Questo protocollo presenta la rottura di Rayleigh come un processo lieve per aerosolizzare vettori mRNA non virali. Il deposito regionale per vettori mRNA aerosolizzati viene valutato dal modello Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI). L'espressione della proteina di fluorescenza verde (GFP) nelle cellule polmonari umane rappresenta il mantenimento delle funzioni fisicochimiche e biologiche dei vettori mRNA post-aerosolizzati.
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Articolo metodologico
Somministrazione intranasale di poliplex di mRNA tramite aerosol di rottura di Rayleigh: un metodo in vitro per la deposizione nasale e i test funzionali
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La somministrazione intranasale di terapie a mRNA è una strategia promettente per la vaccinazione e il trattamento delle malattie respiratorie, offrendo attivazione immunitaria diretta nel sito di ingresso del patogeno. Tuttavia, i metodi convenzionali di aerosolizzazione (ad esempio, nebulizzatori a ultrasuoni o ad alta pressione) deteriorano i vettori mRNA non virali attraverso forze di taglio eccessive, causando la perdita dell'integrità strutturale e delle attività biologiche degli mRNA. Un atomizzatore nasale di rottura di Rayleigh è stato utilizzato per aerosolizzare delicatamente i vettori di polietileneimina (PEI)-mRNA in gocce uniformi. L'mRNA codificante per la Proteina Fluorescente Verde (GFP) è stato formulato in poliplex cationici e caratterizzato prima e dopo l'aerosolizzazione. Il processo di frammentazione di Rayleigh forma un microgetto continuo di gocce con un taglio minimo, preservando così le proprietà fisicochimiche delle nanoparticelle. Sono stati osservati dimensioni costanti delle particelle, basso indice di polidispersione e potenziale zeta stabile prima e dopo l'aerosolizzazione, confermando che le proprietà fisicochimiche dei poliplex di mRNA sono state ben preservate tramite la frammentazione di Rayleigh per l'aerosolizzazione. Utilizzando un modello Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI) delle vie aeree nasale, sono stati somministrati gli aerosol PEI-mRNA. Gli mRNA aerosolizzati sono stati depositati principalmente nelle regioni dei turbinati. Frazioni trascurabili sono state trovate nel nasofaringe o nelle sezioni equivalenti ai polmoni. Inoltre, i poliplex di mRNA post-aerosolizzati sono stati somministrati con successo alle cellule epiteliali polmonari umane A549 e hanno prodotto un'espressione rilevabile di GFP. Questo protocollo dimostra un metodo di somministrazione intranasale non distruttivo dell'mRNA utilizzando l'aerosolizzazione della rottura di Rayleigh. Mantiene efficacemente le proprietà fisicochimiche e le funzioni biologiche dei vettori mRNA non virali, atomizzando la fase acquosa in gocce di dimensioni appropriate per la deposizione nasale mirata. Questo protocollo rivela un approccio innovativo per aerosolizzare efficacemente gli mRNA e valutarne la deposizione regionale nella cavità nasale.
Introduzione
La somministrazione dei vaccini alla mucosa nasale (il portale d'ingresso di molti patogeni respiratori) può provocare una forte immunità locale e bloccare le infezioni alla loro origine. Il successo dei vaccini antinfluenzali intranasali e la recente approvazione dei vaccini COVID-19 intranasali sottolineano l'efficacia della via nasale nell'indurre sia risposte immunitarie mucose chesistemiche. La somministrazione intranasale dei vaccini a mRNA sta quindi suscitando grande interesse come strategia per prevenire infezioni virali respiratorie. Una delle principali sfide tecniche, tuttavia, è convertire i fragil....
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Protocollo
NOTA: Cultura HEK293T e linee cellulari A549 in un mezzo completo costituito dal Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) e 2% di penicillina-streptomicina prima della trasfezione di PEI-mRNA. Passare entrambe le linee cellulari circa ogni 48 ore al raggiungimento della confluenza. Cellule di seme a una densità di 40.000 cellule per cm² e coltura per ~48 ore. Rimuovere il mezzo di coltura e lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) immediatamente prima della trasfezione per rimuovere il siero residuo e standardizzare le condizioni di trasfezione. Autoclave tutte ....
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Risultati
Come manoscritto focalizzato sui metodi, i risultati dettagliati non sono l'obiettivo principale; tuttavia, vengono presentati risultati rappresentativi per illustrare gli esiti attesi di ciascuna parte del protocollo. Le figure menzionate di seguito mostrano dati di esempio (ad esempio, grafici o immagini) a supporto della validità del metodo, ma non sono incluse nuove analisi quantitative oltre alla dimostrazione.
Dimensione delle gocce e modello di .......
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Discussione
In questo protocollo, prima di aerosolizzare la formulazione, l'mRNA viene ramificato con PEI per aumentare l'assorbimento cellulare. Questo funge da surrogato per la somministrazione di LNP-mRNA durante la validazione in vitro 10,15. PEI-mRNA conserva la maggior parte delle funzioni delle formulazioni LNP, incluse importanti caratteristiche biologiche efunzionali 10. I gruppi amminamini carichi p.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori hanno riconosciuto il sostegno finanziario della King's Undergraduate Research Fellowship (KURF) e del Student Opportunity Fund fornito dal King's College London.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubi centrifughe da 50 mL | Sigma-Aldrich Company Limited | CLS430829-500EA | |
| 50– 1000 & mu; Punte a L pipette | Sigma-Aldrich Company Limited | Z740031-1000EA | |
| Linea Cellulare A549 | Collezione della Cultura di Tipo Americano | ATCC CRM-CCL-185 | |
| Misuratore di flusso d'aria | N/A | N/A | Può essere utilizzato un misuratore di flusso d'aria generico. |
| Modello dell'Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI) | TSI Incorporated (tramite Copley Scientific, Regno Unito) | 0001-01-8540 | |
| Nastro indicatore autoclave | Sigma-Aldrich Company Limited | Z744090 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich Company Limited | D1306 | |
| DMEM (Eagle Medium Modificato di Dulbecco) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11966025 | |
| Alcol etilico, puro | Sigma-Aldrich Company Limited | 32221-M | Acquistato tramite Merck |
| Siero Fetale Bovino (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | A5256701 | |
| Formaldeide | Sigma-Aldrich Company Limited | F8775 | |
| HEK293T Linea Cellulare | Collezione della Cultura di Tipo Americano | ATCC CRL-3216 | |
| Armadio di biosicurezza Heraeus HERAsafe HS 12 | Erao | N/A | |
| Impattatore di Nuova Generazione | MSP, una divisione del TSI | 0170-01-1000 | Questo prodotto è anche presente nel catalogo Copley, numero di parte 5201. |
| Fotocamera monocromatica Nikon DS-Qi2 | Nikon | N/A | |
| Multiplatti trattati con cultura cellulare Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| Fiaschette trattate con colture cellulari Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 156340 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich Company Limited | P7793-1EA | |
| Penicillina-Sreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| Compresse di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Cloridrato di polietilenimina | Sigma-Aldrich Company Limited | 764965-1G | Acquistato tramite SLS |
| Atomizzatore nasale a getto di Rayleigh | Resyca BV Enschede | Adattatore per spray nasale morbido | |
| Acqua senza RNAsi | Thermo Fisher Scientific | J60610. EQC | |
| Cuvette di misura | Malvern Panalytical | ZEN0040 | |
| La cellula capillare piegata | Malvern Panalytical | DTS1070 | |
| Zetasizer Pro | Malvern Panalytical | Zetasizer Pro | |
| Software Zetasizer Ultra-Pro ZS Xplorer | Malvern Panalytical | N/A |
Riferimenti
- Akula, V. R., et al. Effect of heterologous intranasal incovacc(r) vaccination as a booster to two-dose intramuscular COVID-19 vaccination series: a randomized phase 3 clinical trial. Commun Med (Lond). 5 (1), 133(2025).
- Van Hoeve, W., et al.
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Ristampe e permessi
