Questo protocollo descrive il metodo per impostare il saggio di formazione della mammosfera per studiare la radiografia tumorale indotta dall'inibitore dell'apoptosi 5 (Api5) nelle cellule epiteliali mammarie non tumariche. I lisati raccolti da mammosfere di generazione primaria vengono analizzati per diversi marcatori di stemino al fine di valutare l'induzione di proprietà simili a quelle delle cellule staminali.
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Articolo metodologico
Il saggio sulla mammosfera rivela la steminità indotta da Api5 in linee cellulari epiteliali mammarie non tumorigeniche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il cancro al seno rimane il cancro più diffuso tra le donne a livello globale, con i più alti tassi di incidenza e mortalità standardizzati per età. Nonostante i progressi nelle terapie mirate al cancro al seno, il 20% delle pazienti presenta ricadute della malattia, che può essere attribuita a una popolazione di cellule staminali tumorali (CSC) resistenti alla terapia. Questi CSC possono sopravvivere ai trattamenti convenzionali restando in uno stadio di quiete o persistere a causa di una resezione incompleta della massa tumorale, con conseguente recidiva in una fase successiva. Pertanto, ricerche recenti si sono concentrate sull'identificazione, isolamento e colpire questa popolazione cellulare resistente. In vitro, il saggio di formazione della mammosfera funge da robusto sistema di coltura a sospensione tridimensionale per arricchire e propagare cellule staminali all'interno delle popolazioni epiteliali mammarie. Qui presentiamo un approccio che utilizza il saggio sulla mammosfera per valutare il fenotipo simile alle cellule staminali tumorali che è abilitato nelle cellule epiteliali mammarie non tumorigeniche dalla sovraespressione dell'inibitore dell'apoptosi 5 (Api5). Il protocollo prevede la propagazione delle mammosfere attraverso passaggi seriali per valutare l'efficienza della formazione della mammosfera e la capacità di auto-rinnovamento. Inoltre, i lisati proteici raccolti dalle mammosfere vengono sondati per i marcatori di stelo stabiliti tramite immunoblotting. Questo saggio consente di indagare nuovi regolatori, come Api5, delle proprietà simili alle cellule staminali tumorali nelle popolazioni di cellule epiteliali mammarie. L'approccio descritto può essere adattato per studi comparativi di interventi molecolari o per lo screening di agenti terapeutici che mirano ai CSC in vitro.
Introduzione
L'aumento dei tumori al seno resistenti alla chemioterapia ha portato a un aumento dell'enfasi sull'identificazione e il miramento della causa sottostante della resistenza alla terapia e della ricaduta, ovvero una popolazione di cellule tumorali note come cellule staminali tumorali. Queste cellule sono caratterizzate dalla loro capacità di eludere la differenziazione e rimanere immobili, permettendo loro di resistere a diverse modalità di trattamento delcancro 1,2. Possono essere impiegati diversi metodi per identificare le cellule staminali del cancro al seno, tra cui il saggio di formazionedella mammosfera 3,4,5, la selezione cellulare basata sui marcatori superficialicellulari 6,7, l'isolamento basato sulle proprietà di effluxo, i saggi in vivo di tumorigenicità7 e la valutazione di modulatori nucleari delle cellule staminali come Oct48, Nanog 9, Sox210 eBmi 11. Tipicamente, l'identificazione e l'isolamento delle cellule staminali tumorali comporta una combinazione di uno o più di questi approcci.
L'inibitore dell'apoptosi 5 (Api5) è una proteina anti-apoptotica che si è riscontrata di essere sovraregolata in diversi tumori, tra cui il cancro alseno 12,13,14, il cancrocervicale 15,16,17, la leucemia linfoide cronica a celluleB 18 e il cancro polmonare non a piccolecellule 19. Alti livelli di Api5 sono stati associati alla resistenza alla chemioterapia nel cancrocervicale 16 e al cancro al seno triplonegativo 12. Ci sono sempre più evidenze che la resistenza e la ricaduta alla terapia siano spesso guidate dalle cellule staminalitumorali 20,21. Uno studio interessante di Song et al.22 ha rivelato che la sovraespressione di Api5 nelle cellule tumorali dell'utero porta a livelli elevati di Narag, contribuendo a un aumento della stampuntezza del tumore. Studi precedenti del nostro laboratorio hanno dimostrato che la sovraespressione di Api5 porta alla trasformazione di cellule epiteliali mammarie non tumorigeniche coltivate in colture 3D supportate da Matrigel. Queste cellule trasformate mostrano polarità disturbata, aumento della proliferazione, crescita indipendente dall'ancoraggio e un fenotipo parziale di transizione epiteliale a mesenchimale (EMT). I cambiamenti fenotipici osservati alla sovraespressione di Api5 nelle colture 3D sono stati mantenuti dopo la dissociazione degli sferoidi in colturemonostrato 14. Dato che Api5 è aumentato nei tumori mammari triplice negativi resistenti alla chemioterapia, ipotizziamo che Api5 possa anche regolare le proprietà di stamina tumorale nelle cellule epiteliali mammarie.
In questo contesto, descriviamo il saggio di formazione della mammosfera per identificare cellule staminali tumorali tumorali da cellule epiteliali mammarie dissociate 3D non tumorigeniche trasformate dalla sovraespressione di Api5, seguito da western blotting per i marcatori delle cellule staminali al fine di confermare l'identità di queste cellule. Il saggio sulla mammosfera prevede la coltivazione di cellule epiteliali mammarie in condizioni non aderenti e non differenzianti, il che consente l'arricchimento di cellule simili a staminali/progenitrici in strutture tridimensionali note come mammosfere. Le cellule epiteliali mammarie che non possiedono proprietà simili a quelle dello stelo tipicamente subiscono anoiki; tuttavia, le cellule con caratteristiche simili a quelle dello stelo danno origine allemammosfere 4,5. Questo metodo è stato originariamente sviluppato da Dontu etal 3 ed è ispirato dal saggio sulla neurosfera, utilizzato per studiare e identificare cellule staminali neurali eprogenitori 23. Il test sulla mammosfera descritto qui consente la valutazione dell'attività delle cellule staminali e della capacità di auto-rinnovamento in mezzi minimi integrati con B27 senza vitamina A e fattore di crescita epidermica umana ricombinante (EGF). Le cellule dissociate 3D sovraespressive di Api5 sono distribuite in modo sparso su piastre rivestite con poli(2-idrossietilmetacrilato) (pHEMA). Questo permette alle cellule di crescere in condizioni non aderenti, in modo che ogni successiva mammosfera sia di origine clonale. Le mammosfere vengono lasciate crescere fino al settimo giorno, dopodiché viene calcolata l'efficienza della formazione della mammosfera. Per distinguere le vere cellule staminali da quelle non staminali che perdono la loro capacità proliferativa nel tempo, vengono effettuate generazioni successive di formazione della mammosfera. Il passaggio seriale delle mammosfere consiste nel dissocere le sfere raccolte dalla generazione primaria e nel riplaccare le singole cellule per formare mammosfere di generazione secondaria (e successiva). Questo determina se le cellule possono avviare ripetutamente la formazione di sfere ed è quantificato come la capacità di auto-rinnovamento delle celle5.
Questo metodo può essere utilizzato per identificare le cellule staminali del tumore al seno in cellule epiteliali tumorigeniche o trasformate. Il metodo può anche essere adattato per isolare cellule staminali del cancro al seno da campioni di paziente. Il sistema può aiutare a identificare nuovi bersagli contro le cellule staminali del cancro al seno che potrebbero essere associate alla resistenza alla chemioterapia.
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Protocollo
1. Rivestimento delle lastre di coltura tissutale con poli(2-idrossietilmetacrilato), pHEMA
- Sciogliere 1,2 g di pHEMA (peso molecolare ̴ 300.000) in 100 mL di etanolo al 95% mescolare costantemente a 65 °C per preparare una soluzione di pHEMA all'1,2% (vedi Tabella dei Materiali).
- Ricoprire le piastre di coltura tissulare standard con pHEMA applicando 1 mL per pozzetto di una piastra a 6 pozzi. Il volume della soluzione di pHEMA può essere regolato in base alla dimensione del vaso della coltura tissutale.
- Lascia asciugare i piatti in forno a 40 °C in condizioni sterili.
- Espone le piastre alla luce UV per 15 minuti, seguite da tre lavaggi con la soluzione salina tamponata fosfato (DPBS) di Dulbecco, prima di usarle per preparare il test di formazione della mammosfera.
2. Semina delle mammosfere di generazione primaria
- Ha ottenuto in coltura cellule MCF10A dissociate 3D (controllo e sovraespressione di Api5) dissociando colture 3D del giorno 16 nel mezzo di crescita14.
NOTA: Composizione del mezzo di crescita: DMEM ad alto contenuto di glucosio senza piruvato di sodio integrato con siero di cavallo al 5%, 10 μg/mL di insulina, 0,5 μg/mL di idrocortisone, 20 ng/mL fattore di crescita epidermica umana ricombinante (EGF), 100 ng/mL di tossina colera e 200 unità/mL di penicillina-streptomicina (vedi Tabella dei materiali). - Rimuovere il mezzo esaurito, lavare le cellule con 1 mL di DPBS, poi aggiungere 500 μL di tripsina-EDTA allo 0,05% e incubare a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per 12-15 minuti finché tutte le cellule non sono tripsinizzate.
- Dopo che tutte le cellule sono state staccate, aggiungi 2 mL di mezzo di risospensione per neutralizzare l'attività della tripsina e fai ruotare la sospensione cellulare a 112 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Composizione del mezzo di risospensione: DMEM ad alto contenuto di glucosio senza piruvato di sodio integrato con siero di cavallo al 20% e 200 unità/mL di penicillina-estreptomicina. - Aspirare il sovrandanante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo mammosferico. Fai passare la sospensione a celle attraverso un ago da 25 G per ottenere una sospensione a singola cella.
NOTA: Composizione del mezzo mammosferico: DMEM/F12 integrato con 20 ng/mL di fattore di crescita epidermica (EGF), 1 integratore di B27 × senza vitamina A e 200 unità/mL di penicillina-streptomicina (vedi Tabella dei materiali). - Utilizzando un emocitometro, si conta il numero di cellule e si calcola il volume di sospensione cellulare necessario per seminare 0,2 × 104 cellule per pozzo.
NOTA: Mantenere una bassa densità di semina per determinare accuratamente l'efficienza della formazione della mammosfera, minimizzando così l'impatto dell'aggregazione cellulare. Quando si raccolgono lisati proteici per l'immunoblotting, la densità cellulare può essere aumentata fino a 2,5 × 105 cellule per pozzo. - Diluire il volume di sospensione della cella richiesto in 2 mL di mezzo mamasferico e seminare in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzi. Le cellule semi in triplicano per ogni condizione.
- Incubare a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% CO2 per 7 giorni.
- Dopo sette giorni di coltura, si contano manualmente il numero di mammosfere con diametro superiore a 50 μm in ciascun pozzo utilizzando un microscopio dotato di graticolo o una griglia a quadranti sotto un microscopio ottico.
- Immagini le mammosfere usando una fotocamera digitale montata su un microscopio luminoso a un ingrandimento di 20x.
- Calcola l'efficienza di formazione della mammosfera (MFE) usando la seguente formula5
3. Semina delle mammosfere di generazione secondaria
- Raccogliere le mammosfere formate nella prima generazione in un tubo da 15 mL e centrifugare a 300 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Aspira il surnatante, lasciando la pallina della mammosfera.
- Lava il pellet con DPBS.
- Aggiungi 200 μL di tripsina-EDTA allo 0,05% al pellet della mammosfera e incuba a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per 2-3 minuti. Far passare le mammosfere nella soluzione di tripsina attraverso un ago da 25 G tre volte per ottenere una sospensione a singola cellula.
- Aggiungi 0,5 mL di mezzo di risospensione per neutralizzare l'attività della tripsina e fai girare la sospensione a 112 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare il sovrantante e risospendere il pellet cellulare in 0,5 mL di mezzo mamosferico.
- Utilizzando un emocitometro, si conta il numero di cellule e si calcola il volume di sospensione cellulare necessario per seminare 0,2 ×10-4 cellule per pozzo.
NOTA: Mantenere una bassa densità cellulare per valutare la capacità di auto-rinnovamento, minimizzando così l'effetto dell'aggregazione cellulare. - Diluire il volume di sospensione della cella richiesto in 2 mL di mezzo mamasferico e seminare in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzi. Le cellule semi in triplicano per ogni condizione.
- Incubare a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% CO2 per 7 giorni.
- Dopo 7 giorni di coltura, si contano il numero di mammosfere con diametro superiore a 50 μm in ciascuna lamina utilizzando un microscopio dotato di graticola o una griglia a quadranti.
- Immagini le mammosfere usando una fotocamera digitale montata su un microscopio luminoso a un ingrandimento di 20x.
- Calcola la capacità di auto-rinnovamento usando la seguente formula5
4. Western blotting per rilevare i cambiamenti nei marcatori di pluripotenza in caso di sovraespressione di Api5
- Raccogliere le mammosfere formate nella prima generazione in un tubo da 15 mL e centrifugare a 300 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Aspira il surnatante, lasciando la pallina della mammosfera.
- Lava il pellet con DPBS.
- Raccogliere la pellet in un tampone RIPA ghiacciato per ottenere il lisato proteico ed eseguire l'immunoblotting secondo il protocollostandard 24.
NOTA: Composizione del tampone RIPA: 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% desossicolato di sodio, 0,1% dodecile solfato di sodio (SDS), 1 mM di acido etilenedilaminacetico (EDTA), 1 mM di fluoruro fenilmetilsulfonile (PMSF), 10 mM di fluoruro di sodio, 1 mM di ortovanato di sodio. - Rilevare i marcatori di stelo - Oct3/4, Nanog, Sox2 e Bmi1, e il controllo del carico GAPDH (vedi Tabella dei materiali per diluizioni degli anticorpi).
- Quantifica i livelli di proteine usando l'analisi densitometrica su ImageJ. Seleziona la regione di interesse nelle immagini Western blot e genera un profilo di densità per ogni corsia.
- Normalizzare le densità relative della proteina di interesse rispetto a quelle del GAPDH per ogni corsia. Calcola il cambiamento di piegamento per ogni proteina.
- Traccia il cambiamento del piegamento nei livelli proteici usando qualsiasi software di graficazione.
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Risultati
Per valutare l'efficienza della formazione della mammosfera in condizioni non aderenti, cellule MCF10A dissociate di controllo e sovraespressive con Api5 sono state seminate su piastre rivestite di poliHEMA secondo il protocollo. Le cellule sovraespressive di Api5 hanno dimostrato un aumento di 1,58 volte nell'efficienza media di formazione della mammosfera rispetto ai controlli (Figura 1B,C). Questo aumento dimostra che un'espressione più elevata di Api5 incrementa la propo...
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Discussione
Mentre le colture monostrato di linee cellulari tumorali consolidate o di cellule derivate dal tumore forniscono informazioni sui vari percorsi molecolari che regolano i fenotipi tumorali, la ricerca focalizzata sulle cellule staminali tumorali non può essere condotta in colture bidimensionali. Poiché si ritiene che le cellule staminali tumorali siano un fattore importante che contribuisce alla ricaduta dopo le attuali strategie di trattamento, è necessario stabilire saghi robusti per st...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non ci sono potenziali conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo studio è stato finanziato da una sovvenzione della SERB-POWER (SPG/2021/002661-G) e in parte da finanziamenti IISER, Pune Core. S.B. è stata finanziata da una borsa di studio UGC-SRF. Vorremmo ringraziare il Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA) per aver generosamente fornito le cellule MCF10A e il Dr. Abhijith K (Ahammune Biosciences Pvt. Ltd.) per i suoi preziosi contributi al manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 37 °C humidified incubator | New Brunswick | Galaxy 170 R | |
| Anti-Bmi1 Rabbit pAb | ABclonal | A13472 | 1:1000 diluizione, incubazione notturna a 4 °C |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma | G9545-200UL | 1:10000 diluizione, 1 h incubazione a temperatura ambiente |
| Anti-Nanog Rabbit mAb | ABclonal | A22625 | 1:5000 diluizione, incubazione notturna a 4 °C |
| Anti-Oct3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz | sc-5279 | 1:300 diluizione, incubazione notturna a 4 °C |
| Anti-Sox2 Antibody (E-4) | Santa Cruz | sc-365823 | 1:300 diluizione, incubazione notturna a 4 °C |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Invitrogen | 12587010 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R | |
| Cholera toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL stock in dH2O |
| DMEM/F12 | Thermo | 11330032 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL stock in dH2O |
| Ethanol absolute 99.9% | Jebsen & Jessen GmbH & Co. Germany | 58051 L05 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | SRL | 43272 | |
| High glucose DMEM without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965126 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050122 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Qualigens | Q29145 | Usato per regolare il pH del Tris-HCl (pH 8.0) |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL stock in etanolo |
| ImageJ | Software di elaborazione delle immagini | ||
| ImageQuant LAS 4000 | Cytiva | ||
| Immobilon Western chemiluminiscent HRP substrate | Merck | WBKLS0500 | |
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock in 1% acido acetico glaciale |
| Nikon Eclipse TS-100 microscope | Nikon | BM-1919 | |
| MCF10A cells | Dono del Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA) | ||
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Phenylmethysulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma | 78830-5G | |
| Plotting software | GraphPad Prism 10 | ||
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA) | Santacruz | sc-253284 | 1.2% pHEMA in 95% etanolo |
| Sodium chloride (NaCl) | SRL | 41721 | |
| Sodium deoxycholate | Amresco | 0613-100G | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | SRL | 54468 | |
| Sodium fluoride (NaF) | HiMedia | RM1081-500G | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508-10G | |
| Tris buffer | SRL | 71033 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
