Immunocolorazione e esperimenti di penetrazione del colorante per definire le proteine di giunzione settata piegate core nell'epitelio embrionale di Drosophila

Sommario

Questi protocolli delineano come caratterizzare l'organizzazione e la funzione di occluso delle giunzioni del setto piegato nell'epitelio embrionale di Drosophila di controllo e mutante.

Abstract

Lo scopo di questi protocolli è valutare l'organizzazione e la funzione barriera delle giunzioni settate piegate (pSJ) nei tessuti epiteliali derivati dall'ectodermia degli embrioni di Drosophila. La pSJ forma una barriera occlusonte sulla membrana laterale dei tessuti ectodermici, inclusi epidermide, ghiandole salivari, trachea e intestino posteriore, funzionalmente simile alla giunzione stretta nei tessuti vertebrati. In Drosophila sono state identificate 30 proteine necessarie per la formazione delle pSJ. Le proteine pSJ centrali sono inizialmente localizzate lungo tutta la lunghezza della membrana laterale ma si arricchiscono fortemente nella regione apicale laterale della giunzione, appena basale alla giunzione dell'aderenza, allo stadio 16 dell'embriogenesi. Alla fine della 15ª fase dell'embriogenesi, questi tessuti possiedono una giunzione occlusonte completamente funzionante. Questo articolo descriverà i protocolli di immunocolorazione e permeabilità dei coloranti che possono essere utilizzati per esaminare l'organizzazione e la funzione delle pSJ negli embrioni di controllo e mutanti. L'impiego efficace di questi protocolli può essere utilizzato per dimostrare la funzione di occlusione delle pSJ e per testare se un gene sconosciuto codifica per una componente centrale della giunzione.

Introduzione

Una funzione fondamentale dei tessuti epiteliali è compartimentalizzare regioni distinte all'interno di un organismo. La creazione di questi ambienti distinti è essenziale per il funzionamento degli organi e per proteggere l'organismo dalle minacce esterne. La giunzione occlusonte formata tra le cellule di un epitelio è responsabile dell'istituzione e del mantenimento di questi ambienti impedendo il flusso paracellulare di soluti tra i lati apicale e basale di quell'epitelio ^1,2. Negli organismi vertebrati, la giunzione occluente è chiamata giunzione stretta, mentre negli invertebrati come Drosophila melanogaster ^1,3 è chiamata giunzione del setto (SJ). Negli artropodi esistono due tipi di SJ, distinti per la loro distribuzione tissutale e per l'ultrastruttura⁴. Le giunzioni del setto piegato (pSJ) si trovano nei tessuti di origine ectodermica come l'epidermide, le ghiandole salivari, la trachea e l'intestino posteriore. Sono caratterizzati in modo ultrastrutturale da una matrice a scala di materiale denso di elettroni nello spazio extracellulare tra le cellule, che si trova appena alla base della giunzione^{aderente 3,5}. Al contrario, le giunzioni del setto liscio (sSJ) si trovano nei tessuti derivati dall'endodermia come i tubi dell'intestino medio e di Malpighi e non mostrano setti densi di elettroni tra^{le cellule 6}.

Studi genetici su Drosophila hanno identificato 30 proteine necessarie per la struttura e funzione del pSJ e hanno individuato proteine aggiuntive che risiedono nella giunzione ma che non sembrano avere alcuna funzione nel loro stabilimento o mantenimento (revisionato in⁷). Da queste analisi, gli scienziati hanno suddiviso le proteine SJ in tre classi. Le proteine SJ core risiedono nella giunzione e sono necessarie per l'istituzione e il mantenimento della giunzione. Sono state identificate diciassette proteine come proteine Core pSJ, tra cui Coracle (Cora), Neurexin IV, complemento macroglobulinico correlato (Mcr), Kune-kune e ATPasi alfa 8,9,10,11,12. Nove proteine sono state identificate come proteine pSJ accessorie necessarie per l'istituzione e/o il mantenimento della giunzione, ma che non necessariamente risiedono nella giunzione. Questa classe include proteine come Rab5, Rab11 e Coiled^13,14. Infine, le proteine residenti della pSJ si localizzano nella pSJ ma sono dispensabili per l'istituzione e il mantenimento della giunzione. Esempi dei quattro membri di questo gruppo includono Discs Large e Fasciclin^{III 15,16}.

L'istituzione di una pSJ funzionalmente intatta è un processo a più fasi che inizia a metà dell'embriogenesi, quando tutte le proteine pSJ principali sono completamente espresse. Alcuni geni principali del pSJ sono espressi maternamente, ma tutti mostrano una forte espressione zigotica tra gli stadi 12 e¹⁷. Allo stadio 12, le proteine pSJ centrali si localizzano lungo tutta la lunghezza della membrana laterale. Durante le fasi 13-16, le proteine core pSJ vengono endocitate e poi riciclate nella membrana laterale nella regione del pSJ. Questo processo richiede proteine accessorie pSJ, inclusi Rab5 e^Rab11-14. Alla sedicesima fase, le proteine centrali pSJ sono strettamente localizzate nella regione della pSJ lungo la membrana laterale. In linea con queste osservazioni, la funzione di occlusione completa della giunzione si verifica nella fase finale 15^{dell'embriogenesi 12}. Questo si dimostra al meglio utilizzando un saggio di permeabilità al colorante. Prima della formazione della giunzione, una sfera di dextrano da 10 kDa etichettata con un marcatore fluorescente come la rodamina può attraversare lo spazio paracellulare tra le cellule. Se il destrono marcato viene iniettato nell'emocelo, si accumula rapidamente nel lume degli epiteli tubolari come la trachea, la ghiandola salivare e l'intestino posteriore. Dopo che il pSJ è fisiologicamente teso alla fine dello stadio 15, il destrano iniettato è limitato al lato basale dell'epitelio e non può accumularsi nel lumen (dominio apicale) di questi organi.

Le proteine core pSJ condividono una caratteristica in cui ogni proteina core pSJ richiede la presenza di tutte le altre proteine core pSJ per una corretta localizzazione^{subcellulare 18,19}. Questa interdipendenza nella formazione della pSJ è una caratteristica distintiva delle proteine core della pSJ e sta alla base dei protocolli presentati in questo articolo. Le mutazioni nei geni pSJ core o accessori portano a letalità embrionale e sono caratterizzate dalla dislocalizzazione di altre proteine pSJ core lungo la membrana laterale negli embrioni dello stadio 16, piuttosto che essere localizzate strettamente nella loro normale regione apicale laterale. Al contrario, le mutazioni nei geni residenti nel pSJ non portano a una localizzazione errata delle proteine core del^{pSJ 15}. La rottura funzionale del pSJ nelle mutazioni del gene pSJ al nucleo e accessorio è rivelata dall'accumulo di destrano marcato a 10 kDa nel lume della trachea, delle ghiandole salivari o dell'intestino posteriore negli embrioni mutanti di stadio 16 o 17. Infine, la caratteristica distintiva tra una proteina pSJ a nucleo e una proteina accessoria è la loro localizzazione subcellulare. Le proteine pSJ core sono strettamente associate al pSJ una volta formate, mentre le proteine pSJ accessorie sono fondamentali per l'assemblaggio della giunzione ma non necessariamente risiedono nella giunzione. I migliori esempi di proteine pSJ accessorie sono Rab5 e Rab11. Entrambe sono proteine citoplasmatiche che aiutano a trasportare il carico dalla membrana plasmatica verso la prima e a riciclare endosomi e poi tornare alla membrana^{plasmatica 14}. Per distinguere se una nuova potenziale proteina pSJ sia un componente centrale o una proteina accessoria, generalmente è utile creare un anticorpo specifico o esprimere una proteina ricombinante marcata fluorescentmente per determinare dove queste proteine si localizzano in vari punti del processo di maturazione del pSJ.

Lo scopo di questi protocolli è distinguere in modo inequivocabile le potenziali proteine core e accessorie pSJ dalle proteine residenti in pSJ. Diversi studi hanno rivelato ruoli aggiuntivi non occlusivi per le proteine pSJ durante lo sviluppo, inclusi ruoli nella morfogenesi e nella polarità^{apicale-basale} 17,20,21,22. Con l'aumento dell'interesse per la biologia del pSJ e l'identificazione di nuove potenziali proteine pSJ, i protocolli semplici e facilmente interpretabili presentati qui aiuteranno i ricercatori a caratterizzare correttamente l'organizzazione del pSJ e le funzioni di occlusione di queste proteine. In letteratura sono stati descritti molti altri approcci sperimentali per caratterizzare le proteine pSJ, tra cui il Recupero a Fluorescenza Dopo Fotosbiancamento (FRAP) e la microscopia elettronica^{a trasmissione 6,23}. Sebbene questi approcci siano spesso molto utili, il saggio di immunocolorazione presentato qui fornisce una visualizzazione rapida della localizzazione della proteina pSJ senza metodi ultrastrutturali costosi e lunghi e dispendiosi, mentre il saggio sulla permeabilità del colorante offre una lettura funzionale dell'integrità del pSJ non raggiungibile solo con l'imaging. Inoltre, questi saghi possono essere eseguiti utilizzando apparecchiature standard di laboratorio come un microscopio a fluorescenza di buona qualità e un sistema di microiniezione rudimentale. Va notato che questi saghi sono ottimizzati per l'analisi degli embrioni di Drosophila stadio 16 e non sono appropriati per valutare l'organizzazione o la funzione degli sSJ.

Protocollo

1. Stastadiazione degli embrioni

1. Incrocia mosche maschio e femmina sani con i genotipi appropriati (vedi Tabella dei materiali per esempi) e collocale in gabbie di raccolta embrionale con piastre di succo di mela fresco spalmate con pasta di lievito. Lascia che le mosche si abituino alle gabbie per la raccolta delle uova per uno o due giorni prima di iniziare la raccolta degli embrioni.
2. Raccogli gli embrioni su piatti di succo di mela e lasciali sviluppare fino allo stadio 16 (~13 ore dopo la deposizione delle uova (AEL) fino a 16 ore di AEL a 25 °C). Lasciare che gli adulti depongano uova fecondate per 1-2 ore su piatti di succo di mela, rimuovere il piatto dalla gabbia di raccolta delle uova e poi invecchiarli a 13-16 AEL a 25 °C. In alternativa, si prelevano gli embrioni durante la notte a 25 °C e poi si selezionano gli embrioni di stadio 16 prima della fissazione o durante l'imaging dopo fissazione e immunocolorazione.
   NOTA: La stadiazione embrionale può essere valutata tramite morfologia intestinale, che è più facilmente visualizzata dall'autofluorescenza nello spettro UV (cioè canale DAPI). Negli embrioni di stadio 16, l'intestino appare come tre ovali paralleli e lunghi perpendicolari all'asse lungo del corpo (Figura 1H).

2. Fissazione e immunocolorazione degli embrioni

1. Assembla un cesto per la raccolta degli embrioni con una rete di nylon (rete da 120 mm). Copri l'apertura e la filettatura del cestello con la rete di nylon, poi avvita il tappo.
2. Spostare delicatamente gli embrioni dal piatto di succo di mela con un pennello e una soluzione per il lavaggio degli embrioni. Versare il composto per embrioni nel cesto di raccolta embrionale e sciacquare gli embrioni con acqua distillata.
   NOTA: Fai attenzione a indirizzare l'acqua all'interno del cesto di raccolta embrioni ed evita di schizzare gli embrioni sui lati del cestello, che potrebbero causare perdita embrionale dovuta all'adesione.
3. Decoriiona gli embrioni immergendo il cestino di raccolta embrionale e gli embrioni in una vassoia contenente il 50% di candeggina commerciale (concentrazione finale del 3,75% di ipoclorito di sodio). Mescolate gli embrioni nella candeggina e lasciateli immersi per 3-5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovi il cesto dalla candeggina e risciacqua gli embrioni con acqua distillata, indirizzando ancora una volta il flusso d'acqua all'interno del cestello.
4. Prepara una fiala di fissazione aggiungendo volumi uguali di soluzione fresca al 4% di paraformaldeide e eptano a una fiala di scintillazione da 20 mL. Produrre la soluzione di paraformaldeide dissolvendo la quantità appropriata di paraformaldeide in soluzione salina calda (~90 °C) tamponata con fosfato (PBS) in una cappa chimica. Per accelerare il processo di scioglimento, aggiungere 10 μL di idrossido di sodio a 14 N (per 10 mL di PBS) al fissaggio fino a quando il formaldeide non entra in soluzione, poi aggiungere 10 μL di acido cloridrico a 14 N per riportare il pH a neutro.
   ATTENZIONE: Indossa sempre camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti quando manipoli paraformaldeide ed eptano, e usa solo sotto una cappa chimica. Il paraformaldeide è un cancerogeno ed è corrosivo, mentre l'eptano è altamente infiammabile e irritante per la pelle e gli occhi.
5. Smontare il cesto di raccolta degli embrioni e immergere la rete di nylon con embrioni decorionati nell'eptano. Gli embrioni si staccano dal nylon e si depositano all'interfaccia tra l'eptano (strato superiore) e il fisso (strato inferiore). Fissa gli embrioni scuotendo la fiala di fissazione su un agitatore a piattaforma a 240 giri al minuto (RPM) per 20 minuti.
6. Rimuovi il fissaggio dalla fiala di fissazione con una pipetta Pasteur in una cappa chimica. Smalti la soluzione in un contenitore approvato per rifiuti chimici pericolosi. Aggiungi un volume uguale di metanolo, chiudi la camera di fissazione e scuoti vigorosamente la camera per 5-10 secondi. Gli embrioni fissati si stacceranno dall'involucro vitellino e affonderanno sul fondo del metanolo (strato inferiore). Gli inviluppi vitellini e qualsiasi embrione che non è riuscito a staccarsi dall'involucro vitellina rimarranno all'interfaccia e saranno rimossi nel passo 2.7.
   ATTENZIONE: Indossa sempre camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti quando manipoli metanolo, poiché è tossico e infiammabile.
7. Rimuovere l'eptano con una pipetta Pasteur e gettalo in un contenitore approvato per rifiuti chimici pericolosi. Poi, rimuovere la maggior parte del metanolo, lasciando gli embrioni in una piccola piscina di metanolo, e gettare il metanolo nei rifiuti chimici pericolosi. Aggiungi 5 mL di metanolo, fai roteare gli embrioni e lasciali sedimentare. Rimuovi di nuovo la maggior parte del metanolo e ripeti questo processo altre 2 volte.
8. Trasferire gli embrioni nel metanolo in un tubo di coltura di vetro da 0,8 mL. Rimuovi il metanolo e aggiungi 750 mL di soluzione blocca (PBS più 1% di siero normale e 0,1% di Triton X-100). Lava gli embrioni 3 volte in PBS, poi incubali in soluzione a blocchi per 30 minuti a temperatura ambiente, mescolando delicatamente su un dondolo a piattaforma.
9. Risciacquare ancora una volta gli embrioni con PBS e poi aggiungere blocchi più anticorpi primari. Usa anticorpi contro una proteina centrale pSJ (ad esempio, Coracle) e una proteina di giunzione aderente (ad esempio, E cadherina). Incubare gli embrioni nell'anticorpo primario durante la notte a 4 °C o per 3-4 ore a temperatura ambiente, con una miscelazione delicata su un oscillatore a piattaforma.
10. Rimuovere il blocco con anticorpi primari e risciacquare gli embrioni tre volte con PBS. Aggiungi Block e lava gli embrioni per 30 minuti a temperatura ambiente su un dondolo a piattaforma.
11. Risciacquare ancora una volta gli embrioni in PBS, poi aggiungere la soluzione bloccante e gli anticorpi secondari marcati fluorescenti specifici per gli anticorpi primari usati nel passo 2.9. Incubare gli embrioni a temperatura ambiente per 3-4 ore o durante la notte a 4 °C.
12. Rimuovere il blocco con anticorpi secondari e risciacquare gli embrioni tre volte con PBS. Aggiungi Block e lava gli embrioni per 30 minuti a temperatura ambiente su un dondolo a piattaforma.
13. Risciacquare nuovamente gli embrioni in PBS, poi trasferirli su un vetrito al microscopio usando una pipetta Pasteur. Svuota l'eccesso di PBS usando piccole strisce di carta Whatman, facendo attenzione a non toccare gli embrioni. Coprire gli embrioni con substrati di montaggio (disponibili in commercio o realizzati al 90% di glicerolo, 10% di 1 M Tris, pH 8,0, con 0,5% di n-propile gallato come agente antisbiadente). Copri con un vetro numero 1.5 di dimensioni appropriate e sigilla i bordi con lo smalto.

3. Imaging e analisi dei dati di embrioni immunocolorati

1. Per ottenere i migliori risultati, immagini gli embrioni con un microscopio confocale con un obiettivo di immersione in olio 40x. Usa embrioni di controllo per impostare l'intensità e il guadagno laser sul confocale per ottenere un segnale fluorescente forte senza sovrasaturare i pixel. Identificare gli embrioni di scelta dello stadio 16 (cioè quelli che non esprimono GFP codificata nel bilanciatore per identificare embrioni mutanti) utilizzando la morfologia dell'intestino medio. Focalizzare la scansione sulla ghiandola salivari o sull'intestino posteriore, poiché questi organi sono polarizzati e hanno lunghe membrane laterali ideali per distinguere la giunzione dell'aderente, il pSJ e la superficie laterale residua. Immagine in posizione z che includerà il diametro più grande possibile del lume della ghiandola salivari o dell'intestino posteriore per osservare la membrana laterale completa della cellula epiteliale.
   NOTA: L'esempio mostrato nella Figura 1C è stato svolto con un microscopio confocale con una lente a immersione in olio HC PL APO 40x/1.3 CS2 con un'intensità laser di 1,59 e un guadagno di 3,3 per il laser a 561 nm, un'intensità laser di 2,0 e un guadagno di 21,7 per il laser a 638 nm (vedi Tabella dei Materiali).
2. Immagini un tessuto polarizzato in almeno 20 embrioni di controllo e mutanti allo stadio 16. Registrano solo dati da embrioni in cui il marcatore di giunzione aderente è strettamente localizzato nella regione laterale apicale della membrana per garantire che l'embrione sia fissato e colorato correttamente. Successivamente, registra la distribuzione del marcatore pSJ lungo la membrana laterale. Negli embrioni wildtype stadio 16, si cerca un forte arricchimento delle proteine pSJ lungo il ~10-15% della membrana laterale appena basale alla giunzione dell'adesione.
   NOTA: La dislocalizzazione anche del 10-20% della proteina pSJ lungo tutta la membrana laterale è diagnostica per un difetto di organizzazione della pSJ. I difetti di organizzazione pSJ sono fortemente penetranti in tutti gli embrioni mutanti pSJ al nucleo e accessori, quindi dovresti aspettarti di vedere il 75-100% degli embrioni mutanti mostrare una proteina pSJ chiaramente inlocalizzata.

4. Preparazione per l'iniezione di colorante

1. Produrre una soluzione di colorante fresca dissolvendo 10 kDa di Destrono marcato con rodamina a 1 mg/mL in 0,5 M fosfato di sodio, pH 7,5 e 5 mM di cloruro di potassio.
2. Tira un tubo capillare (1,0 mm di diametro esterno x 0,5 mm diametro diametrale con fibra) in un ago di vetro usando un estratore.
   NOTA: Gli estraezioni per aghi sono idiosincratici e le impostazioni per gli aghi ideali spesso cambiano di giorno in giorno. Gli aghi buoni hanno un conico graduale fino a una punta affilata e dovrebbero collocarsi tra le forme mostrate nella Figura 2A. L'ago a sinistra è più lungo e può piegarsi mentre viene spinto nell'embrione. Questo può essere corretto rompendo di nuovo l'ago più lontano dalla punta. L'ago a destra è buono ma avrà un diametro maggiore quando inizialmente si rompe e può spingere troppo liquido nell'embrione. Se succede, cambia con un ago nuovo con una punta più fine. È meglio tirare più aghi contemporaneamente quando le condizioni del tiratore creano aghi della forma corretta. Gli aghi in eccesso possono essere conservati in un contenitore chiuso con un pezzo di schiuma o nastro adesivo per fissare gli aghi in modo indipendente.
3. Carica l'ago nel portaago di un micromanipolatore. Posizionare il micromanipolatore accanto a un microscopio rovesciato (Figura 2F). Orienta l'ago il più possibile parallelo al vetrino del microscopio e abbassalo in modo che sia nello stesso piano z del lato del vetrino.
4. Rompi la punta dell'ago colpendo il lato del vetrino del microscopio. Alza l'ago sopra il livello della slide e rimuovilo per il caricamento.
5. Riempi il tubo capillare con il colorante usando la punta più piccola disponibile (punta P2 o P10) oppure per azione capillare posizionando la parte posteriore dell'ago in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL insieme al colorante.
6. Ricarica l'ago riempito nel portaago e testa il flusso del destrano iniettando un bit in una goccia di olio di alocarburi sulla superficie di un vetrino al microscopio.
   NOTA: Un ago ben rotto non perderà senza aggiungere pressione, e la velocità di flusso può essere regolata in base alla pressione applicata allo stantuffo della siringa.

5. Montaggio degli embrioni e iniezione di colorante

1. Seleziona embrioni di stadio 16 o 17 (controllo e mutante) usando la morfologia dell'intestino medio come marcatore di stadio.
2. Crea una linea incavata su un piatto di succo di mela usando un coperto di spessore 22 x 22 #2. Allineare circa 25 embrioni stadiati sul piatto di succo di mela con le estremità posteriori a contatto con la linea e la superficie ventrale rivolta verso l'alto.
3. Applica un pezzo di nastro adesivo a doppia faccia su un coperto #2 di 22 x 22. Tocca il nastro sulla linea dell'embrione e strofina leggermente il coperto per spostare gli embrioni dalla piastra al nastro bifronte sul copertino (Figura 2B).
4. Attacca il copertino a un vetrino al microscopio aggiungendo una goccia di olio di alocarburi al vetrino e usando l'azione capillare per creare un legame. Orienta il sottocoperta più vicino al lato del slide opposto a qualsiasi parte svincata. Essiccare gli embrioni per 3-5 minuti in un contenitore di essiccante o in aria su un banco di laboratorio per 10-15 minuti (Figura 2C-E). Copri completamente gli embrioni con olio di alocarburi.
   NOTA: Gli embrioni saranno leggermente meno turgidi dopo la disidratazione, ma non saranno fortemente flaccidi. Gli embrioni mostrati nella Figura 2E sono stati lasciati ad asciugare all'aria per 15 minuti in una stanza con umidità relativa del 42% a 21,2 °C.
5. Monta il vetrino con gli embrioni sul microscopio rovesciato con gli embrioni rivolti verso l'alto (lontano dall'obiettivo). Allineare il micromanipolatore in modo che l'ago sia rivolto verso l'estremità posteriore degli embrioni con un angolo il più possibile parallelo agli embrioni (Figura 2G). Regolare l'asse z del micromanipolatore in modo che la punta dell'ago sia allineata al punto medio dell'embrione (lungo l'asse dorsale-ventrale).
6. Iniettare gli embrioni spostando rapidamente la fase nell'ago in modo che la punta dell'ago entri nell'emocoello dell'embrione. Iniettare una piccola quantità di colorante (~0,2-0,5 nL) usando una siringa da 10, 25 o 50 mL. Ritira rapidamente l'ago, sposta lo stadio all'embrione successivo e ripeti il processo. Iniettare quanti più embrioni possibile in 10 minuti.
   NOTA: È importante che l'ago venga inserito circa al 25% dell'interno dell'embrione, così che il colorante non venga iniettato direttamente nello spazio perivitellino, che è continuo con il lume dell'intestino anteriore e posteriore. Il colorante iniettato dovrebbe sembrare "gonfiare" l'embrione, facendolo apparire più turgido. L'eccessiva iniezione causerà una bolla di colorante più emolinfa che esce dal sito di iniezione e va evitata.
7. Aggiungi ulteriore olio di halocarbonio e copri gli embrioni con un copertino 22 x 22 #2. L'olio aggiuntivo di alocarburi forma uno strato più uniforme tra le due coperture, impedendo agli embrioni di essere schiacciati.

6. Imaging e analisi dei dati

1. Esegui immagini sia con un microscopio composto fluorescente che su un microscopio confocale (10x o 20x obiettivi d'aria sono sufficienti per ottenere risultati inequivocabili). Sul confocale, l'imaging a pila z attraverso circa un quarto della profondità (lungo l'asse ventrale dorsale) dell'embrione rivelerà se il dextrano marcato è entrato nel lumen della trachea e dell'intestino posteriore (è necessario reorientare gli embrioni con la superficie ventrale in alto per vedere le ghiandole salivari).
   NOTA: Gli esempi mostrati nella Figura 3 sono stati realizzati con un microscopio confocale con una lente secca HC PL APO 10x/0.4 CS2 con un'intensità laser di 2.0 e un guadagno di 13.6 per il laser a 561 nm. Sono state ottenute fette a 24 z con una dimensione di passo z di 2,4 nm (vedi la Tabella dei Materiali).
2. Lasciare che l'embrione iniettato invecchi per 10 minuti e poi esaminare il lumen della trachea, della ghiandola salivari o dell'intestino posteriore per l'accumulo del dextrano marcato. Registrare il genotipo e lo stadio di ciascun embrione e verificare se vi è accumulo di destrano marcato in qualche organo tubolare. Si noti anche embrioni in cui lo spazio perivitellino è fortemente colorato con colorante, poiché questi potrebbero rappresentare embrioni iniettati involontariamente in quello spazio.

Risultati

I protocolli qui presentati sono utilizzati per indagare l'organizzazione e la funzione delle pSJ nei tessuti ectodermici negli embrioni di Drosophila al stadio 16. Questi protocolli sono applicabili solo ai pSJ e non possono essere usati per interrogare gli sSJ. Una mutazione in un gene che comporta il fallimento nel localizzare altre proteine pSJ nella regione pSJ negli embrioni dello stadio 16 e nella creazione di una giunzione occlusovente allo stadio 16 si trova o in un gene pSJ cor...

Discussione

Qui presentiamo un protocollo per identificare le proteine pSJ core e accessorie utilizzando due saggi relativamente semplici che possono essere realizzati in laboratori modestamente dotati di capacità di microscopia a fluorescenza. Il primo saggio esamina l'organizzazione molecolare della pSJ negli epiteli polarizzati maturi utilizzando immagini confocali di embrioni mutanti fissi. Il secondo saggio verifica l'integrità della funzione di occlusura del pSJ iniettando molecole di destrano...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubo capillare per aghi (Boro 1 X 0,5/Fibra)	FHC	30-30-1
Microscopio confocale	Leica	Stellaris 5
Copri il vetro con spessore 22 x 22 2 per le iniezioni	Fisher Scientific	12-540-B
Vetro di copertura 22 x 30 spessore 1,5 per l'imaging	Corning	2980-233
Tubo di coltura per immunocolorazione (6 x 50 mm)	Fisher Scientific	14-958-A
Gabbia di raccolta embrioni	Genesee Scientific	59-100
Stereomicroscopio a fluorescenza	Leica	MZ10 F
Olio alocarbonio (700)	Genesee Scientific	59-131
Eptano	Fisher Scientific	H350-4
Microscopio a fluorescenza invertita	Leica	DMi8
Cestini a rete per embrioni in decorazione	Genesee Scientific	46-101
Metanolo	Fisher Scientific	A412-4
Micromanipolatore	Narishige	MN151
Vedute per microscopio	Fisher Scientific	12-544-2
Estrazione di ago	Strumenti David Kopf	Modello 720
Siero Normale per Asino	Jackson ImmunoReseaerch	017-000-121
Rete di nylon (120 um)	Genesee Scientific	57-102
Obiettivo HC PL FLUOTR 10X/0.32 PH 1	Leica	11506537
Obiettivo HC PL APO 10x/0.40 CS2	Leica	15506407
Obiettivo HC PL APO 40x/1.30 CS2	Leica	15506358
Piastre di Petri 60 x 15 mm	Corning	351007
Oscillatore a piattaforma	Globe Scientific	GTR-FS
Anticorpo primario (Coracle)	DSHB	C566.9
Anticorpo primario (Coracle)	DSHB	C615.16
Anticorpo primario (E. cadherina)	DSHB	DCAD2
Anticorpi primari (Mcr)	Laboratorio Ward, CWRU	Policlonale porcellino d'India
Rodamina etichettata come destrono da 10 kDa	Sonde molecolari	D1824
Anticorpo secondario (anti-cavia asino Cy3)	Jackson ImmunoReseaerch	706-165-148
Anticorpo secondario (anti-topo Cy2 per l'asino)	Jackson ImmunoReseaerch	715-225-151
Anticorpo secondario (anti-ratto Cy5)	Jackson ImmunoReseaerch	712-175-150
Shaker da tavolo	New Brunswick Scientific	Oscillatore piattaforma C2
Tegosept (metil 4-idrossibenzoato)	TCI	H0216
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151500
Fiale per la fissazione (20 ml di fiale di scintillazione liquida WHEATON)	Fisher Scientific	03-341-73C
Whatman 3MM  Articolo sulla cromatografia	Fisher Scientific	05-716-6H
Scorte mosche	Genotipo completo	numero di stagli	Fonte
cor4	w*; P{neoFRT}43D cora4/CyO	52232	BDSC
W1118	w[1118]	5905	BDSC
Soluzione	Ricetta
10x PBS	Mescola 90 g di NaCl, 20 g di Na2HPO4 e 8,3 g di NaH2PO4.H2O e dH20 a 1L. Sterilizza con il filtro. Diluire a 1X con dH2O per le fasi di lavaggio nell'immunocolorazione.
Soluzione Triton X-100 al 10%	Mescola 1 ml di Triton X-100 a 9 ml di dH2O su un oscillatore a piattaforma fino allo scioglimento. Conserva a temperatura ambiente.
50% candeggina	Mescola 10 ml di candeggina commerciale (7,5% ipoclorito di sodio) con 10 ml d'acqua prima di decorionizzare gli embrioni.
Piatti di succo di mela	Bolli 15 g di agar Drosophila in 725 ml dH2O. Aggiungi 25 g di zucchero e 250 ml di succo di mela e mescola fino a quando non si frulla. Lascia raffreddare la soluzione a 55°C, poi aggiungi 1,3 g di tegosept e mescola delicatamente. Versa in piastre di Petri da 60 x 15 e lascia raffreddare. Conserva a 4°C.
Soluzione bloccante	Mescola 9,8 ml di 1X PBS con 100 ul di Triton X-100 al 10% e 100 ul di Siero Normale per Asino in un tubo conico da 15 conici.
Soluzione di lavaggio embrionale	Prepara 10 volte la soluzione di lavaggio embrionale mescolando 70 g di NaCl e 2 ml di Triton X-100 a 1L di dH2O. Diluire a 1X con dH2O per la soluzione funzionante.
Fissaggio	Preriscalda 10 ml di 1X PBS nel microonde. Aggiungi 0,4 g  di paraformaldeide e pipetta da mescolare. Aggiungi 10 ul di NaOH 14N alla dissoluzione veloce. Mettilo su un blocco riscaldante a 90°C fino alla dissoluzione. Quando non resta più paraformaldeide solido, aggiungi 10 ul di 14N HCL per regolare il pH a neutro. Indossa sempre camice da laboratorio, guanti e gocce quando usi il paraformaldeide.
Supporti di montaggio	Mescola 9 ml di glicerolo e 1 ml di 1M Tris base pH 8.0. Aggiungi 0,05 g di n-propil-gallato,   Mescola e riscalda per sciogliere. Aliquota 0,5 ml in tubi di Eppendorf.
Soluzione di rodamina dextrano	Produrre una soluzione di colorante fresca sciogliendo il Ddestrano 10 kDa marcato con Rhodamina a 1 mg/ml in 0,5M fosfato di sodio, pH 7,5 e 5 mM di cloruro di potassio.
Pasta di lievito	Mescola 50 g di lievito commerciale (Red Star) con un pizzico di saccarosio e abbastanza acqua per ottenere una pasta densa. Conserva a 4°C.