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Articolo metodologico

Un modello di lesione termica tramite radiofrequenza monopolare sul nervo sciatico nei topi

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DOI:

10.3791/69998

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3 aprile 2026

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1Department of Pain Management, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2National Medical Center for Neurological Diseases, 3National Clinical Research Center for Geriatric Diseases

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio applicò sistemi a radiofrequenza ai nervi sciatici dei topi, stabilendo un modello di ablazione a radiofrequenza della lesione del nervo termico. Questo approccio risolve le questioni di controllabilità nei modelli di lesioni termiche del nervo periferico nei topi, fornendo un metodo pratico di modellazione per la ricerca sulla riparazione delle lesioni nervose e sul dolore neuropatico.

Abstract

La lesione del nervo periferico spesso provoca dolore neuropatico e innesca i processi di riparazione dei nervi. Sebbene i modelli di lesioni fisiche controllabili siano ora ben consolidati, i modelli esistenti di lesioni termiche rimangono esplorativi e mostrano scarsa controllabilità. Nella pratica clinica, i sistemi di ablazione a radiofrequenza (RFA) sono frequentemente impiegati per indurre lesioni termiche a tessuti e nervi. La RFA è una modalità terapeutica che si è dimostrata efficace per bloccare la trasmissione del dolore inducendo danni termici ai nervi. L'entità dell'ablazione può essere modificata modificando parametri specifici, così come il grado di intorpidimento e disfunzione motoria nell'area di distribuzione nervosa interessata. Questo studio ha utilizzato un sistema a radiofrequenza monopolare per creare un modello stabile e controllabile di lesioni nervose nel nervo sciatico dei topi, applicando 75°C per 30 secondi. Un aumento significativo della soglia di sospensione meccanica (MWT) è stato osservato dai giorni 7 al 14 post l'intervento, con il recupero avvenuto entro il giorno 28. Questa ricerca affronta l'attuale lacuna nei modelli di lesioni nervose da RFA, replica i danni nervosi osservati clinicamente dopo le procedure RFA e fornisce un quadro metodologico per studi successivi sulle lesioni nervose indotte da RFA.

Introduzione

Il dolore neuropatico presenta sfide continue nella gestione clinica, poiché i suoi meccanismi dolorosi continuano a essere investigati. Per studiare i meccanismi molecolari e cellulari del dolore neuropatico, la legatura del nervo spinale (SNL)1, la lesione da costrizione cronica (CCI)2, la legatura parziale del nervo sciatico (pSNL)3, la transezione del nervo sciatico (SNT)4 e la lesione nervosa risparmiata (SNI)5 sono state utilizzate con successo nei roditori per simulare lesioni nervose fisiche periferiche. Per migliorare la controllabilità e la stabilità del modello, studi precedenti hanno proposto miglioramenti, come manometri e danni selettivi, che sono stati implementati.

Sebbene la tecnologia a radiofrequenza abbia prodotto risultati clinici favorevoli, è anche associata a diversi effetti collaterali. Ad esempio, l'ablazione a radiofrequenza (RFA), utilizzata per l'emostasi durante l'interventochirurgico 6, può causare danni termici ai tessuti circostanti e comportare un rischio di lesioni termiche ai nervi periferici a causa dell'elevata temperatura della punta dellostrumento 7. Inoltre, la RFA per il trattamento della nevralgiatrigeminale 8, della nevralgia post-erpetica9 e di altre condizioni di dolore neuropatico riducono il dolore primario dopo l'intervento ma sono accompagnate da intorpidimento postoperatorio a lungo termine nell'area innervata, iperalgesia superficiale e altri fastidi10,11. Di conseguenza, la ricerca sulle lesioni termiche ai nervi periferici ha gradualmente attirato attenzione. Tuttavia, i modelli animali esistenti non sono in grado di controllare con precisione temperatura, durata e localizzazione del danno termico, limitando così l'uniformità della gravità della lesione.

Studi precedenti hanno utilizzato barre conduttrici di calore collegate a un bagno d'acquaa temperatura costante 12 o una pompa dell'acqua calda per iniettare acqua calda in un tubo di gomma a contatto diretto con ilnervo 13, con l'obiettivo di simulare gli effetti termici della RFA sulle lesioni nervose. Tuttavia, i precedenti modelli di lesione termica avevano indotto solo danni termici, eliminando così l'influenza della corrente a radiofrequenza e dei suoi parametri sui nervi. Resta da esplorare se i danni causati dalla RFA siano dovuti esclusivamente agli effetti termici, o se fattori come i cambiamenti nei parametri di radiofrequenza esercitino effetti distinti sui nervi. L'attuale mancanza di modelli animali che impieghino direttamente sistemi di coagulazione termica a radiofrequenza per lesioni nervose ostacola l'avanzamento della ricerca sui danni nervosi associati alla RFA. Questo studio ha utilizzato direttamente un sistema monopolare di RFA per simulare lesioni nervose associate alle procedure di RFA in contesti clinici, inducendo lesioni da RFA ai nervi sciatici dei topi. Fornisce un riferimento metodologico per la ricerca di base sulle lesioni da RFA ai nervi periferici.

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Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico Animale del Centro Sperimentale per Animali, Ospedale Xuanwu, Capital Medical University, e sono stati condotti in conformità con la Guida NIH per la Cura e l'Uso degli Animali daLaboratorio 14. I maschi adulti C57BL/6 topi (8–10 settimane, 20–25 g) sono stati alloggiati in gruppo (4–5 per gabbia) in condizioni ambientali controllate (22 ± 2 °C, 50%–60% di umidità, ciclo chiaro/scuro di 12 ore con luci accese alle 07:00) con accesso ad libitum al cibo standard per roditori e acqua. Tutte le valutazioni comportamentali sono state effettuate durante la fase luminosa tra le 08:00 e le 12:00. I dettagli dei reagenti, del software e delle attrezzature sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Anestesia e preparazione dei topi

  1. Anestetizzare i topi tramite iniezione intraperitoneale di una soluzione di tribromoetanolo da 20 mg/mL a una dose di 0,2 mL per 10 g di peso corporeo.
  2. Copri entrambi gli occhi con una pomata oftalmica usando un applicatore di cotone.
  3. Posiziona i topi nella posizione laterale sinistra. Rimuovi i peli sul lato destro del corpo (area di 1 cm × 1 cm) con un rasoio elettrico (Figura 1).
    NOTA: Questo passaggio aumenta l'area di contatto tra il torso e la piastra negativa del circuito per facilitare la riduzione della resistenza del circuito.
  4. Posiziona parte del torso del topo a contatto con la piastra metallica dell'elettrodo negativo in orientamento laterale destro. Applicare diverse gocce di liquido ionico (0,9% di NaCl o soluzione di Ringer modificata; vedi Tabella dei materiali per la composizione) sull'area di contatto tra il torso e la piastra per aumentare la conducibilità elettrica.
    NOTA: Assicurarsi che la testa e il volto rimangano lontani dalla piastra negativa per evitare esposizioni non indesiderate agli occhi o ad altri organi.
  5. Fissa il braccio posteriore sinistro in posizione rivolta verso l'alto con il ginocchio fletto usando nastro adesivo sulla piastra dell'elettrodo negativo. Rimuovere i peli dalla zona sinistra della coscia e disinfettare il sito chirurgico tre volte con etanolo al 75%.
  6. Confermare una profondità adeguata dell'anestesia prima di procedere, verificando l'assenza di una risposta di astinenza da uno stimolo da pizzicamento applicato al membro posteriore o alla coda.
    NOTA: Evitare di somministrare anestetici locali (ad esempio, lidocaina) o farmaci antinfiammatori non steroidei (ad esempio, paracetamofene) durante il periodo perioperatorio, poiché questi agenti possono influenzare le valutazioni neurocomportamentali postoperatorie.

2. Chirurgia di ablazione a radiofrequenza

  1. Usa il femore come riferimento. Usa microforbici per tagliare un'incisione cutanea di 1 cm nella direzione dell'asse lungo del femore, con una traslazione laterale di 0,5 cm verso il lato caudale (Figura 2).
  2. Dissezionare in modo diretto il muscolo bicipite femorale (BFM) lungo l'incisione cutanea e cercare il tronco principale del nervo sciatico utilizzando una micropinza. Il nervo sciatico si biforca vicino all'articolazione del ginocchio (Figura 3).
  3. Utilizzare micropinze per sezionare il tronco del nervo sciatico dal tessuto circostante circa 2 mm sopra la biforcazione del nervo sciatico, fino a una lunghezza di circa 5 mm. Evitare lesioni ai vasi sanguigni durante la separazione contundente.
    NOTA: In caso di lesioni vascolari accidentali, utilizza un cotton wool sterile per assorbire il sangue e applicare la pressione adeguata per fermare il sanguinamento. Continuare l'operazione dopo che non ci sono ulteriori infiltrazioni di sangue.
  4. Collega l'ago di coagulazione RFA al dispositivo di trattamento a radiofrequenza. Posiziona la punta dell'ago piatta sul tessuto muscolare per testarne la resistenza. Se la resistenza è superiore a 1 kΩ, si aggiunge liquido ionico tra il corpo del topo e la piastra negativa usando un contagocce finché la resistenza non scende sotto 1 kΩ.
  5. Solleva delicatamente il nervo sciatico separato con una lancetta di vetro dei minuti. Posizionare l'ago RFA sotto il nervo sciatico, con la punta metallica esposta posizionata a 3 mm dalla biforcazione del nervo sciatico (Figura 4).
  6. Imposta i parametri dello strumento terapeutico a radiofrequenza come segue: modalità di coagulazione termica, 75 °C, 30 s, frequenza di 2 Hz e larghezza dell'impulso di 1 ms. Attiva la fornitura di energia RFA.
  7. Ritira delicatamente l'ago RFA. Riposizionare il nervo sciatico usando una pinzetta per sollevare il tessuto muscolare. Chiudi il muscolo con la sutura di acido poliglicolico assorbibile 6-0 (PGA). Chiudi l'incisione cutanea con la sutura assorbibile PGA 4-0.
  8. Dopo l'intervento, posizionare i topi su una coperta per acqua calda circolante (38 °C) o su un cuscinetto riscaldante termostatico (37–38 °C) coperto con carta igienica o un asciugamano per permettere all'asciugatura i capelli e prevenire danni diretti causati dal calore.
  9. Riporta i topi nella gabbia e attendi la guarigione dall'anestesia. Controlla regolarmente ogni giorno l'integrità delle incisioni e monitora l'assunzione di cibo, acqua e condizioni generali del corpo.

3. Gruppo sperimentale

  1. Gruppo RFA: Eseguire il protocollo completo di chirurgia RFA come descritto nei passaggi 2.1–2.9.
  2. Gruppo fittizio: eseguire procedure identiche al gruppo RFA (passaggi 2.1–2.5 e 2.7–2.9), ma non attivare la consegna del sistema RFA nel passo 2.6. Mantieni l'ago RFA in posizione sotto il nervo sciatico per 30 secondi senza attivazione corrente, poi procedi al passo 2.7.
    NOTA: Il gruppo Sham controlla traumi chirurgici, anestesia, manipolazione nervosa e posizionamento di aghi indipendentemente dalla lesione termica.

4. Valutazione di Von Frey per MWT

  1. Prima di ogni prova, posiziona i topi casualmente sulla piattaforma di prova von Frey. Lascia l'acclimatazione per 15 minuti finché il comportamento esplorativo non cessa.
    NOTA: La piattaforma è composta da una rete metallica con fori da 0,6 cm × 0,6 cm sul fondo e da diversi contenitori rossi trasparenti per i topi, che vengono posizionati in contenitori diversi senza interferire tra loro.
  2. Esegui la valutazione di von Frey usando il metodosu-giù 15. Applica il filo di fibra di von Frey per stimolare la parte centrale della suola della zampa posteriore sinistra con abbastanza forza da causare una leggera piegatura. Aspetta per 3 secondi o fino a quando non si verifica una risposta da astinenzadopo 16.
    NOTA: Inizia a testare con il filamento da 0,4 g. Applica il filamento successivo più alto dopo una risposta negativa, o il filamento più basso dopo una risposta positiva. Continuare per quattro ulteriori applicazioni dopo il primo cambio di direzione. In pratica, il filamento da 2 g è stato fissato come limite superiore in questo studio perché a questa forza la fibra di von Frey sollevava la zampa anteriore da terra senza mostrare risposte di fuga o ritiro.
  3. Registra le risposte e calcola il 50% MWT usando il calcolatore del metodo up-down (metodo up-down per esperimenti di von Frey, https://bioapps.shinyapps.io/von_frey_app/).
  4. Eseguire i test von Frey al punto di partenza (preoperatorio) e nei giorni 7, 14, 21, 28 e 35 postoperatori.

5. Raccolta dei tessuti DRG e colorazione immunofluorescenza

  1. Al giorno 7 postoperatorio, prelevare DRG L4–L6 dai gruppi RFA e Sham.
  2. Fissare i tessuti al 10% di saccarosio-paraformaldeide a 4 °C per 6–12 ore.
  3. Crioproteggi i tessuti al 30% di saccarosio-PBS a 4 °C durante la notte.
  4. Inserire i tessuti nel composto a temperatura di taglioottimale 17.
  5. Tagliare criosezioni da 13 μm e permeabilizzare le sezioni con un tensioativo non ionico.
  6. Bloccare con un reagente bloccante e incubare durante la notte con l'anticorpo policlonale a 4 °C.
  7. Dopo il lavaggio, incubare con l'anticorpo secondario per 2 ore a temperatura ambiente.
  8. Monta con medium antifade.

6. Analisi statistica

  1. Presentare dati continui normalmente distribuiti come media ± errore standard della media (SEM).
  2. Effettuare confronti tra gruppi utilizzando il test t dei campioni indipendenti.
  3. Analizza i confronti all'interno del gruppo tra diversi momenti temporali utilizzando l'analisi della varianza a misure ripetute (ANOVA).
  4. Applica la correzione di Bonferroni per confronti post-hoc a coppie.
  5. Elaborare tutti i dati utilizzando un software statistico e impostare la significanza statistica a P < 0,05.

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Risultati

L'affermazione positiva del modello è stata confermata sia da indicatori intraoperatori che postoperatori. Al termine dell'RFA (75 °C, 30 s), al momento dell'astinenza è stata osservata una lieve adesione tra la punta dell'ago della RFA e il nervo sciatico. Questa adesione deriva da una denaturazione e coagulazione localizzata delle proteine nel sito di contatto e suggerisce un adeguato apporto di energia termica insieme a un contatto nervoso diretto. L'assenza di aderenza può indicare u...

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Discussione

Con il rapido sviluppo della chirurgia minimamente invasiva, la tecnologia a radiofrequenza è diventata sempre piùdiffusa 6,7,18. Con l'espansione della tecnologia a radiofrequenza nella pratica clinica, la ricerca correlata ne ha facilitato l'adozione più ampia. Tuttavia, gli effetti della corrente a radiofrequenza sui tessuti richiedono ulteriori indagini, soprattutto dopo l'applicazione della...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

Questo studio è supportato dal Programma di Convergenza dei Talenti dell'Ospedale Xuanwu (HZ2025PYDTR009) e dai Fondi Capital per il Miglioramento della Salute e la Ricerca (2-CFH2024-2011).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sutura 4-0Jinhuan MedicalC412Chiudi la pelle
Sutura 6-0Jinhuan MedicalKCR631Chiudi lo strato muscolare
Anticorpo secondario Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008Anticorpo secondario
Anticorpo policlonale ATF3 del coniglioNovus BiologicalsNBP1-85816Anticorpi policlonali
Pinze sottili curveBeyotime BiotechnologyFS031Taglio muscolare e fascia
Mezzo di montaggio antifade DAPIBeyotime BiotechnologyP0131Mezzo antifade
Lancetta dei minuti di vetroYuyan InstrumentsBLFZ10Alza il nervo
GraphPad PrismGraphpad Software, LLCVersione 9.0Immagini dei dati in uscita
Micro ForbiciBeyotime BiotechnologyFS217Incisione cutanea tagliata
Soluzione Modificata di Ringer' sPreparato da soloN/ALattato di sodio 3,10 g/L; NaCl 6,00 g/L; KCl 0,30 g/L; CaCl2& middot; 2H2O 0,20 g/L
PortaagoYuyan InstrumentsY32010Tieni gli aghi
Soluzione di blocco QuickBlockBeyotime BiotechnologyP0260Reagente bloccante per l'immunofluorescenza
Dispositivo terapeutico a radiofrequenzaCosman MedicalRFG-1ASistema a radiofrequenza
Trocar elettrodo termocoagulante a radiofrequenzaCosman MedicalTCD-10Ago RF isolato
Iniezione di Ringer di lattato di sodioSichuan  Kelun  Pharmaceutical Co.,   Ltd86902180001566Liquido ionico per ridurre la resistenza
Statistiche SPSSIBM CorpVersione 27.0Software di analisi statistica
Pinze fini dritteBeyotime BiotechnologyFS027Taglio muscolare e fascia
Filo in fibra di von FreyDanmic GlobalAesthesio Semmes-WeinsteinTest comportamentale

Riferimenti

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