Articolo metodologico

Visualizzazione in tempo reale dell'impatto dei mezzi nutritivi sullo sviluppo di biofilm di Pseudomonas aeruginosa utilizzando un sistema microfluidico

DOI:

10.3791/69997

⸱

15 maggio 2026

 ,  , 
1School of Mechanical, Aerospace and Civil Engineering, University of Sheffield, 2School of Chemical, Materials and Biological Engineering, University of Sheffield

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo valuta l'influenza delle composizioni di mezzi nutrienti ricchi (TSB) e minimi (FAB) sullo sviluppo dei biofilm di Pseudomonas aeruginosa PAO1 e PA14 in un ambiente di flusso a regime stazionario in un microcanale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il batterio patogeno Pseudomonas aeruginosa è una causa principale di numerose infezioni nosocomiali, e la sua crescente resistenza antimicrobica ne ha rappresentato una minaccia significativa per la salute pubblica. Questo articolo presenta un protocollo completo che dettaglia l'uso di un sistema microfluidico per la visualizzazione e quantificazione in tempo reale dello sviluppo di biofilm in due ceppi chiave di P. aeruginosa , PAO1 e PA14. Il metodo impiega piastre microcanale multicanale otticamente trasparenti per sottoporre le colture batteriche a un flusso continuo e costante di mezzi, incluso il brodo di soia triptico (TSB) o il brodo anaerobico minimo e rigoroso modificato (FAB) con diverse concentrazioni di carbonio, imitando così le condizioni presenti negli ambienti clinici. In un periodo di 24 ore, l'imaging automatizzato in tempo reale cattura la crescita e la maturazione dei biofilm sotto forma di copertura superficiale, spessore e rugosità superficiale del biofilm in modo altamente riproducibile. L'obiettivo sperimentale è utilizzare i risultati per dimostrare che la formazione di biofilm per entrambi i ceppi è significativamente influenzata dai cambiamenti nella composizione dei mezzi nutritivi. L'obiettivo di questo protocollo visualizzato è fornire un metodo per i ricercatori per studiare la dinamica dei biofilm in condizioni di flusso laminare stazionare, e le intuizioni acquisite potrebbero essere sfruttate per sviluppare strategie alternative non antimicrobiche per eradicare i biofilm di P. aeruginosa in stadio iniziale in contesti nosocomiali.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'obiettivo di questo metodo è osservare l'impatto di due diversi mezzi di coltura, cioè il brodo di soia triptico (TSB) e il brodo anaerobico minimo e rigoroso modificato (FAB), sulla crescita del biofilm di due ceppi di Pseudomonas aeruginosa , ovvero PAO1 e PA14. Sebbene P. aeruginosa PAO1 e PA14 siano entrambe ceppi di riferimento comuni in laboratorio, il ceppo PA14 infetta una proporzione maggiore di ospiti, dalle piante agliinvertebrati 1. Il brodo nutritivo TSB è un mezzo di coltura a uso generale con 2,5 g/L di glucosio come fonte di carbonio ed è in grado di coltivare una vasta gamma di batteri grazie alla sua composizione di caseina e peptoni di soia per azoto organico e una fonte naturale di zucchero, oltre al cloruro di sodio per mantenere l'equilibrioosmotico 2. Il mezzo FAB minimo, al contrario, è formulato con concentrazioni minime (riduzione di 50 volte) di una singola fonte di carbonio, a livelli di 0,05 g/L per esplorare i requisiti di crescita dei batteri anaerobi. Sia le deformazioni PAO1 che PA14 sono state esposte a flusso laminare unidirezionale, risultando in una bassa tensione di taglio muro di 0,01 Pa. Questo valore di sforzo di taglio è spesso presente nelle località colonizzate da P. aeruginosa, inclusi i bronchi dei pazienti con fibrosi cistica e il tratto gastrointestinale. La crescita del biofilm è stata misurata in un periodo di 24 ore valutando in tempo reale la copertura percentuale dell'area superficiale del biofilm, lo spessore e la media aritmetica della rugosità superficiale.

I biofilm di P. aeruginosa sono responsabili di una percentuale significativa delle infezioni nosocomiali e rappresentano una delle principali cause di morte per le persone con fibrosicistica 3,4,5. Indagini precedenti sull'impatto dei livelli delle sorgenti di carbonio sullo sviluppo del biofilm batterico hanno trascurato il ruolo critico del flusso idrodinamico durante lo sviluppo del biofilm, utilizzato valori di sforzo di taglio che non rappresentano i siti di infezione da P. aeruginosa, o hanno effettuato solo analisi cinetiche e morfologiche del biofilm dopol'esperimento 6,7. Queste limitazioni vengono affrontate in questo metodo utilizzando immagini in tempo reale dello sviluppo di biofilm, in condizioni di flusso stazionario all'interno di un canale microfluidico che replica fedelmente gli ambienti fisiologici riscontrati nei pazienti con fibrosi cistica.

Questo metodo offre vantaggi significativi rispetto alle tecniche alternative utilizzate per studiare lo sviluppo dei biofilm. L'applicazione dell'imaging in tempo reale durante il periodo di crescita del biofilm di 24 ore garantisce che il biofilm in sviluppo sia indisturbato, poiché non sono necessarie essiccazioni o alterazioni chimiche, evitando cambiamenti nella sua composizione e producendo risultati più rappresentativi rispetto ai metodi che richiedono la manipolazione delcampione 8. Inoltre, applicando condizioni di flusso idrodinamico costante e variando le concentrazioni delle fonti di carbonio su una grande magnitude, questa procedura replica in modo più accurato gli ambienti fisiologici presenti nei siti delle infezioni nosocomiali da P. aeruginosa. Questo lo rende un metodo più rappresentativo rispetto a quelli che utilizzano sami statici, come le piastre microtitolate a 96 pozzi o i coupon, che non riescono a catturare l'impatto critico del flusso di fluidi sullo sviluppo del biofilm 9,10,11.

Il dispositivo microfluidico impiegato è stato scelto specificamente perché le sue dimensioni sono simili a quelle di alcune parti del polmone, come bronchioli ebronchi 12. Inoltre, le infezioni da P. aeruginosa rappresentano una preoccupazione importante per i pazienti con gravi ustioni, dove i livelli di glucosio possono variare significativamente rispetto al normale delpaziente 13,14.

Sebbene questo protocollo utilizzi specificamente due ceppi di P. aeruginosa, il metodo è applicabile anche alle indagini sullo sviluppo iniziale di altri batteri che causano infezioni o colonizzano aree in condizioni simili. Inoltre, altre composizioni di mezzi nutritivi così come condizioni di flusso (ad esempio, flussi pulsatili e oscillanti, o valori di taglio delle pareti più alti) potrebbero essere studiate utilizzando la stessa metodologia.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pulizia della vetreria

  1. Immergere due bottiglie di vetro da 200 mL da utilizzare come substrati e agar, e tre bottiglie di vetro da 1 L in un bagno di acido cloridrico al 10% (HCl) per circa 5 minuti a temperatura ambiente.
    ATTENZIONE: L'acido cloridrico è corrosivo. Esegui tutta la gestione dell'acido con una cappa chimica indossando l'attrezzatura di protezione personale appropriata (camice da laboratorio, guanti e protezione per gli occhi).
  2. Successivamente, rimuovere la vetrina dal bagno di HCl e risciacquare due volte con acqua del rubinetto e una volta con acqua distillata (dH 2O).

2. Preparazione del supporto per il brodo di soia triptico

  1. Prepara la soluzione TSB, pesa 6 g/200 mL di polvere TSB usando una pesatrice pulita e un bilanciamento di precisione.
    NOTA: La composizione della polvere di TSB utilizzata è la seguente: destrosio (2,5 g∙L-1), fosfato di dipotassio (2,5 g∙L-1), digestione pancreatica della caseina (17 g∙L-1), digestione papaica della farina di soia (3,0 g∙L-1) e cloruro di sodio (5,0 g∙L-1).
  2. Misura 200 mL didH 2Ousando un cilindro di misura e versali in una delle bottiglie di vetro già pulite.
  3. Aggiungi i 6 g di TSB nella bottiglia di vetro pulita contenente i 200 mL di dH2O, sigilla bene la bottiglia e mescola per circa 2 minuti per sciogliere la polvere, creando così il mezzo solutivo TSB.
  4. Soluzione di mezzo TSB in autoclave per 15–20 minuti a una temperatura di 121 °C e pressione di 1,5 atm, per sterilizzare la soluzione.
    NOTA: (punto di pausa) La soluzione di TSB può essere conservata a temperatura ambiente (circa 20 °C) tra un utilizzo e l'altro e l'altra e utilizzata per esperimenti futuri.

3. Preparazione accurata del brodo anaerobico

  1. Prepara la soluzione FAB media trace metal.
    1. Utilizzare barche di pesatura separate e pulite e una spatola, e una bilancia di precisione per pesare masse tra 0,5 e 210 g, e una bilancia analitica per pesare masse tra 0,001 e 0,5 g. Misurare i seguenti componenti e le loro quantità: CaSO4,2H 2O(200 mg∙L-1), FeSO4,7H 2O (200 mg∙L-1), MnSO4. H2O (20 mg∙L-1), CuSO 4,5H2O (20 mg∙L-1), ZnSO4,7H 2O (20 mg∙L-1), CoSO4,7H 2O (10 mg∙L-1), NaMoO4. H2O (10 mg∙L-1), e H3BO 3 (5 mg∙L-1)7,9.
    2. Aggiungi ciascuno dei componenti in una bottiglia di vetro pulita da 1 L contenente 1 L di dH2Oe mescola accuratamente con ildH 2O.
    3. Aggiungi 1 mL della miscela a ciascuna delle due bottiglie di vetro sterilizzato rimanenti da 1 L con 1 L di dH2Oe mescola bene.
  2. Prepara 20 mM di FAB integrato con citrato di sodio per colture notturne
    1. Misurare i seguenti componenti e le loro quantità utilizzando barche di pesatura separate e pulite e una spatola, una bilancia di precisione per la pesatura di masse tra 0,5 e 200 g e una bilancia analitica per la pesatura di masse tra 0,001 e 0,5 g: citrato di sodio (20 mM), (NH4)2SO4 (2 g∙L-1), Na2HPO 4,2H 2O (6 g∙L-1), KH2PO4 (3 g∙L-1), NaCl (3 g∙L-1), MgCl2 (93 mg∙L-1) e CaCl2 (11 mg∙L-1)7,9.
    2. Aggiungi tutti i componenti in una delle restanti bottiglie di vetro sterilizzato da 1 L contenenti 1 L di dH2O con 1 mL di soluzione di metallo traccia.
    3. Mescola bene.
  3. Prepara 0,3 mM di FAB integrato con glucosio per la crescita del biofilm.
    1. Sostituisci i 20 mM di citrato di sodio con 0,3 mM di glucosio. Usa gli stessi componenti e masse elencati nel passo 3.2.1.
    2. Nella bottiglia di vetro da 1 L pulita, aggiungi i componenti FAB da 0,3 mM di glucosio a 1 mL didH2Ocon 1 mL di soluzione di metallo in tracce e mescola bene.
  4. Autoclave per 15-20 minuti a una temperatura di vapore di 121 °C e pressione di 1,5 atm, per sterilizzare il mezzo.
    NOTA: (punto di pausa) La soluzione di medium fab può essere conservata a temperatura ambiente (circa 20 °C) tra un utilizzo e l'altro e l'altra e utilizzata per esperimenti futuri.

4. Preparazione dell'agar TSB

  1. Misura 8 g/200 mL di agar TS usando la bilancia di precisione e barche di pesa e spatola lavate.
  2. Misurare 1 g/200 mL di agar di grado batteriologico trasversare, su una barca separata per pesare, utilizzando la stessa bilancia di precisione.
  3. Utilizzando un cilindro di misura, misura 200 mL didH 2O e versali nella bottiglia di vetro finale precedentemente pulita.
  4. Versare entrambi i componenti dell'agar nei 200 mL didH 2O e mescolare bene.
  5. Autoclave per 15–20 minuti a una temperatura di 121 °C e pressione di 1,5 atm, per sterilizzare il mezzo.
    NOTA: (punto di pausa) L'agar TSB può essere conservato a temperatura ambiente (circa 20 °C) tra un utilizzo e l'altro e l'altro richiede un riscaldamento prima dell'uso in esperimenti futuri.

5. Coltivazione della piastra di Petri da Pseudomonas Aeruginosa

  1. Sciogli l'agar nel microonde per circa 5 minuti, oppure finché la soluzione non diventa liquida.
  2. Apri e disinfetta una superficie di armadio di sicurezza di classe II con soluzione di etanolo al 70%, pronta all'uso. Esegui tutti i passaggi seguenti in questa sezione all'interno di questo armadietto di sicurezza di classe II.
  3. Misura 25 mL di soluzione di agar in una fiala da 50 mL e versali in una piastra di Petri da 90 mm, e attendi che l'agar si solidifichi.
  4. Recupera i magazzini congelati di P. aeruginosa , PAO1 e PA14 dal congelatore a -80 °C. Posizionare le scorte nell'incubatore a 37 °C per circa 5 minuti, oppure finché il contenuto non si scongela completamente.
  5. Immergi il circuito di inoculazione all'interno di uno dei stock di P. aeruginosa scongelati e distribuisci il campione sull'agar.
  6. Ripetere il passo 5.5 per l'altro ceppo di P. aeruginosa , creando due colture separate di P . aeruginosa , una con il ceppo PAO1 e l'altra con il ceppo PA14.
  7. Etichettare ogni piastra di Petri con il ceppo di P. aeruginosa , la data di rinascita e le iniziali, poi metterlo in incubatore per 16–18 ore a 37 °C.
    NOTA: (PUNTO DI PAUSA) Le piastre di Petri di P. aeruginosa PAO1 e PA14 possono essere conservate a 4 °C per un periodo di conservazione fino a 4 settimane e utilizzate per esperimenti futuri.

6. Scorte di glicerolo di Pseudomonas aeruginosa PAO1 e PA14

  1. Apri e disinfetta un armadietto di sicurezza di classe II per l'uso, seleziona otto fiale da 50 mL per contenere le colture notturne.
  2. Utilizzando il TSB già fabbricato e il mezzo FAB citrato di sodio (sezione 3), versare 5 mL di mezzo TSB in quattro delle otto fiale e il medium FAB minimo di citrato di sodio nelle restanti quattro.
  3. Utilizzando le piastre di Petri precedentemente incubate e un anello di inoculazione, tocca cinque colonie separate nella piastra di Petri PAO1 di P. aeruginosa e trasferisci in una delle fiale del TSB. Ripeti questo per il mezzo FAB di citrato di sodio e per la piastra di Petri del ceppo P. aeruginosa PA14.
  4. Immergi un anello di inoculazione pulito direttamente nelle restanti quattro fiale di TSB e CITRATO di sodio per FAB media, formando i controlli.
  5. Incubare tutte e otto le fiale in un incubatore a scuotimento per 16–18 ore a 200 giri al minuto e 37 °C e etichettare chiaramente.
  6. Recupera le fiale di coltura, assicurati che quelle inoculate con P. aeruginosa siano torbide e quelle usate come controlli rimangano pulite.
  7. Centrifugare le quattro fiale inoculate con P. aeruginosa a 4000 × g per 5 minuti a 20 °C per separare P. aeruginosa dal mezzo di coltura. Assicurati che la centrifuga sia bilanciata.
  8. Ignorare il sovrantantante e risospendere la pellet di P. aeruginosa dopo la centrifugazione con 1 mL di soluzione contenente il 15% di glicerolo, con 150 μL di glicerolo e 850 μL di TSB fresco o FAB di citrato di sodio.
  9. Trasferire le colture sospese in fiale da 1 mL e inserirle nel congelatore a -80 °C.
    NOTA: (PUNTO DI PAUSA) Le scorte di glicerolo possono essere conservate a -80 °C per una conservazione a lungo termine e utilizzate per futuri esperimenti.

7. Misurazione della densità ottica delle colture notturne

  1. Ripeti i passaggi 6.1–6.5, solo per due fiale di mezzo TSB, con una come controllo e l'altra con il ceppo PAO1 P. aeruginosa .
  2. Pipettare 1 mL di mezzo TSB in una fiala da 1 mL di spettrofotometro, all'interno di un armadio di sicurezza di classe II, e trasferire 0,9 mL di mezzo TSB nella seconda fiala, integrando con 0,1 mL della coltura notturna.
  3. Imposta lo spettrofotometro a una lunghezza d'onda luminosa di 600 nm e, utilizzando la fiala dello spettrofotometro TSB da 1 mL per calibrare la macchina, misura la densità ottica della fiala disospensione 15 da 0,1 mL.
    1. Se l'assorbanza misurata non segna 0,1, ricalcola il volume di sospensione necessario.
      NOTA: Il volume di sospensione necessario per raggiungere una lettura di assorbanza di 0,1 (V1) può essere calcolato utilizzando la lettura iniziale di assorbenza della fiala della sospensione da 0,1 mL, C1, l'assorbanza desiderata a cui la sospensione viene regolata, C2, e il volume di sospensione concentrata notturna desiderato, V2:
      C1V1 = C2V2
      Nell'esempio sopra, se C1 = 3,59, C2 = 0,1 e V2 = 10 mL, il volume di sospensione notturna desiderato sarebbe 0,279 mL in una soluzione da 10 mL.
  4. Misurare 10 mL di mezzo TSB in una fiala da 50 mL e rimuovere lo stesso volume di mezzo TSB del volume di sospensione necessario per creare una sospensione da 10 mL 0,1 OD 600 nm. Utilizzando la coltura notturna, aggiungi il volume di sospensione calcolato e il vortice per circa 5 secondi per mescolare.
  5. Trasferire 1 mL della sospensione regolata da 10 mL in una fiala dello spettrofotometro e rimisurare l'assorbanza per assicurarsi che sia 0,1.
  6. Ripeti il sopra 7.1–7.5 per PA14 e il medium TSB e sia per ceppi di P. aeruginosa sia per il medium FAB di citrato di sodio.

8. Conteggio cellulare vitale

  1. TrasferiredH 2Oin una piastra di Petri quadrata all'interno di un armadio di sicurezza di classe II e utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 180 μL nelle colonne 2–9 di una piastra trasparente in polistirene a 96pozzi 16.
  2. Trasferire la sospensione 0,1 OD 600 da 10 mL in una piastra di Petri quadrata separata e, utilizzando la pipetta multicanale, trasferire 200 μL della sospensione nella colonna 1 della piastra di polistirene a 96 pozzi.
  3. Trasferire oltre 20 μL di sospensione utilizzando la pipetta multicanale dalla colonna 1 della piastra di polistirene a 96 pozzi nel canale 2, seguito dal trasferimento di 20 μL di sospensione diluita nel canale 2 al canale 3, ripetendo al canale nove, creando diluizioni della sospensione da 10-1 a 10-8.
  4. Trasferire 50 mL di agar TS (sezione 4 e passo 5.1), in un armadietto di sicurezza di classe II utilizzando una fiala, in una piastra di Petri quadrata e lasciare finché l'agar non diventa torbido.
  5. Trasferire 10 μL da ciascuno dei pozzi lungo le colonne 2–9 sulla piastra di Petri di agar TS in formazione a colonna, utilizzando una pipetta multicanale, assicurandosi che le colonne non si tocchino tra loro.
  6. Incubare l'agar TS per 24 ore a 37 °C, dopo aver atteso che le diluizioni trasferite si stabilizzino.
  7. Calcola le unità formative di colonie (CFU) per millilitro (mL) determinando se la piastra di Petri è numerabile (tra 30 e 300 colonie).
  8. Determinare il fattore di diluizione della sospensione da 10 mL utilizzata; in questo caso, la sospensione fu diluita a 1/10 (0,1 OD 600).
  9. Calcola i fattori di diluizione individuali di ciascuna colonna placcata. Questa è la quantità di sospensione diluita aggiunta a ciascuna colonna divisa per il volume totale della colonna dopo l'aggiunta della sospensione. Nel caso della colonna 2 della piastra a 96 pozzi (colonna 1 della piastra di Petri), 20 μL/200 μL = 1/10.
  10. Calcola il fattore di diluizione totale della serie moltiplicando tra loro i fattori di diluizione individuali delle colonne.
    NOTA: In questo caso, poiché 20 μL venivano trasferiti da ogni colonna alla successiva, portando il volume totale di ogni pozzo a colonna a 200 μL, ogni diluizione in serie individuale era 1/10. Rendendo la diluizione totale della serie 1 × 10-8.
  11. Determinare il fattore di diluizione della placcatura mentre la diluizione viene trasferita dalla piastra di 96 pozzi alla piastra di Petri. Per determinare CFU/mL, dividere il volume di ciascuna colonna placcata (10 μL) per 1 mL. In questo caso: figure-protocol-1.
  12. Determinare il fattore di diluizione finale moltiplicando il fattore di diluizione della sospensione originale (0,1) per il fattore di diluizione totale in serie (1 × 10-8) e il fattore di diluizione della placcatura (figure-protocol-2).
  13. Calcola la CFU∙mL-1 nel campione originale, moltiplica la CFU sulla piastra per l'inverso del fattore di diluizione finale.
    NOTA: In questo caso, se si contassero 200 CFU, ciò significherebbe effettuare 200 × 1/1 × 10-8, portando a un CFU/mL di 2 × 1010 CFU∙mL-17.

9. Configurazione del sistema microfluidico e esecuzione sperimentale

  1. Inoculare 5 mL di brodo di substrato colturale con ogni ceppo di P. aeruginosa per formare una coltura notturna e incubare per 16–18 ore a 37 °C.
  2. Configura il sistema microfluidico e il software associato.
    1. Attiva i componenti del sistema microfluidico nel seguente ordine: alimentatore, controller del sistema microfluidico, telecamera CMOS, riscaldatori dell'involucro, microscopio, computer e monitor associati.
    2. Attiva il software microfluidico e avvia l'interfaccia del modulo di controllo collegata inserendo il codice a barre multicanale 0–2 Pa a 48 pozzi associato alla piastra quando richiesto, trovato sul lato della piastra multicanale.
  3. Procedura di inoculazione a piastra multicanale con P. aeruginosa .
    1. Regolare la densità ottica della coltura notturna a 0,1 OD600.
    2. Trasferire 50 μL di sospensione 0,1 OD 600 nel pozzo di uscita di ciascuno dei sei canali in parallelo all'interno di un armadio di sicurezza di classe II.
      NOTA: Sei canali sono stati eseguiti in parallelo in ogni momento per massimizzare la probabilità di identificazione anomala del risultato.
    3. Sostituire la copertura multicanale a 48 pozzi e trasferirla sul palco mobile situato all'interno dell'incubatore del sistema e fissarla.
  4. Impostare la procedura di inoculazione multicanale a canale a placche con P. Aeruginosa .
    1. Inizia i canali microfluidici utilizzando il modulo di controllo del sistema microfluidico selezionando: Colonne manuali > 1–4 > Fluido: TSB a 37 °C > Taglio Massimo (Pa): 0,1 (1 dyne∙cm-2 = 0,1 Pa) e seleziona un pozzo di uscita del diagramma multicanale 0–2 Pa a 48 pozzi.
    2. Seleziona il pulsante di aborto per fermare il flusso dopo 2–4 secondi e lasciare la piastra per 30 minuti, per assicurarti che le celle si attacchino al substrato del canale prima di iniziare il flusso continuo.
      NOTA: Una durata di 30 minuti permette alla forza gravitazionale di aiutare ad aderire il batterio planctonico P. aeruginosa alla parete inferiore del canale. Questo periodo varia a seconda dei batteri e del tipo di mezzo nutritivo.
    3. Rimuovere la piastra multicanale dallo stadio incubatore mobile e trasferire 1 mL di TSB fresco nel pozzo di ingresso di ciascuno dei sei canali in un armadietto di sicurezza di classe II.
    4. Trasferisci la piastra multicanale sul palco mobile all'interno dell'incubatore e fissala in posizione.
  5. Configura AutoRun.
    1. Assicurarsi che il flusso utilizzato durante le 24 ore sia rilevante per dove P. aeruginosa si trova in natura, navigando su > manuale dello sforzo di taglio: 0,01 Pa, e registrando la portata volumetrica (μL⋅h-1) visualizzata. Assicurati che questo valore, per la piastra microcanale a 48 pozzi, sia di 8,2 μL⋅h-1.
    2. Convertire la portata volumetrica in m3∙s-1, calcolare l'area della sezione trasversale del canale (m2) e determinare la velocità di flusso quando si trova a una tensione di taglio idrodinamica di 0,01 Pa.
      NOTA: Utilizzando e riorganizzando l'equazione della portata fluido-volume, si può calcolare la velocità del fluido attraverso il canale:
      figure-protocol-3
      Dove U è la velocità del fluido (m∙s-1) e A è l'area della sezione trasversale del microcanale (m2) dei canali nella piastra multicanale.
    3. Calcola il numero di Reynolds del flusso utilizzando la densità, ρ, e la viscosità dinamica, μ, del mezzo TSB, e assicurati che sia entro un intervallo di flusso fluido in cui si trovano i biofilm di P. aeruginosa . Per una tensione di taglio idrodinamica di 0,01 Pa, assicurarsi che il numero di Reynolds sia 0,0117 e 0,0165 rispettivamente per i mezzi TSB e FAB. Se si trova fuori da questo intervallo, verifica che le condizioni del fluido siano impostate su TSB.
      figure-protocol-4
      Dove Dh è il diametro idraulico del microcanale utilizzato, ottenuto utilizzando:
      figure-protocol-5
      Dove, w e h, rappresentano la larghezza (m) e l'altezza (m) del microcanale utilizzato.
    4. Calcola la lunghezza di sviluppo del fluido per garantire che il flusso del fluido all'interno della regione di acquisizione dell'immagine sia completamente sviluppato.
      NOTA: La lunghezza di sviluppo per un fluido laminare attraverso un canale può essere calcolata utilizzando il numero di Reynolds, Re, e il diametro idraulico dei canali, Dh:
      Ldev = 0,06ReDh
    5. Configura l'autorun: Modifica AutoRun > Setup del protocollo > durata del tempo: 24 h, con una ripetizione di 1 e una tensione di taglio di 0,01 Pa. Salva il protocollo.
    6. Crea una nuova sequenza nella scheda Configurazione Sequenza applicando il protocollo appena creato con una ripetizione, ai canali 1–6 e seleziona fluido: TSB a 37 °C. Salva questa sequenza.
  6. Imposta l'acquisizione dell'immagine usando la finestra di Acquisizione Multidimensionale .
    1. Seleziona Acquisizione Multidimensionale usando il software di sistema, poi il pulsante live (in basso a sinistra della finestra di Acquisizione Multidimensionale ). Naviga nella fase del microscopio per visualizzare i canali 1–6 usando il pulsante live view e ingrandisce la fotocamera da 5× al 40× sullo schermo touch del microscopio, mostrando un canale nel campo visivo della telecamera alla volta.
    2. Prepara la fotocamera per l'acquisizione dell'immagine: Acquisizione multidimensionale > salvataggio: seleziona una cartella per le immagini da salvare su > Timelapse: Durata: 24 ore, la stessa durata del flusso idrodinamico > Intervallo di tempo: Tempo tra ogni immagine acquisita, impostato a 10 minuti.
    3. Inserisci le impostazioni della fotocamera selezionando lunghezza d'onda > Illuminazione: campo luminoso 50% fotocamera 50%: bianco e nero > auto-esposizione: ogni acquisizione > acquisizione: ogni momento > automessa a fuoco: mai.
    4. Determinare le posizioni della telecamera per catturare le immagini del biofilm impostando l'ingrandimento a 20×, ottenendo un campo visivo con dimensioni 665,6 μm × 665,6 μm e navigare verso il centro della regione di visione del canale, dove il numero del canale sarà inciso al centro.
    5. Aggiungi la posizione del palco in modo che venga catturata dalla telecamera, naviga su Stage , etichetta la posizione e seleziona il pulsante di addizione per aggiungerla alla directory.
      1. Si ripete questo per i punti a monte a 0,9984 mm e i punti a valle a 3,0016 mm dall'ingresso della regione di visione del canale, dove la posizione rappresenta il punto centrale del campo visivo della telecamera.
        NOTA: Queste posizioni di imaging sono state selezionate per fornire rappresentazioni della crescita del biofilm lungo la regione di visione, assicurando al contempo che il flusso all'interno sia completamente sviluppato. Questo comporta tre immagini acquisite per ogni microcanale, in questo caso con 18 immagini scattate ogni 10 minuti.
  7. Eseguire la corsa sperimentale
    1. Nella finestra del modulo di controllo di sistema seleziona AutoRun > Run Setup > Sequence: seleziona la sequenza 0.01 Pa creata, poi seleziona start.
    2. Subito dopo, naviga alla finestra di Acquisizione Multidimensionale > Acquisire. Questo inizia l'acquisizione delle 18 immagini ogni 10 minuti della procedura sperimentale di 24 ore, che produce 2610 immagini al termine dell'esperimento.
      NOTA: La sezione sopra è stata riprodotta su altri sei microcanali circa 48 ore dopo l'esperimento iniziale con condizioni identiche.

10. Accumulo Z-stack

  1. Al termine di ogni prova sperimentale, seleziona tre canali e ottieni z-stack di tre sezioni lungo di essi con un ingrandimento del 40×, aprendo il Multi Dimensional Acquisition > Main: deseleziona tutte le opzioni tranne 'Serie Z'.
  2. Naviga nella serie Z dopo che una sezione lungo un canale è stata selezionata all'interno di Multi Dimensional Acquisition e modifica > Impostazioni interattive: Incremento: 0.5 e deseleziona entrambe le caselle.
  3. Usa la manopola di messa a fuoco del microscopio e ruotalo appena finché il biofilm non diventa a fuoco, e inserisci la distanza z selezionando Imposta Sopra Corrente. Ripeti questa procedura, ma ruotando la manopola di messa a fuoco nella direzione opposta e selezionando Imposta Bottom To Current. Questo dà al microscopio la distanza per catturare lo stack z.
  4. Seleziona una cartella all'interno della finestra Salvataggio per salvare la z-stack e seleziona Acquisisci in basso a destra della finestra per iniziare l'acquisizione.

11. Analisi di immagini e dati post-esperimento

  1. Ottenere dati percentuali di copertura della superficie del biofilm.
    1. Carica le immagini acquisite nel software di sistema scegliendo: Strumenti di analisi > Revisiona dati multidimensionali > seleziona File base > Seleziona Directory: naviga e seleziona la cartella con le immagini salvate > Visualizza > Lunghezza d'Onda 1, e nella sezione centrale quadrata che mostra orizzontalmente il numero di immagini acquisite, clicca con il tasto destro sulla piccola casella grigia in alto, angolo sinistro.
    2. Carica le immagini di ogni sezione del canale, una ad una, scegli Posizione del palco: seleziona la posizione da visualizzare > Carica immagine. Salva la serie di immagini come file TIFF.
    3. Soglia l'immagine selezionando Immagine Soglia > Soglia Automatica per Oggetti Scuri evidenziando il biofilm, poi delimita l'immagine usando lo strumento Regione Rettangolare .
      NOTA: Il cursore sul lato sinistro dell'immagine con soglia può essere spostato su e giù per modificare l'intensità della soglia e distinguere meglio tra biofilm e sfondo. Se l'immagine presenta ombre, delimita la sezione senza, poiché le ombre potrebbero essere state evidenziate di default, modificando i valori delle misurazioni.
    4. Ottieni dati sulla percentuale di copertura superficiale del biofilm nell'immagine durante l'esperimento di 24 ore selezionando >le Misurazioni > Regione di Misura Standard MM nella finestra del software di sistema per generare una tabella dei dati sul biofilm evidenziato all'interno del bordo rettangolare, inclusa la percentuale di area soglia. Seleziona Apri Log per aprire e salvare un file di log e F9: Log Data per inserire i dati nel file di log.
    5. Apri un foglio di calcolo e, utilizzando i dati biofilm di 24 ore per ogni sezione di canale, crea un grafico che mostri la percentuale di copertura della superficie del biofilm su 24 ore.
  2. Ottenere lo spessore del biofilm e la rugosità media aritmetica della superficie.
    1. Ho salvato lo z-stack su Fiji (ImageJ) trascinando il file salvato nella barra di controllo Fiji e convertendo in un'immagine a 8 bit: Image > Tipo > 8 bit.
    2. Aumenta il contrasto tra il biofilm e la superficie del canale per eliminare eventuali rumori indesiderati: Immagine > Regola > Luminosità/Contrasto.
    3. Soglia dell'immagine, impostando il valore del pixel del biofilm 255 (bianco) e il valore del pixel di sfondo 0 (nero): Immagine > Regolare > Soglia.
    4. Imposta la scala dell'immagine, analizza > imposta la scala > la distanza in pixel: 2048 > Distanza nota: 332,8 > Rapporto d'aspetto dei pixel: 1,0 > Unità di lunghezza: μm.
      NOTA: La distanza nota è di 332,8 μm, poiché la fotocamera Hamamatsu utilizzata ha un campo visivo di 2048 × 2048 pixel, con ogni pixel di dimensione 6,5 μm e le immagini sono state scattate con un ingrandimento di 40 ×.
    5. Analizza la Z-stack usando una macropersonalizzata 18 (Supplementary File 1) che calcola e somma l'area superficiale del biofilm su ogni fetta della z-stack e utilizza i valori della scala di input per calcolare lo spessore della serie, permettendo di trovare il volume. In alternativa, si trova lo spessore del biofilm dividendo il volume calcolato per l'area superficiale.
    6. Ottieni i valori medi aritmetici di rugosità superficiale del biofilm da ogni serie z scaricando il plugin SurfCharJ (non Fiji) e salvalo nella cartella plugin.
    7. Carica lo z-stack su ImageJ trascinando lo stack salvato nella barra di controllo e convertendolo in un'immagine a 32 bit: Tipo di > immagine: 32-bit.
    8. Crea un grafico di superficie, mostrando la variazione dei valori di grigio lungo la superficie dello stack: Analizza > Profilo Grafico > Altro: Grafico ad alta risoluzione. Converti il grafico ad alta risoluzione a 32 bit.
    9. Ottieni il valore medio aritmetico della rugosità superficiale avviando il plugin SurfCharJ: Plugins > SurfCharJ > Calcolo della rugosità: Lunghezza media di campionamento (): 10.
      NOTA: Il plugin SurfCharJ utilizza i vari valori grigi lungo la superficie dello z-stack per calcolare la rugosità media aritmetica della superficie. Verrà prodotta una tabella contenente i parametri di rugosità superficiale, l'unico parametro di interesse è la media aritmetica della rugosità superficiale, Ra. I valori della tabella dovranno essere convertiti in micrometro dai pixel.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa sezione illustra i risultati rappresentativi nell'applicazione della procedura protocollare sopra indicata. Tutti gli esperimenti sono stati condotti con almeno tre repliche biologiche indipendenti, ciascuna composta da sei canali paralleli, e i dati sono presentati come media ± deviazione standard. Le barre di errore in tutti i grafi rappresentano la deviazione standard, come definita nelle legende delle figure.

La crescita delle deformazioni ...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I diversi passaggi critici che insieme formano questo protocollo permettono un'analisi più completa e accurata della formazione del biofilm rispetto ai metodi alternativi e più tradizionali. Un componente chiave è l'uso di una piastra a microcanali a 48 pozzi, con canali in scala micrometrica di dimensioni 350 μm × 70 μm × 4 mm (W × H × L). Queste dimensioni replicano specificamente le condizioni di flusso e i microambienti presenti negli ambienti ospedalieri, come i cateteri urinari o i...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori desiderano ringraziare la School of Mechanical, Aerospace and Civil Engineering (MAC) dell'Università di Sheffield per il finanziamento.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
(NH4)2SO4Acros Organics7783-20-2Per il mezzo FAB modificato
Placca microcanale 0-2 Pa a 48 pozzi - copertura in vetroMicrosistemi Cellulari910-0047-5PackMicrocanali per il flusso dei media e la crescita del biofilm
con imaging in tempo reale
-80 ° C FreezerThermo Fisher Scientific1.16057E+15Conservare scorte di glicerolo fino a un ulteriore utilizzo
Agar, grado batteriologicoAcros Organics443570010Per piastre di agar - coltivazione dei batteri
Bilanciamento AnaliticoVWRVWRI611-2297Per misurare i componenti dei mezzi utilizzati
AutoclavePriorclave4304Per sterilizzare la vetreria
BioFlux 1000HTI& L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell- microsistemi/dispositivi/bioflux-1000ht-
sistema di taglio e flusso di taglio/ 		Per esperimenti di flusso a microcanale e crescita di biofilm
Modulo di Controllo BioFluxI& L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell-
microsistemi/dispositivo/bioflux-1000ht- sistema di taglio a flusso/ 		Impostare e monitorare il flusso dei media e la crescita della biofilm all'interno dei microcanali
BioFlux Montage SoftwareI& L Biosystemshttps://il-
biosystems.com/app/uploads/2025/01/Bi oFlux_Overview_.pdf		Impostare e monitorare il flusso dei media e la crescita della biofilm all'interno dei microcanali
CaCl2Fisher Scientific10043-52-4Per il mezzo FAB modificato
CaSO4.2H2OChemCruzA1719Per 1 L di soluzione minima di metallo
Piastra trasparente in polistirene a 96 pozziCorning, CostarCLS7007Per il conteggio cellulare vitale
CoSO4.7H2OSigma-Aldrich10026-24-1Per 1 L di soluzione minima di metallo
CuSO4.5H2OHoneywell209198-100GPer 1 L di soluzione minima di metallo
Tubi Eppendorf 3810XEppendorf30125150Per le scorte di glicerolo di P. aeruginosa
FeSO4.7H2OVWR International Ltd.284005EPer 1 L di soluzione minima di metallo
Fiji (ImmagineJ)Istituti Nazionali di Salutehttps://imagej.net/software/fiji/downloa
ds		Elaborazione immagini a Z-stack
GlucosioSigma-Aldrich50-99-7Per il FAB Medium modificato con glucosio
GliceroloSigma-Aldrich56-81-5Per le scorte di glicerolo di P. aeruginosa
H3BO3Fisher Scientific10043-35-3Per 1 L di soluzione minima di metallo
Hamamatsu Orca-Flash 4.0 Modello C11440-
42U		HamamatsuC11440-42UPer l'esperimento di imaging in tempo reale per il flusso di microcanali e la crescita del biofilm
KH2PO4BioReagenti Fisher7778-77-04Per il mezzo FAB modificato
Distillato-DistillatoSigma-Aldrich2857Per pulire l'armadietto di microbiologia prima e dopo l'uso
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100GPer il mezzo FAB modificato
Cabinet di Microbiologia Classe IIThermo Fisher Scientific42111226Eseguire i passaggi del protocollo senza batteri, brodo o agar contaminanti
Mini IncubatoreLabnet InternationalSN03171014Per scongelare PAO1 e PA14 dopo -80 °C; Congelatore C e
per la crescita iniziale di 24 ore di piastre agar batteriche
MnSO4. H2OSigma-Aldrich10034-96-5Per 1 L di soluzione minima di metallo
Na2HPO4.2H2OSigma-Aldrich10102-40-6Per il mezzo FAB modificato
NaClSigma-AldrichS5886-500GPer il mezzo FAB modificato
NaMoO4. H2OSigma-Aldrich10102-40-6Per 1 L di soluzione minima di metallo
Bilanciamento di precisioneVWRVWRI611-2299Per misurare i componenti dei mezzi utilizzati
Centrifuga refrigerataErao40289841Separazione della coltura di P. aeruginosa da
soprandanante per le scorte di glicerolo
Cuvette semi-microAlpha LaboratoriesX72053Per misurazioni della densità ottica
Incubatore a ScuotereINFORS HThttps://infors- ht.com/en/products/incubator- shaker/multitron-standardPer le culture notturne
Citrato di sodioSigma-Aldrich71498-250GPer il mezzo FAB modificato con citrato di sodio
Anelli di inoculazione plastica steriliMicrospecifiche15782105Per P. aeruginosa, l'inoculazione PAO1 e PA14 in placche agariche e tubi del falco
Agar di soia triptico, vegitoneMillipore14432-500G-FPer piastre di agar - coltivazione dei batteri
Brodo di soia tripticoSigma-AldrichT8907Substrati di coltura disidratati - 6 g/200 mL
Dispenser d'acqua di tipo 1Thermo Fisher ScientificSN42103311Per l'acqua distile
ZnSO4.7H2OFisher Scientific7446-20-0Per 1 L di soluzione minima di metallo

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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