni sperimentali e ROI come previsto dovrebbero rimanere robuste.

Data la grande struttura 3D dell'ovocito, l'imaging 2D cattura solo una sezione ottica della rete MT. Di conseguenza, le comete che si muovono ripidamente lungo l'asse z possono uscire dal piano focale, portando potenzialmente a una sottostima della durata della traccia e della velocità assoluta (poiché viene misurata solo la componente xy del vettore velocità). Tuttavia, l'imaging volumetrico 3D ad alta velocità dell'intero ovocita richiederebbe campi visivi (FOV) più ristretti, tempi di esposizione più brevi e tempi di risposta del rivelatore più rapidi, riducendo così il SNR e distribuendo i tempi di acquisizione su più z-slice, compromettendo così la risoluzione temporale necessaria per il tracciamento rapido delle comete EB1. Per mitigare comete immobile e artefatti fuori fuoco, sono stati applicati filtri convoluzionali e a durata minima delle tracce (escludendo tracce < 3 fotogrammi) per rimuovere i punti transitori che attraversano il piano focale. Inoltre, poiché questa limitazione geometrica si applica uniformemente in tutte le condizioni sperimentali, le differenze relative osservate nella densità, velocità e orientamento della cometa rimangono robuste. Sebbene tecniche emergenti come la microscopia a campo luminoso dovrebbero idealmente catturare contemporaneamente l'intera struttura 3D, non sono ancora ampiamente disponibili. Tuttavia, i valori misurati per tutti i parametri della MT-dinamica sono coerenti con i rapporti precedenti, indicando che questo protocollo è adatto per indagare la dinamica della MT in diversi configurazioni sperimentali.

Prima di utilizzare le macro in questo protocollo, si raccomanda di elaborare manualmente le prime immagini per assicurarsi che i parametri software siano correttamente ottimizzati. Fattori come la risoluzione di immagini, l'ingrandimento, il rapporto segnale-rumore, il frame rate e se i dati sono single-plane o z-stack possono tutti influenzare la precisione del tracciamento. Regolazione iterativa dei parametri mentre si ispezionano visivamente le tracce risultanti per minimizzare falsi positivi e falsi negativi. Una volta ottimizzati, applica i parametri in modo coerente tra i dataset per garantire la riproducibilità.

Infine, va sottolineato alcune limitazioni riguardo all'interpretazione biologica. EB1-GFP etichetta selettivamente la MT più le estremità in crescita e quindi riporta i siti di polimerizzazione attiva della MT piuttosto che l'intera popolazione di MT. Le MT stabili e non polimerizzanti presenti durante il periodo di imaging non vengono rilevate da questo metodo. Sebbene questa limitazione sia meno restrittiva negli ovociti a metà oogenesi, dove la maggior parte delle MT è altamente dinamica, dovrebbe essere considerata nell'applicazione del protocollo ad altri tipi cellulari con popolazioni stabili di MT sostanziali, come i neuroni³¹.

In conclusione, questo flusso di lavoro consente un'analisi quantitativa ad alta risoluzione della dinamica della MT negli ovociti di Drosophila . Integrando dissezione ottimizzata, imaging live confocale con rilevatore di array e strumenti di analisi automatizzata, fornisce un metodo rigoroso ma accessibile per indagare i regolatori MT in un contesto acentrosomale. Sebbene principalmente validati negli ovociti, i principi di questo approccio sono adattabili, una volta ottimizzati, ad altri tipi cellulari, incluse cellule non divisive come neuroni ed epiteli, offrendo una piattaforma scalabile per screening genetici e studi meccanicistici sull'organizzazione della MT.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pinza Dumont #5	Strumenti scientifici di qualità	11252-20
EB1::GFP	Dal Dr. Antoine Guichet, CNRS, Institut Jacques Monod, Francia		Genotipo: w; +/CyO; UASp-EB1::GFP/TM3
Piastre di Petri con fondo di vetro	MatTek	P35G-1.0-14-C
Matα 4-Gal4-VP16	Centro Stock Drosophila di Bloomington	7062	Genotipo: w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H
Oil 10S, VOLTALEF	VWR Chemicals	24627.188
Mutante Patronin	Centro Stock Drosophila di Bloomington	16647	Genotipo: y[1] w[67c23]; P{y[+mDint2] w[+mC]=EPgy2}Patronin[EY05252]/CyO
W1118	Centro Stock Drosophila di Bloomington	3605
Zeiss LSM 980 con Airyscan 2	Zeiss