Profilazione delle mutazioni del DNA del recettore del fattore di crescita epidermico nelle cellule rare circolanti utilizzando un sistema di isolamento cellulare e PCR digitale a gocce

Summary

Qui presentiamo un protocollo per illustrare l'isolamento di cellule tumorali rare da un campione artificiale contenente sangue intero e con cellule di cancro ai polmoni. Il protocollo utilizza una piattaforma di isolamento cellulare semi-automatizzata, priva di etichette. Le cellule arricchite vengono successivamente analizzate per mutazioni dei recettori dei fattori di crescita epidermici tramite PCR digitale a gocciole.

Abstract

Le mutazioni riscontrate all'interno del gene del fattore di crescita epidermico (EGFR) sono fondamentali per determinare i trattamenti più efficaci per i pazienti con cancro ai polmoni. I test di routine per le mutazioni EGFR possono assumere la forma di biopsie tumorali o analisi del ctDNA dal plasma di pazienti con cancro ai polmoni. Sebbene l'analisi dei campioni di sangue di pazienti con tumore ai polmoni venga eseguita regolarmente per fornire informazioni sulla presenza o la recidiva del tumore ai polmoni, tramite rilevamento ctDNA o CTC, di solito non comporta l'analisi molecolare successiva delle cellule catturate. La rilevazione di mutazioni individuali all'interno del gene EGFR presente nelle rare cellule tumorali circolanti (CTC) può offrire ulteriori informazioni sull'efficacia potenziale delle terapie mirate e, oltre a ciò, sulla prognosi del paziente, specialmente nel cancro polmonare non a piccole cellule (NSCLC). Purtroppo, la rarità di tali cellule tumorali circolanti e la mancanza di procedure semplificate per esaminare le loro informazioni genomiche rappresentano una sfida significativa nella rilevazione.

L'obiettivo di questo protocollo è illustrare il potenziale realistico di catturare le CTC dal sangue intero e valutarne il contenuto molecolare tramite ddPCR. Una piattaforma di isolamento cellulare semi-automatizzata, basata sulla dimensione, è stata utilizzata per catturare cellule tumorali circolanti, che sono state successivamente recuperate per analisi molecolare a valle. Per determinare la presenza di specifiche mutazioni EGFR all'interno del DNA genomico delle cellule catturate, è stata eseguita la ddPCR utilizzando saggi per EGFR pT790M ed EGFR pL858R.

Due linee cellulari separate per il cancro ai polmoni (A549 e H1975) sono state attivamente arricchite dal sangue intero e la quantificazione accurata delle mutazioni presenti nelle linee cellulari H1975 è stata eseguita tramite ddPCR.

Introduction

Con la continua ricerca traslazionale sul valore delle biopsie liquide e pubblicazioni recenti che illustrano specificamente il valore clinico del monitoraggio del ctDNA nella selezione^{terapeutica 1} , le biopsie liquide di selezione 1 stanno arrivando alla maturità. Le biopsie liquide offrono un metodo alternativo meno invasivo per il monitoraggio e la prognosi del cancro rispetto ai metodi convenzionali di biopsia tissutale. Ricerche approfondite si sono concentrate sul DNA frammentato trovato nel sangue (DNA senza cellule, cfDNA) e in particolare sul sottocompartimento derivato dal tumore, noto come DNA tumorale circolante (ctDNA). Il ctDNA è stato ampiamente studiato negli ultimi due decenni e ha dimostrato di contenere mutazioni geniche specifiche per tumori, ad esempio SNV e varianti strutturali, oltre a marcatori di metilazione e un distinto schema di frammenti rispetto al cfDNA non tumorale. Queste specifiche caratteristiche del ctDNA sono ora utilizzate per monitorare lo stato molecolare dei pazienti oncologici attraverso la diagnosi precoce, la risposta terapeutica, la malattia residua minima (MRD) e la resistenza allo stato terapeutico. Analogamente, le cellule tumorali circolanti (CTC), staccate dal sito tumorale primario nei vasi sanguigni, si sono recentemente evolute come promettenti biomarcatori la cui esistenza e quantità nel sangue hanno mostrato una stretta correlazione con la progressione della malattia e il potenziale di recidiva. Sebbene i primissimi studi iniziali sulle CTC si siano basati principalmente sull'espressione e sull'enumerazione dei marcatori^{proteici 2}, ci sono stati progressi significativi nello studio delle CTC a livello molecolare, inclusa la rilevazione di mutazioni genomiche nel recettore degli estrogeni 1 (ESR1) per il cancro al seno e il gene del fattore di crescita epidermica (EGFR) per vari tipi di tumori.

Le mutazioni EGFR sono fondamentali sia per la determinazione della patogenesi e della prognosi, sia per decidere i trattamenti più efficaci per i pazienti con cancro^{ai polmoni 3}. I test di routine per le mutazioni EGFR possono assumere la forma di biopsie tumorali solide alla diagnosi o progressione o, più recentemente, campionamento di ctDNA dal plasma di pazienti con cancro polmonare recidivante^{/refrattario 4}. Tuttavia, a differenza degli approcci basati su ctDNA, l'analisi del materiale genomico derivato dalla CTC consente una valutazione diretta delle cellule tumorali intatte e dei loro profili mutazionali. Insieme agli studi ctDNA MRD, la rilevazione di mutazioni all'interno del gene EGFR di CTC rare può fornire ulteriori comprensioni sull'efficacia potenziale dei regimi terapeutici e, oltre a ciò, sulla prognosi del paziente, specialmente nel cancro polmonare non a piccole cellule (NSCLC). La rarità dei CTC e la mancanza di protocolli semplificati che utilizzino strumenti intuitivi per le cliniche costituiscono un serio ostacolo a un'adozione più ampia. Questa limitazione evidenzia la necessità di un flusso di lavoro standardizzato e accessibile che consenta sia l'isolamento efficiente del CTC sia l'analisi molecolare a valle. Pertanto, l'obiettivo di questo studio è presentare un flusso di lavoro riproducibile per l'arricchimento delle cellule tumorali circolanti e la successiva rilevazione delle mutazioni EGFR utilizzando un approccio combinato di isolamento cellulare e PCR digitale.

Il sistema di isolamento cellulare Genesis con vetri microfluidici di cattura cellulare può catturare CTC in un processo semi-automatizzato con alta vitalità ed alta efficienza di cattura, basato sulla loro maggiore dimensione e ridotta deformabilità rispetto alla popolazione primaria di globuli bianchi e rossi ^5,6. I CTC catturati possono quindi essere recuperati dalle vetrine di cattura microfluidiche tramite flusso inverso dal vetrino per ulteriori analisi genomiche a valle. Per determinare la presenza di specifiche mutazioni EGFR all'interno del DNA genomico delle cellule catturate, è stata eseguita ddPCR su DNA genomico derivato da CTC utilizzando saggi per EGFR T790M e L858R.

Questo protocollo, che utilizza un campione modello di CTC e saggi ddPCR disponibili in commercio, è progettato per esemplificare un punto di ingresso per la rilevazione mirata di mutazioni associate al cancro nelle CTC. Questo protocollo fornisce un approccio pratico per rilevare mutazioni associate al cancro nelle cellule tumorali circolanti e potrebbe supportare ulteriori ricerche sulle applicazioni della biopsia liquida.

Protocol

Dichiarazione etica:

I campioni di sangue sono stati prelevati da fonti autorizzate per uso di ricerca, e il consenso scritto informato di tutti i donatori è stato ottenuto prima della raccolta del campione. Tutti i protocolli sperimentali relativi ai campioni di sangue umano sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Review Board di un fornitore di sangue, Discovery Life Sciences (Alabama, USA). Tutte le procedure che coinvolgevano campioni di sangue umano venivano condotte secondo gli standard etici del comitato di ricerca istituzionale e con la Dichiarazione di Helsinki.

1. Arricchimento delle cellule tumorali tramite sistema semi-automatizzato di isolamento cellulare

Nota: Questa sezione descrive l'arricchimento delle cellule tumorali circolanti (CTC) utilizzando una piattaforma semi-automatizzata di isolamento cellulare, seguito dalla rilevazione delle mutazioni EGFR tramite PCR digitale a gocce. Un campione modello di CTC viene utilizzato per dimostrare la fattibilità e si raccomanda la validazione del saggio prima dell'applicazione clinica. Sono state utilizzate due linee cellulari per il cancro polmonare non a piccole cellule (NSCLC): NCI-H1975 (mutazioni EGFR L858R/T790M) e A549 (tipo selvatico EGFR), che hanno servito come controllo negativo per la rilevazione delle mutazioni.

1. Campione di sangue
   1. Assicurati che il consenso informato sia ottenuto dai donatori di sangue/pazienti prima del prelievo. Ottenere l'approvazione dell'Institutional Review Board (IRB), dove necessario, per ricerche che coinvolgono campioni umani, incluso il sangue.
   2. Per i test di fattibilità, ottieni un campione di sangue da fornitori terzi autorizzati solo per uso di ricerca.
   3. Raccogliere sangue periferico in tubi di acido etilendediaminastraacico (EDTA) e processare il campione tramite il protocollo di arricchimento Genesis entro 48 ore.
      Nota. Per l'analisi a valle e il protocollo di arricchimento Genesis, si raccomandano tubi EDTA. Streck e tubo EDTA possono essere utilizzati per l'immunocolorazione su vetrina con protocolli di enumerazione Genesis (diretto/indiretto).
   4. Conservare i campioni di sangue raccolti in tubi EDTA a 2–8 °C fino all'utilizzo. Per l'isolamento delle cellule Genesis, non è necessario un pretrattamento e il protocollo di arricchimento può essere utilizzato sangue intero fino a 10 mL.
2. Campione modello CTC/Preparazione del campione clinico
   1. Preparare una soluzione di stock cellulare a una concentrazione di 100–1.000 cellule in un mezzo di coltura cellulare appropriato da 10 μL o in un tampone salino tamponato fosfato (PBS). Salta questo passaggio se sono in uso campioni clinici.
      NOTA: Le concentrazioni di aumento utilizzate in questo studio sono superiori ai livelli clinici tipicamente osservati di CTC e sono destinate solo a scopi dimostrativi del metodo.
   2. Aggiungere i 10 μL della soluzione di stock cellulare in un massimo di 10 mL di sangue intero da un donatore sano per preparare un campione modello di CTC. Per i campioni clinici, non includere cellule tumorali nei campioni di sangue intero dei pazienti.
   3. Mescola il campione di sangue con un volume uguale di PBS (1x) e agita delicatamente su un dondolo a temperatura ambiente fino all'uso. Se la conservazione supera un'ora, conserva a 4 °C.
3. Arricchimento CTC
   1. Accendi il sistema di isolamento delle celle Genesis e attendi l'inizializzazione del sistema. Questo può richiedere fino a 5 minuti.
   2. Posizionare il barattolo dei rifiuti alla base delle baie della stazione e fissare il tubo del barattolo dei rifiuti al barattolo dei rifiuti.
   3. Premi il tubo nella valvola di pizzicare finché non senti che si sistema a scatto, e collega il tubo del sistema Genesis all'uscita del barattolo di scarico.
   4. Esegui un Auto-Test premendo "Start" dalla schermata principale e toccando il 'Auto-test' sullo schermo.
   5. Quando il Self-Test è completato, seleziona '2.0 Kit Enrichment' dalle opzioni selezionate del protocollo.
   6. Segui le istruzioni sullo schermo, compila i campi di inserimento dati necessari e completa la procedura di Priming e Assembly. Un priming riuscito utilizzando etanolo al 70% e PBS 1x garantisce le migliori prestazioni di cattura cellulare e recupero per l'estrazione del DNA. Il primer richiede circa 20 minuti per essere completato.
   7. Assicurati che il programma di arricchimento corretto (2.0 Kit Enrichment) sia stato selezionato e che tutte le connessioni dei tubi e le posizioni delle scorre siano ben fissate prima di iniziare la riproduzione. Evitare di introdurre bolle d'aria durante il caricamento del campione, poiché ciò potrebbe influire sulla consistenza del flusso e sull'efficienza della cattura.
   8. Distribuire delicatamente il campione modello preparato dal Passo 1.2.3 (Campione CTC Modello/Preparazione del Campione Clinico) nel funnel di ingresso e continuare il protocollo di arricchimento premendo 'Riprendi' nella schermata di sistema.
   9. Quando la cattura CTC è completata, il sistema semi-automatico di isolamento delle celle chiederà all'utente di rimuovere il barattolo di scarti e di riattaccare il serbatoio di primering.
   10. Distacca il tubo del sistema Genesis dal barattolo di scarti e pipetta 4 mL di tampone di diluizione nel serbatoio di priming.
   11. Collega l'adattatore di ritorno al serbatoio di innesco e riattacca al tubo del sistema Genesis. Premi Riprendi sullo schermo per continuare il protocollo di Arricchimento. Questo rilascia le cellule catturate nel vetrino microfluidico nell'imbuto di ingresso applicando il riflusso di riatto.
   12. Raccogliere le cellule recuperate pipettando dall'imbuto di ingresso a un tubo Eppendorf da 5,0 mL. Assicurati di raccogliere tutti i campioni acquosi nel imbuto di ingresso, che spesso possono superare i 4 mL.
   13. Centrifugare il campione recuperato a 600 g per 5 minuti per pelletare le cellule catturate prima della lisi cellulare.
   14. Rimuovere con attenzione il soprandanante e procedere al protocollo di estrazione del DNA (Sezione 1.4).
4. Estrazione del DNA
   Attenzione: DNAzol BD è dannoso se entra in contatto con la pelle o viene ingerito. Evita il contatto con pelle e occhi. Usa solo in ambienti di cappe chimiche e non respirare nebbia/vapori/spray. In caso di contatto con la pelle, lava immediatamente con acqua.
   1. Aggiungi 1 mL di DNAzol BD direttamente nel tubo dal Passo 1.3.14.
   2. Trasferire l'intero volume del campione in un nuovo tubo Eppendorf DNA LoBind da 1,5 mL per microcentrifuga e scuotere vigorosamente.
   3. Incubare il tubo a temperatura ambiente per 5 minuti. Vortice vigorosamente il tubo e incuba a temperatura ambiente per almeno 4 minuti.
   4. Assicurarsi una miscelazione completa durante le fasi di lisi e precipitazione per massimizzare il recupero del DNA. Può essere incluso un trattamento opzionale con RNasi se la contaminazione da RNasi è una preoccupazione.
   5. Aggiungere direttamente 400 μL di isopropanolo alla miscela di campione di DNAzol con lisato delle cellule BD.
   6. Centrifuga il tubo a 10.000 g per 6 minuti per far precipitare il DNA.
   7. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatant e aggiungere delicatamente 0,5 mL di DNAzol BD al DNA pelletato.
   8. Vortice il tubo finché il pellet di DNA non è completamente disperso.
   9. Centrifuga la miscela a 10.000 g per 5 minuti.
   10. Rimuovere il surnante e lavare la pellet di DNA pipettando 1 mL di etanolo al 75%.
   11. Ripeti i passaggi 9–10 per un totale di due lavaggi.
   12. Rimuovi eventuali residui di etanolo sul fondo del tubo usando una micropipetta.
       NOTA: Assicurati che il pellet non diventi completamente secco.
   13. Aggiungere 20 μL di acqua deionizzata (DI) priva di DNasi-/RNasi per solubilizzare il DNA dai campioni CTC.
   14. Quantificare il DNA a doppio filamento (dsDNA) nel campione utilizzando kit/piattaforme per la quantificazione del DNA dsDNA, come Qubit 1x dsDNA High Sensitivity Assay Kit o Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis.
   15. Conservare i campioni di DNA estratti a 4 °C o -20 °C per prevenire la degradazione.
       Punto di pausa: I campioni di DNA estratti possono essere conservati a -20 °C per la conservazione a breve termine o a -80 °C per la conservazione a lungo termine prima di procedere con analisi a valle.

2. Analisi delle mutazioni EGFR tramite ddPCR

La PCR digitale è un metodo adatto per rilevare mutazioni rare con alta sensibilità e precisione. I test di rilevamento delle mutazioni ddPCR forniti in un singolo tubo includono tipicamente una sonda marcata con FAM che mira un allele mutante e una seconda sonda etichettata HEX che mira un allele di tipo selvatico.

1. Impostazione della reazione e generazione delle gocce
   1. Scongelamento ddPCR Supermix, ddPCR Rilevamento Mutazioni Analisi su ghiaccio.
   2. Vortice ogni tubo per assicurarsi che il contenuto sia omogeneo, poiché durante la conservazione a -20 °C può formarsi un gradiente di concentrazione.
   3. Centrifuga brevemente per sedimentare il contenuto sul fondo del tubo e posizionare il tubo sul ghiaccio.
   4. Prepara i campioni di DNA estratti alla concentrazione desiderata prima di preparare la miscela di reazione secondo la ricetta nella Tabella 1.
   5. Realizza un premix contenente super-mix, analisi ed enzimi di restrizione, oltre all'acqua per tutti i campioni necessari per il test e aggiungi il DNA del campione individualmente come ultimo componente di reazione. Assicurati che la concentrazione finale dei campioni di DNA sia di 50 fg–100 ng.
      Nota: Si raccomanda la frammentazione del DNA tramite digestione restrizionale prima della generazione delle goccioline per migliorare la precisione, ridurre la viscosità e migliorare l'accessibilità del modello. Si raccomanda una digestione diretta utilizzando 2–5 U di enzima di restrizione durante l'installazione della ddPCR. Per i sami di mutazione puntuale EGFR (T790M/L858R), si raccomanda MseI; consultare le schede tecniche del saggio per enzimi compatibili prima della personalizzazione. Le schede tecniche sono disponibili per il download per i singoli saghi dal portale digitale Bio-Rad (Bio-Rad Droplet Digital PCR Assays | Home)
   6. Preparare un controllo negativo per almeno un pozzo, contenente solo un template di tipo selvatico a una concentrazione simile a quella di campioni sconosciuti.
   7. Vortice i tubi di reazione per mescolarli accuratamente e centrifugare brevemente per sedimentare tutti i campioni sul fondo di ogni tubo di reazione. Lascia che i tubi di reazione si equilibrino a temperatura ambiente per 2 minuti.
   8. Carica 20 μL di ogni miscela di reazione in un pozzo campione di una cartuccia microfluidica (cartuccia DG8), seguito da 75 μL di olio per la generazione di gocce per le sonde nei pozzi petroliferi.
   9. Copri la cartuccia con una guarnizione e mettila nel generatore di gocce QX200.
   10. Premi il pulsante in cima al Generatore di Gocce per chiudere il coperchio. Quando il coperchio è chiuso, la generazione delle gocce inizia automaticamente. Questa procedura combina i campioni e l'olio all'interno dei microcanali della cartuccia microfluidica per creare un'emulsione di ~20.000 gocce delle dimensioni di un nanolitro per ogni campione.
2. Amplificazione PCR (condizioni di ciclo termico)
   1. Programma le condizioni di ciclo termico su un ciclatore termico come raccomandato nella Tabella 2
   2. Quando la generazione delle gocce è completata, tutte le luci dello strumento sono verde fisso. Apri lo strumento premendo nuovamente il pulsante del Generatore di Gocce e rimuovi il portacartucce e la cartuccia.
   3. Rimuovere la guarnizione usa e getta e aspirare 45 μL di gocce dalla cartuccia, facendo attenzione a mantenere un leggero angolo sulla punta della pipetta per evitare la defilatura delle gocce.
   4. Distribuisci le gocce nelle piastre ddPCR a 96 pozzi e sigilla la piastra con la sigillatura termica per piastre PCR utilizzando il sigillante PX1 per piastre PCR.
   5. Dopo aver sigillato la piastra a 96 pozzi contenente gocce, trasferire con cura la piastra a 96 pozzi al ciclatore termico preparato nello Passo 2.2.1 e avviare il ciclo termico.
3. Lettura delle gocce e analisi dei dati
   1. Avviare lo strumento ddPCR Droplet Reader (QX200 Droplet Reader o QX600 Droplet Reader) e un computer collegato su cui è installato e configurato il software QX Manager.
   2. Una volta completato il passaggio di ciclo termico, sposta la piastra sigillata a 96 pozzi su uno strumento Droplet Reader.
   3. Open QX Manager Software per configurare una nuova disposizione delle piastre basata su un progetto sperimentale. Clicca sulla scheda 'Aggiungi piatto' e il software attiverà il pulsante Configura Piastra (Configura Placco). Clicca su 'Configura piatta' per assegnare i dettagli del campione alla placca.
   4. Compilare i dettagli delle lastre e delle informazioni del pozzo, selezionare i pozzi, designare la condizione del campione, il tipo di esperimento, il nome o i nomi del bersaglio, il tipo/i di bersaglio e il riferimento: ch1 per FAM e ch2 per il colore HEX.
   5. Clicca su 'Applica' per caricare il pozzo e, una volta terminato, seleziona 'OK'.
   6. Quando la disposizione delle lastre è completa per tutti i campioni, seleziona 'Esegui' per avviare il processo di lettura delle gocce.
   7. Dopo l'acquisizione dei dati, selezionare i campioni nel selettore di pozzo sotto 'Analizza' e impostare la soglia appropriata per il test di rilevamento mutazione ddPCR per distinguere i segnali mutanti da quelli di tipo selvatico.
   8. Per i saggi di mutazione duplex come quelli utilizzati in questo protocollo, le soglie possono essere impostate automaticamente utilizzando le impostazioni predefinite del software QX Manager (riferimento alla figura nei risultati).
   9. In alternativa, le soglie possono essere impostate manualmente utilizzando i metodi del mirino o del lasso, assicurando che le soglie o i confini del lazo separino cluster positivi e negativi e siano posizionati in base alle posizioni dei cluster definite sia dai controlli positivi che negativi inclusi in ogni esecuzione.
      NOTA: Le soglie devono essere fissate in modo coerente tra i campioni all'interno di un lotto utilizzando controlli positivi e negativi per garantire la riproduzione delle mutazioni.
   10. La concentrazione riportata è il numero di copie per μL della reazione finale 1x ddPCR.

Results

Il sistema di isolamento cellulare Genesis con vedute di cattura cellulare microfluidiche ha isolato in media l'84% delle cellule tumorali con spiked in campioni di sangue a una concentrazione di 25–250 cellule·^mL-1 (Figura 3A). Questa elevata efficienza di cattura dimostra l'efficacia della fase di arricchimento nell'isolare cellule tumorali rare circolanti da campioni di sangue intero. L'immunocolorazione opzionale delle cellule catturate in vetri microfluidici di cattura cellulare utilizzando il protocollo di enumerazione del sistema ha dimostrato l'identificazione delle cellule rare usando due anticorpi positivi contro la citocheratina, DAPI per identificare le cellule nucleate e un anticorpo negativo contro CD45, espresso sulla maggior parte dei globuli bianchi ma tipicamente non espresso sulle CTC (Figura 3B). Questo schema di colorazione conferma l'identificazione efficace delle cellule tumorali circolanti escludendo i globuli bianchi di fondo.

I saggi di rilevamento delle mutazioni ddPCR hanno permesso l'identificazione e la profilazione delle mutazioni EGFR in cellule tumorali arricchite. Questo studio ha dimostrato la rilevazione di mutazioni del gDNA nelle cellule, inizialmente arricchite dalla piattaforma Genesis, utilizzando ddPCR e Mutation Detection Assays. I grafici ddPCR (Figura 4) delle linee di cellule tumorali A549 (tipo selvatico EGFR) e H1975 (L858R/T790M) per le due mutazioni EGFR testate hanno mostrato che ddPCR può rilevare sensibilmente mutazioni presenti nella linea cellulare H1975 dopo aver aumentato nel sangue intero e successivamente arricchito tramite la piattaforma Genesis. Segnali di mutazione positivi sono stati osservati nelle cellule H1975, mentre nessun segnale di mutazione è stato rilevato nelle cellule A549, confermando la specificità del saggio. I campioni inseriti con la linea cellulare di controllo A549 non hanno mostrato gocce presenti di mutazioni che confermano che la rilevazione di mutazioni a L858R e T790M è specificamente associata alla linea cellulare H1975. Questa dimostrazione dell'isolamento CTC sulla piattaforma Genesis, seguita da un'analisi molecolare con ddPCR, può offrire uno strumento diagnostico molecolare potente per studi di biopsia liquida e studi preclinici utilizzando campioni clinici per monitorare la progressione della malattia e il trattamento personalizzato. Nel complesso, questi risultati dimostrano che il flusso di lavoro combinato di arricchimento e ddPCR può rilevare e quantificare in modo affidabile le mutazioni EGFR nelle cellule tumorali circolanti.

Figura 1: Flusso di lavoro per la biopsia liquida per il profilo delle mutazioni del DNA EGFR nel cancro ai polmoni. (A) Illustrazione dell'eterogeneità tumorale che mostra diversi profili di mutazione EGFR rilevati tramite biopsia tissutale convenzionale e cellule tumorali circolanti (CTC) da biopsie liquide. (B) Flusso di lavoro schematico per la profilazione delle mutazioni del DNA EGFR nelle cellule tumorali circolanti tramite biopsia liquida. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Dimostrazione del profiling delle mutazioni del DNA EGFR utilizzando campioni artificiali. (A) Preparazione di un campione modello CTC tramite spiking di linee cellulari di cancro polmonare con stato di mutazione EGFR definito nel sangue intero da un donatore sano. (B) Flusso di lavoro che illustra la rilevazione delle mutazioni del DNA EGFR nelle cellule tumorali circolanti utilizzando piattaforme commerciali disponibili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Isolamento senza etichettatura e identificazione delle cellule tumorali circolanti. (A) Efficienza della cattura delle linee cellulari del cancro polmonare (A549 e H1975) inserite in campioni di sangue intero da donatori sani utilizzando una piattaforma semi-automatizzata di isolamento cellulare rare. (B) Immunocolorazione delle cellule catturate che mostrano cellule tumorali positive alla citocheratina. Barra della scala = 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Profilazione delle mutazioni EGFR tramite PCR digitale a gocce. Grafici di ampiezza bidimensionale che mostrano la rilevazione di mutazioni EGFR nelle cellule tumorali arricchite dopo la lisi cellulare e l'estrazione del DNA. Le cellule A549 (tipo selvatico) mostrano l'assenza di segnali specifici per mutazioni, mentre le cellule H1975 mostrano segnali positivi per le mutazioni EGFR L858R e T790M. Il saggio consente la rilevazione e la quantificazione sensibile delle popolazioni di DNA mutanti e di tipo selvatico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Componente	Volume per reazione (μl)	Concentrazione finale
2x ddPCR Supermix per sonde (senza dUTP)	10	1x
Primer/sonda 20x target (FAM) e wild-type (HEX)	1	1x
Enzima di restrizione, diluito (Msel)	1	2-5 U/reaction
Campione target e/o acqua priva di DNasi (NTA)	Variabile	Variabile
Volume totale	20	-

Tabella 1: Impostazione della reazione per la rilevazione di mutazioni digitali PCR basate su gocce. Composizione e concentrazioni finali dei reagenti utilizzati per rilevare rare mutazioni EGFR in campioni di DNA derivati da cellule tumorali.

Passo del ciclo termico*	Temperatura	Tempo	Velocità di rampa	Numero di cicli
	(ºC)		(ºC/sec)
Attivazione enzimatica	95	10 min	2	1
Denaturazione	94	30 secondi	2	40
Ricottura/estensione	55	1 minuto	2	40
Disattivazione enzimatica	98	10 min	2	1
Raffreddamento	4	30 min	2	1
Hold (opzionale)	4	∞ (infinito)	1	1
Usa un coperchio riscaldato impostato a 105ºC e imposta il volume del campione a 40μl per il C1000 Touch Thermal Cycler con modulo di reazione a 96 pozzi profondi.

Tabella 2: Condizioni di ciclo termico per l'amplificazione digitale PCR. Parametri di ciclo termico utilizzati per l'amplificazione dei bersagli di mutazione EGFR utilizzando un termociclatore con modulo di reazione a 96 pozzi.

Discussion

La presenza di cellule tumorali circolanti nel sangue di pazienti con tumori solidi è stata oggetto di indagine per oltre 60 anni^ed è stata riconosciuta come biopsia liquida primaria da prima della loro prima inclusione nel periodo collettivo nel 2010^. Tuttavia, le CTC sono rare e difficili da isolare selettivamente dal sangue^{intero 9}. Esistono tuttavia numerosi metodi per catturare e arricchire i CTC, come illustrato dalle seguenti^{revisioni 10,11}, che coprono approcci fisici/microfluidici così come metodi di selezione dei marcatori della superficie cellulare. Molti di questi metodi richiedono tempo, richiedono molto lavoro e spesso coinvolgono più fasi/sistemi per raggiungere la selettività richiesta.

La cattura delle CTC dal sangue intero in questo protocollo dipende dalla loro dimensione (> 8 μm) e dall'assenza di deformità nello sfondo dei globuli rossi e bianchi fenotipicamente normali che passano attraverso i pori microfluidici all'interno delle vetrine di cattura cellulare microfluidica. Pertanto, il corretto carico del campione, il corretto primer a vetrina e la prevenzione dell'ostruzione sono passaggi fondamentali per mantenere l'efficienza della cattura e il recupero del campione.

Perché il flusso di lavoro abbia successo, la gestione dei campioni di sangue è il fattore chiave; garantire che il sangue fresco venga utilizzato per la lavorazione dei campioni e mantenere le corrette condizioni di trasporto e conservazione per prevenire l'emolisi. La degradazione dei globuli rossi o dei globuli bianchi influenzerà rispettivamente la qualità della cattura del CTC e la sensibilità nella rilevazione di eventuali varianti genomiche rare. Se si osservano emolisi, coagulazione o degrado visibile del campione, il campione non dovrebbe essere elaborato, poiché queste condizioni possono ridurre il recupero del CTC e la sensibilità al rilevamento delle mutazioni a valle.

Poiché i CTC possono essere presenti a livelli inferiori a 1 CTC ogni 10 milioni di globuli bianchi nel sangue intero, è essenziale catturare il volume più grande possibile per l'arricchimento. Le vetri microfluidiche possono contenere 10 mL di sangue in linea con i tubi standard di raccolta del sangue come Streck ed EDTA, che tipicamente contengono ~7,5–10 mL di sangue. Una riduzione del volume sanguigno raccolto influenzerà direttamente la sensibilità alla cattura del CTC e la successiva rilevazione delle varianti genomiche. Ottenere volumi oltre questa routine dai pazienti in trattamento può essere una sfida sia clinica che etica. Oltre ad aumentare il volume di oltre 10 ml o a utilizzare campioni diagnostici di leucaforesi per aumentare le popolazioni di globuli globuli (^{WBC/CTC) 12}, aumentare la sensibilità con volumi maggiori è attualmente fuori dalla portata della piattaforma Genesis.

Il protocollo è stato eseguito come indicato nella SOP standard ma con cura per garantire il prelievo di sangue fresco, una miscelazione completa di EDTA con il sangue al prelievo e una conservazione accurata del sangue prelevato prima dell'uso, illustrando il potenziale di questo protocollo in un contesto clinico dove le procedure operative standard di routine sono valorizzate. Tuttavia, poiché questo protocollo è stato dimostrato utilizzando campioni artificiali, è necessaria la validazione con campioni clinici di pazienti prima dell'implementazione clinica di routine.

La sensibilità nella rilevazione delle mutazioni all'interno di una popolazione CTC dipende sia dalla presenza di CTC all'interno di un campione standard di sangue intero sia dalla successiva rilevazione di mutazioni somatiche all'interno di quella popolazione CTC, che dipende dalla frequenza della mutazione nella sottopopolazione CTC. Questi due fattori di confusione limiteranno infine la sensibilità complessiva nella rilevazione delle mutazioni in una popolazione catturata con CTC; avendo un impatto maggiore nei campioni di diagnosi precoce rispetto ai campioni in stadio avanzato che probabilmente presentano conteggi CTC più alti e popolazioni CTC mutanti più elevate.

Gli attuali studi di biopsia liquida basata sul sangue sono fortemente orientati verso il DNA tumorale circolante presente nel plasma come indicazione della presenza tumorale. Tipicamente, la rilevazione del ctDNA si basa sulla presenza di marcatori genomici specifici per tumori, ad esempio SNV, varianti strutturali, MSI-H, TMB e CGP. I CTC, come biomarcatore meno utilizzato ma altrettanto valido nella biopsia liquida, sono noti per essere trasferiti nel flusso sanguigno a causa della crescita e della metastatizzazione di^tumori. L'analisi delle CTC si concentra principalmente sui marcatori superficiali cellulari utilizzati per la loro cattura o per la validazione post-cattura, utilizzando pannelli di anticorpi consolidati o personalizzati, ad esempio pan-Citocheratina, Vimentina, PD-L1, EpCAM, ecc. Al contrario, l'analisi molecolare delle CTC è limitata nell'adozione a causa delle difficoltà nell'arricchire e catturare selettivamente le CTC dal sangue totale, seguite da un'analisi precisa della sottopopolazione delle CTC. L'attuale metodo utilizza un flusso di lavoro standardizzato che incorpora protocolli consolidati per la cattura del CTC seguito da un'analisi molecolare tramite ddPCR con sagaggi standard per mutazioni genomiche patologicamente rilevanti note in campioni di sangue intero artificiali. Questo approccio è significativo perché consente la profilazione delle mutazioni direttamente da CTC arricchiti, a complemento degli approcci di biopsia liquida basati su ctDNA plasmatico.

Utilizzando l'approccio attuale, è possibile indagare le rare CTC catturate sia per la loro presenza nel sangue totale sia per la presenza di marcatori genomici patologicamente rilevanti all'interno della popolazione CTC. Gli studi hanno dimostrato il valore di valutare sia il profilo ctDNA dei pazienti con cancro sia il serbatoio CTC che circola in parallelo al ctDNA¹³, con la valutazione di entrambe le fonti di mutazioni che amplia il panorama molecolare complessivo dei singoli pazienti. Ciò ha il potenziale per lo sviluppo di paradigmi di test patologici all'interno dell'ambito iniziale della ricerca traslazionale, ma in ultima analisi in un contesto clinico. Il nuovo paradigma incorporerebbe sia la presenza di CTC come indicazione della presenza/progressione del cancro sia mutazioni patologiche presenti all'interno delle cellule catturate da CTC, potenzialmente indicando espansione clonale o resistenza^{terapeutica 14}. L'implicazione di ciò è che lo sviluppo di metastasi ed espansione clonale, seguita dalla successiva resistenza ai farmaci, potrebbe essere monitorato sia a livello di ctDNA che a livello di CTC in concerto, influenzando direttamente la scelta della terapia in stadio avanzato del cancro.

Le applicazioni future potrebbero includere l'adattamento di questo flusso di lavoro a ulteriori mutazioni associate al cancro e il test delle sue prestazioni su campioni clinici longitudinali.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Genesis Cell Isolation System	Bio-Rad Laboratories	12019822	Strumento (indicato come "sistema di isolamento cellulare semi-automatico")
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864002	Strumento
QX200 Droplet Reader o QX600 Droplet Reader	Bio-Rad Laboratories	1864003 o 12013328	Strumento (indicato come "strumento Droplet Reader")
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad Laboratories	1814000	Strumento
C1000 Touch Thermal Cycler con modulo reazione a pozzetto profondo da 96	Bio-Rad Laboratories	1851197	Strumento
Qubit 4 Fluorometro	Thermo Fisher Scientific Inc.	Q33226	Strumento
Celselect Slides			Consumabile (indicato come Microfluidic Cell Capture Slides)
Celselect Slides Enrichment Kit 2.0	Bio-Rad Laboratories	17009455	Consumabile
DNAzol BD	Molecular Research Center, Inc.	DN129	Reagente
Enzima di restrizione MseI	New England Biolabs	R0525S	Reagente
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR T790M	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010019	Assay
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR L858R	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010021	Assay
Kit Qubit 1X dsDNA High Sensitivity Assay	Invitrogen	Q33230	Kit di assay
Cartucce DG8 per QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864008	Consumabile
Olio per generazione di goccioline per sonde	Bio-Rad Laboratories	1863005	Consumabile
Olio per generazione di goccioline automatizzato per sonde	Bio-Rad Laboratories	1864110	Consumabile (opzionale)
ddPCR Supermix per sonde (senza dUTP)	Bio-Rad Laboratories	1863023	Reagente
Sigillo per piastra PCR a calore	Bio-Rad Laboratories	1814040	Sigillo in pellicola forabile
Tubi per microcentrifuga LoBind per DNA, 1,5 ml	Eppendorf	022431021	Consumabile
Piastre ddPCR a 96 pozzetti	Bio-Rad Laboratories	12001925	Consumabile