Metodo di co-coltura tridimensionale per lo studio delle interazioni indirette tra diversi tipi cellulari attraverso una membrana basale ricostituita

Summary

Questo articolo descrive un metodo semplice per la co-coltura tridimensionale di due tipi cellulari separati da una membrana basale ricostituita che richiede poca attrezzatura specializzata e può essere facilmente analizzata tramite una varietà di tecniche sperimentali.

Abstract

La co-coltura tridimensionale (3D) è una tecnica in rapida evoluzione per i ricercatori che desiderano studiare accuratamente le interazioni cellula-cellula utilizzando esperimenti in vitro . I limiti della coltura cellulare monostrato, incluse interazioni limitate tra l'ambiente cellulare ed extracellulare e la morfologia cellulare disturbata, vengono affrontati simulando l'ambiente cellulare in vivo . Utilizzando un'impalcatura per fornire supporto strutturale e includendo componenti della matrice extracellulare biologicamente attiva, le colture 3D mostrano comportamenti e morfologie più coerenti con i tessuti. Incorporare molteplici tipi cellulari in questo tipo di ambiente 3D permette lo studio delle interazioni cellula-cellula all'interno di un sistema modello biomimetico. È emersa una vasta gamma di tecnologie di co-cultura 3D, ognuna con i propri vantaggi e sfide. Spesso queste tecnologie richiedono attrezzature specializzate, un allestimento complesso o conoscenze tecniche specifiche. Inoltre, esistono alcuni metodi standardizzati per studiare le interazioni indirette tra cellule tra due tipi cellulari separati da una membrana basale ricostituita. Qui descriviamo un metodo di co-coltura 3D che richiede solo competenze tecniche fondamentali e utilizza materiali più ampiamente applicabili per riprodurre con successo le interazioni indirette cellula-cellula attraverso una membrana basale. Un monostrato di cellule è ricoperto da uno strato di matrice extracellulare, sotto forma di Matrigel, e un secondo tipo cellulare viene seminato sopra. La co-cultura risultante viene mantenuta per cinque giorni, momento in cui le cellule vengono analizzate per variazioni morfologiche tramite immunofluorescenza o estratte dalla co-coltura per analisi genomiche, trascrittomiche o proteomiche più dettagliate. Questo protocollo è ideale per studiare l'impatto della comunicazione cellula-cellula sul comportamento cellulare quando il contatto fisico è vietato da una membrana basale. Man mano che i ricercatori continuano a optare per metodi di coltura cellulare più rilevanti per la vita in vivo, è necessario un approccio più snello per evitare alte barriere all'ingresso.

Introduction

La coltura cellulare in vitro è una tecnica di ricerca robusta, rapida e ampiamente utilizzata. Sebbene i metodi tradizionali di coltura cellulare siano potenti, differiscono notevolmente da un ambiente in vivo. La natura spazialmente limitata della coltura cellulare monostrato porta a cambiamenti nell'espressione genica, nella morfologia e^{nella biochimica 1,2,3}. Le tecniche di coltura tridimensionale (3D) affrontano questa disparità, poiché le cellule vengono sviluppate in un impalcatura che simula la matrice extracellulare (ECM) presente in organi e tessuti. Nella coltura 3D, le cellule mostrano morfologia e comportamento più simili a quelli osservati in vivo ^4,5 Tuttavia, la coltura 3D da sola non ricapitola completamente i molti componenti di un microambiente in vivo perché manca di contributi da altri tipi^{cellulari 6}.

Le interazioni dirette (contatto tra cellule) e indirette tra cellule giocano un ruolo fondamentale nel comportamento delle cellule in vivo ^7,8. Ricapitolare queste interazioni richiede modelli di co-coltura 3D, in cui più tipi cellulari vengono coltivati insieme in un ambiente 3D. Utilizzando queste tecniche, si può stabilire in vitro un ambiente di crescita simile a quello in vivo, migliorando la rilevanza biologica dei^{risultati 9,10}. Tuttavia, più l'ambiente richiesto per un determinato esperimento è specifico, più la metodologia diventa complessisa. Manca un sistema modello standardizzato che possa essere utilizzato per studiare le interazioni cellulari tra cellule separate da una matrice di membrana basale. In quanto tale, questo protocollo è stato progettato per simulare le interazioni cellula-cellula che avvengono attraverso una matrice di membrana basale in modo robusto e riproducibile. Adattata da un modello di coltura 3D precedentemente^consolidato, la tecnica utilizza uno strato di Matrigel, d'ora in poi denominato gel ECM, per separare fisicamente due diversi tipi cellulari in coltura permettendo al contempo il passaggio dei fattori secreti. Era stato originariamente progettato per studiare l'impatto indiretto degli adipociti sulle cellule del cancro mesenchimale al seno, ma può essere facilmente modificato per accogliere una varietà di tipi cellulari. Bisogna considerare con attenzione se questo metodo sia appropriato per un determinato disegno sperimentale. Questo metodo non consente un'interazione diretta cellula-cellula e dovrebbe quindi essere limitato alla modellazione di scenari in vivo che coinvolgono la comunicazione indiretta tra cellule attraverso una matrice di membrana basale. Ad esempio, questo sistema non sarebbe ideale per modellare le interazioni tra le cellule T citotossiche e le cellule tumorali, poiché comunemente interagiscono direttamente. Consideriamo invece scenari biologici in cui una membrana basale separa naturalmente i due tipi cellulari di interesse. Ad esempio, questo metodo potrebbe essere applicato allo studio delle interazioni tra cellule tumorali e cellule endoteliali vascolari prima dell'intravasazione.

Un metodo alternativo comune di co-cultura 3D prevede l'uso di chip microfluidici specializzati, o "organ-on-a-chip (OoC)". I sistemi OoC sono potenti e possono essere adattati a singoli esperimenti, ma richiedono tempo e risorse significativi dedicati alla progettazione dei chip, alla selezione dei materiali, alle apparecchiature periferiche, all'ottimizzazione e alla raccolta^{dati 12,13}. Inoltre, attualmente non esiste un materiale o un metodo standard che possa fornire i segnali biologici e fisici della matrice della membrana basale senza interferire con il flusso^{microfluidico 14}. Pertanto, applicare la tecnologia OoC agli studi delle interazioni cellula-cellula attraverso la membrana basale presenta ulteriori sfide. Il metodo descritto in questo protocollo mira a offrire un'alternativa standardizzata che mantenga rilevanza e accessibilità biologica.

Protocol

Questo protocollo (Figura 1A) delinea un sistema di co-coltura 3D progettato per riprodurre le interazioni cellula-cellula attraverso una matrice di membrana basale. L'analisi a valle è possibile utilizzando microscopia confocale (Figura 1B) o prelevando cellule all'interno della co-coltura (Figura 1C). Utilizzando una costruzione a 'sandwich', in cui uno strato di gel ECM è incastonato tra due popolazioni cellulari, il protocollo non richiede apparecchiature specializzate e può essere eseguito con conoscenze fondamentali delle tecniche moderne di coltura cellulare.

1. 3D Preparazione alla co-cultura

NOTA: Il protocollo descritto è inteso come un'applicazione rappresentativa del metodo della co-coltura 3D utilizzando adipociti 3T3-L1 e cellule di cancro al seno MDA-MB-231. L'uso di diversi tipi cellulari richiederà l'ottimizzazione della densità di semina cellulare e il pre-test dei lotti di gel ECM per garantirne l'efficacia. Questo protocollo prevede l'uso di un controllo senza adipociti e di un controllo condizionato dei media. Potrebbero essere necessari più controlli a seconda dell'obiettivo sperimentale.

1. Coltura cellulare e preparazione della soluzione
   1. Acquisire e stabilire colture di pre-adipociti 3T3-L1 e linee cellulari di cancro al seno MDA-MB-231. Coltivare e mantenere indipendentemente tutte le cellule utilizzando la tecnica asettica in un armadietto di sicurezza biologica di classe II e metodi standard di coltura cellulare^{aderente 15}. Mantenere cellule 3T3-L1 nel Modified Eagle Media (DMEM) di Dulbecco, integrate con siero neonatale al 10% (v/v) e 1% di Penicillin-Streptomycina (10.000 U/mL). Mantenere le cellule MDA-MB-231 in RPMI 1640 integrate con siero bovino fetale al 10% (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (10.000 U/mL).
      NOTA: Non permettere mai alle cellule 3T3-L1 di superare l'80% di confluenza durante la manutenzione e non utilizzare colture oltre il numero del 20^° passaggio.
   2. Acquisire o preparare una soluzione stock di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na_{2HPO 4}, 1,8 mM_{KH 2}PO₄, pH 7,4.
   3. Prepara 50 mL di soluzione di lavaggio PBS-glicina aggiungendo 0,375 g di glicina a 50 mL di PBS per una concentrazione finale di glicina di 100 mM. Conserva la soluzione a 4 °C per un massimo di 12 mesi.
   4. Prepara 10 mL di tampone di permeabilizzazione aggiungendo 50 μL di Triton X-100 a 9,5 mL di PBS. Riempi fino a 10 mL per una concentrazione finale dello 0,5% (v/v) Triton X-100. Conserva a 4 °C e usa entro 1 mese.
   5. Prepara 50 mL di tampone di immunofluorescenza (IF) aggiungendo 50 μg di albumina sierica bovina (BSA), 100 μL di Triton X-100 e 25 μL di Tween-20-45 mL di PBS. Riempi fino a 50 mL per una concentrazione finale di 0,1% (v/v) BSA, 0,2% (v/v) Triton X-100 e 0,05% (v/v) Tween-20. Conserva a 4 °C e usa entro 1 mese.
   6. Prepara 10 mL di tampone bloccante aggiungendo 1 mL di siero animale a 9 mL di tampone IF per una concentrazione finale del 10% di siero. Conserva a 4 °C e usa entro 1 mese.
      NOTA: L'identità della specie del siero dipende dalla specie ospite degli anticorpi fluorescenti secondari utilizzati (vedi 2.2.4).
   7. Scongelare il gel ECM (concentrazione totale di proteine ~9-9,5 mg/mL) a 4 °C durante la notte. Preparare aliquote da 500 μL in tubi micro-centrifughe da 1,5 mL e conservare a -20 °C.
      NOTA: Il gel ECM è altamente variabile e deve essere verificato per indurre il comportamento atteso in ciascun tipo cellulare. Tipi cellulari diversi possono richiedere concentrazioni proteiche differenti o rigidità della matrice.
      NOTA: Utilizzare sempre punte e contenitori di pipette pre-raffreddati quando si maneggia il gel ECM per evitare la polimerizzazione a temperatura ambiente. Tieni sempre il gel ECM sul ghiaccio durante la manipolazione.
2. Differenziazione degli adipociti
   1. Semina da 50.000 a 80.000 pre-adipociti 3T3-L1 in 0,5 mL di mezzo di crescita standard in 2 pozzi di una lama a 4 pozzi. I pozzi vuoti saranno utilizzati per il controllo senza adipociti e per i mezzi condizionati.
      NOTA: Le colture cellulari a vetrina in camera sono soggette a interruzioni meccaniche. Evita l'aspirazione a vuoto del mezzo e utilizza una tecnica delicata di pipettatura con i pipettori manuali.
   2. Semina da 50.000 a 80.000 pre-adipociti 3T3-L1 in 0,5 mL di mezzo di crescita standard in un singolo pozzo di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzi. Questo verrà utilizzato per raccogliere i mezzi condizionati per il controllo del mezzo condizionato.
   3. Permette a entrambe le culture di raggiungere il 100% di confluenza in 24 ore.
   4. Iniziare l'adipogenesi sostituendo il mezzo di crescita con un mezzo di inizio dell'adipogenesi, composto da DMEM integrato con FBS al 10%, 0,5 mM di 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) e 1 μM dexametasone. Incubare le cellule per 48 ore a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ .
   5. Dopo 48 ore, sostituire il substrato esaurito con un nuovo mezzo di progressione dell'adipogenesi, composto da DMEM con FBS al 10% e 10 μg/mL di insulina. Incubare le cellule per altre 48 ore a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ .
   6. Prima di proseguire con la co-coltura 3D, confermare visivamente la presenza di gocce lipidiche nel >60% delle cellule. Se l'accumulo di gocce lipidiche è lento, sostituire il substrato di progressione con DMEM integrato con FBS al 10% e monitorare il contenuto lipidico ogni 24 ore.
3. Sovrapposizione e mantenimento della co-cultura 3D
   1. Scongelare il gel ECM a 4 °C durante la notte prima di continuare con la sovrapposizione.
      NOTA: Per evitare effetti di variabilità da lotto a lotto, si raccomanda di utilizzare lo stesso lotto di gel ECM per tutti gli esperimenti all'interno di un singolo studio.
   2. Dopo la differenziazione riuscita dei 3T3-L1, rimuovere il materiale colturale esaurito, lasciando un piccolo buffer di ~50 μL di mezzo.
   3. Aggiungere con attenzione 110 μL di gel ECM a ciascun pozzo contenente adipociti del vetrito della camera, facendo attenzione a non disturbare il monostrato di adipociti.
      NOTA: Il gel ECM si solidifica rapidamente a temperatura ambiente. Per evitare una polimerizzazione prematura della matrice, tieni sempre il gel ECM sul ghiaccio e usa punte pre-raffreddate a -20°C.
   4. Aggiungere 110 μL di gel ECM al pozzo di controllo vuoto senza adipociti. Per garantire una distribuzione uniforme di Matrigel, aggiungi la discesa a caduta negli angoli del pozzo e al centro. Usa la punta della pipetta per distribuire delicatamente il Matrigel sulla superficie della coltura senza raschiare.
   5. Incubare il vetrino per 1 ora a 37 °C per permettere al gel ECM di polimerizzarsi.
   6. Durante questa fase di incubazione, raccogliere e contare le cellule di MDA-MB-231
      OPZIONALE: Vedi il passo 1.4 per i dettagli sulla marcatura fluorescente di queste cellule.
   7. Prepara una sospensione diluita di cellule MDA-MB-231 a 30.000 cellule/mL in un mezzo di crescita mammaria contenente gel ECM (v/v) al 2%.
      NOTA: La densità ottimale di semina delle cellule varia tra i tipi cellulari e deve essere ottimizzata prima della sperimentazione. NOTA: Il mezzo di crescita mammaria è un mezzo di coltura cellulare disponibile in commercio, ottimizzato per cellule epiteliali mammarie. Contiene lo 0,4% estratto di ipofisi bovina, 10 ng/mL di fattore di crescita epidermica (umano ricombinante), 5 μg/mL di insulina (umano ricombinante) e 0,5 μg/mL di idrocortisone. Il mezzo di co-coltura deve essere scelto con cura per soddisfare le esigenze di entrambi i tipi cellulari.
   8. Una volta polimerizzato il gel ECM, aggiungere delicatamente 450 μL di sospensione MDA-MB-231 in ciascun pozzo. Questo porta a un conteggio totale di 13.500 cellule per pozzo.
      NOTA: Una sovrapposizione irregolare della sospensione cellulare sopra il gel è possibile in questa fase. Valuta visivamente i lati della camera e batti delicatamente su tutti i lati per distribuire uniformemente.
   9. Alla coltura degli adipociti sulla piastra a 24 pozzi, aggiungere 450 μL di mezzo di crescita mammaria contenente gel ECM (v/v) al 2%. Raccogli e cambia il substrato ogni 48 ore.
   10. Mantenere la co-cultura per un massimo di 5 giorni, con cambiamenti di media ogni 48 ore.
       NOTA: Evita l'aspirazione nel vuoto e usa una pipettura delicata. Il distacco del gel ECM è un possibile problema che può sorgere durante il mantenimento della co-coltura.
   11. Solo per il mezzo condizionato per il pozzo di controllo, diluire gli adipociti raccolti (dal passo 1.3.9) ha condizionato il mezzo 1:1 con substrato fresco prima di sostituire il substrato esaurito di co-coltura nei giorni 2 e 4.
       NOTA: A questo punto, il periodo di co-coltura è terminato e deve essere analizzato o fissando e colorando le colture per accertare morfologia ed espressione dei marcatori ( vedi sezione 2) oppure estraendo cellule dall'ambiente di co-coltura e preparando le cellule per l'analisi a valle (vedi sezione 3).
4. Etichettatura delle celle fluorescenti (Opzionale)
   NOTA: L'etichettatura delle cellule sovrapposte può essere effettuata prima dello step 1.3.7 per aiutare a identificare le cellule sovrapposte durante la cattura dell'immagine immunofluorescente.
   1. Prepara una soluzione stock da 5 mM di Succinimidile Estere di Diacetato di Carbossifluoresceina (CFSE) dissolvendo 10 mg di CFSE in 4,22 mL di DMSO. Conserva aliquote da 500 μL a -20 °C, protette dalla luce.
   2. Dopo aver contato le cellule dal passo 1.3.6, lava le cellule una volta con 5 mL di PBS. Risospendere il pellet risultante in 1x PBS fino a una concentrazione finale di 1.000.000 di cellule/mL.
   3. Aggiungere 1 μL di 5 mM di CFSE per mL di sospensione cellulare per ottenere una concentrazione finale di lavoro di 5 μM. Incubare la sospensione cellulare per 20 minuti a temperatura ambiente, protetta dalla luce.
   4. Tempre la colorazione CFSE aggiungendo 5 volumi di mezzo di coltura. Incuba altri 5 minuti a temperatura ambiente.
   5. Cellule di pellet e lavare due volte con PBS per rimuovere il residuo di CFSE. Sospendere le cellule in un mezzo di crescita mammaria preriscaldato. Incubare per altri 10 minuti a temperatura ambiente per assicurarsi che non rimanga alcun colorante.
   6. Seme le cellule marcate fluorescentmente come descritto nel passo 1.3.7. Il resto del protocollo può essere eseguito come descritto.

2. Immunofluorescenza

1. Fissazione
   NOTA: Per evitare la depolimerizzazione del gel ECM e la perdita di campioni durante il lavaggio, lascia che tutti i reagenti si equilibrino alla temperatura ambiente per ~30 minuti prima dell'uso.
   1. Dopo 5 giorni di co-cultura, sostituire il substrato con 500 μL di PBS.
      NOTA: I passaggi 2.1.2 a 2.3.7 possono essere eseguiti in condizioni non sterili.
   2. Rimuovere il PBS e sostituirlo con il 2% di paraformaldeide (PFA) in PBS (preparato fresco) a temperatura ambiente per 10 minuti.
      NOTA: Il gel ECM è sensibile alla PFA e può portare al distacco dello strato di gel.
      ATTENZIONE: Il PFA si decompone in formaldeide col tempo. Evitare l'inalazione di fumi, garantire una ventilazione adeguata e indossare sempre l'attrezzatura di protezione individuale adeguata (ad esempio, guanti, camice da laboratorio, protezione per gli occhi) quando si tratta di PFA.
   3. Rimuovere il PFA e lavare i pozzi con 500 μL di soluzione di lavaggio PBS-Glicina per 15 minuti a temperatura ambiente con una leggera agitazione.
      NOTA: L'uso del lavaggio PBS-Glicina è fondamentale per prevenire che le aldeidi libere producano fluorescenza di fondo. Non lavare in PBS senza glicina.
   4. Ripeti il passo 2.1.3 due volte per un totale di tre lavaggi. Vedi 2.1.5 per le condizioni di archiviazione, saltare al passo 2.2.2 se non necessario.
   5. A questo punto, il protocollo può essere sospeso fino a 1 settimana e il vetrino può essere conservato a 4 °C. Per conservare il vetrino, riempire tutti i pozzi con 1 mL di PBS e sigillare il coperchio del vetrino della camera con un sottile nastro di parafilm. Posiziona il vetrino piatto in un contenitore impermeabile, sopra un tessuto delicato bagnato per evitare che le colture si secchino.
2. Colorazione degli anticorpi
   1. Porta le vetrine già conservate a temperatura ambiente, rimuovi il PBS e lava i pozzi con 500 μL di PBS fresco per 15 minuti con una delicata agitazione. Salta questo passaggio se continui direttamente dal passo 2.1.4.
   2. Permeabilizzare le celle con 500 μL di tampone di permeabilizzazione per 15 minuti a temperatura ambiente senza agitazione.
   3. Lavare i pozzi con 500 μL di PBS, con 15 minuti di agitazione delicata. Ripeti due volte per un totale di 3 lavaggi.
   4. Aggiungi 500 μL di tampone bloccante a ciascun pozzo e incuba per 1 ora a temperatura ambiente con una delicata agitazione.
      NOTA: Assicurarsi che la specie sorgente del siero nel buffer bloccante corrisponda alla specie ospite dell'anticorpo secondario. In questo protocollo, utilizziamo il siero dell'asino e gli anticorpi secondari dell'asino.
   5. Diluire gli anticorpi primari di interesse nel tampone IF, secondo le raccomandazioni del produttore. Rimuovere il tampone bloccante e aggiungere 300 μL di soluzione anticorpale diluita in ciascun pozzo.
   6. Sigilla il coperchio della lama con parafilm e posiziona il vetrino in un contenitore a prova di luce. Incubare durante la notte a 4 °C con agitazione delicata.
   7. Lavare i pozzi con 500 μL di tampone intermittente, con 15 minuti di agitazione delicata. Ripeti due volte per un totale di 3 lavaggi.
   8. Diluire l'anticorpo secondario fluorescente appropriato nel buffer IF, secondo le raccomandazioni del produttore. Aggiungere 300 μL di diluizione secondaria degli anticorpi a ciascun pozzo e incubare per 1 ora a temperatura ambiente con una leggera agitazione.
      NOTA: Evitare esposizioni prolungate alla luce dopo questo passaggio per limitare il fotosbiancamento.
   9. Ripeti il passo 2.2.7.
   10. Diluire una soluzione stock a 300 μM di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) 1:800 in PBS. Aggiungi 300 μL in ogni pozzo e incuba per 20 minuti, a temperatura ambiente, con una leggera agitazione.
   11. Lavare le cellule con 500 μL di PBS per 5 minuti con una delicata agitazione. Ripeti una volta.
3. Montaggio a carrello
   1. Rimuovi quanta più PBS residua possibile senza disturbare le colture. Sostituisci il coperchio e separa la camera dalla lamina in vetro usando lo strumento fornito dal produttore della slitta.
   2. Utilizzando un fazzoletto delicato, pulisci i bordi del vetrino per rimuovere residui di PBS senza disturbare il gel ECM.
   3. Applica lentamente il sigillante al silicone intorno ai bordi del carrello usando una siringa e un ago da 18G. Lascia 3 minuti affinché il silicone si solidifichi.
   4. Mentre il silicone si solidifica, aggiungi 1-2 gocce di materiale antifade in ciascun pozzo. Evita le bolle. Se si formano bolle, usa una pipetta per rimuoverle con cura senza danneggiare la coltura.
   5. Dopo che il silicone si è indurito, abbassa delicatamente un antiletto-vetro con un angolo ridotto. Usa pinze o punta di pipetta per espellere le bolle d'aria mentre la copertura viene abbassata. Usa una pressione delicata per evitare di rompere la copertura.
   6. Metti il vetrino in un contenitore a prova di luce a temperatura ambiente e lascialo riposare tutta la notte. Il vetrino può quindi essere conservato a 4 °C e il protocollo è sospeso fino a 1 settimana.
      NOTA (Opzionale): Per sigillare meglio i slide, applica dello smalto trasparente sui bordi del coperchio 1 ora dopo il coperchissone.
   7. Vetri immagine usando un microscopio confocale a fluorescenza a ingrandimento 10-20x. Cattura cinque campi visivi casuali per minimizzare il bias dell'operatore.

3. Raccolta di co-colture per analisi a valle

NOTA: La raccolta di cellule o biomolecole è incompatibile con l'immunofluorescenza. Si raccomanda di coltivare co-colture destinate ad altre analisi a valle in piatti standard di coltura a 24 pozzi utilizzando le stesse concentrazioni cellulari e volumi descritti nelle sezioni 1 e 2.

1. Estrazione cellulare
   1. Rimuovi i materiali esausti e lava delicatamente i pozzi con PBS ghiacciato. Ripeti una volta per un totale di due lavaggi.
   2. Utilizzando una punta a pipetta a grande diametro, aggiungi 1 mL di soluzione di recupero a celle gelate, d'ora in poi chiamata soluzione di recupero. Pipetta delicatamente su e giù per disturbare lo strato di gel ECM. Trasferire liquido in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
      NOTA: La soluzione di recupero cellulare è una soluzione non enzimatica disponibile in commercio progettata per liberare delicatamente le cellule incorporate nel gel ECM. È una composizione proprietaria e può essere incompatibile con alcuni tipi di cellule. In alternativa, si può considerare la depolimerizzazione enzimatica del gel ECM utilizzando proteinasi delicate come Dispase o Accutasi. Questo richiederà incubazioni a 37 °C insieme all'ottimizzazione del tempo di incubazione.
   3. Aggiungere 250 μL di soluzione di recupero gelata in ogni pozzo per raccogliere eventuali cellule rimanenti. Trasferisci nel tubo corrispondente della microcentrifuga.
   4. Inverti i tubi 4-5 volte per mescolare.
   5. Trasferire i tubi sul ghiaccio e incubare per 60 minuti con una leggera agitazione. Ogni 10 minuti, inverti i tubi 2-3 volte per evitare che i contenuti dei tubi si sedimentino.
   6. Tubi centrifughe a 300 x g per 5 min a 4 °C
   7. Verifica la presenza di un pellet cellulare visibile. Rimuovere con attenzione il surnatante e aggiungere 1 mL di PBS 1x gelato. Centrifuga a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Ripeti una volta per un totale di due lavaggi. Aspettatevi che il pellet contenga l'80-90% delle cellule inizialmente seminate, mantenendo le proporzioni di ciascun tipo di cellula costanti.
      NOTA: A questo punto, la pellet cellulare può essere lisata per raccogliere proteine o acidi nucleici. I pellet lisati possono essere conservati a -80 °C e il protocollo può essere sospeso per 3 mesi. La lisi è incompatibile con la 3.2.
2. Preparazione della sospensione a singola cella
   1. Risospendere il pellet in 200 μL di tripsina-EDTA allo 0,25%. Poi, incuba a 37 °C per 3-4 minuti.
   2. Aggiungere 600 μL di mezzo di crescita completo per temprare la digestione della tripsina.
   3. Centrifuga a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 μL di PBS a temperatura ambiente.
   4. Centrifuga a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Ripeti una volta per un totale di due lavaggi.
   5. Risospendere il pellet in 80 μL di PBS con 0,04% di BSA, filtrare la sospensione utilizzando un colino da 40 μm.
   6. Diluire 5 μL di sospensione in 5 μL di blu di tripano. Contare le cellule e valutare la vitalità con un ematocitometro. Le celle sono ora pronte per l'analisi a valle.

Results

Per dimostrare l'efficacia di questo protocollo nello studio degli effetti delle interazioni cellula-cellula attraverso una membrana basale, la Figura 2 e la Figura 3 sono state riutilizzate da una precedente pubblicazione (Pallegar et ^al.16) come risultati rappresentativi. La Figura 4 e la Figura 5 sono dati nuovi generati per mostrare l'adattab...

Discussion

La mancanza di complesse interazioni cellulari nella coltura cellulare tradizionale evidenzia la necessità di modelli migliorati di organi e tessuti per studiare con maggiore precisione le risposte farmacologiche e la progressione della malattia in vivo. Lo sviluppo di sistemi di co-coltura 3D ha contribuito a colmare questa lacuna consentendo lo studio delle conseguenze delle interazioni cellulari senza la necessità di studi in vivo ^9,12

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastra di coltura tissutale a 24 pozzi	Corning	3524
Vetro di copertura 24 x 60 mm	Ultident Scientific	170-C2460
4% Paraformaldeide in PBS	Invitrogen	J61899. AK	Diluito al 2% in 1x PBS
Diapositive culturali a 4 pozzi camerati	Falcon	354114
Alexa Fluor 647 AffiniPure Frammento Fab Asino Anti-Capra IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.	705-607-003
Ematocitometro a linea brillante	Hausser Scientific	3120
Kit di proliferazione CFSE CellTrace	Invitrogen	C34570
Soluzione di recupero cellulare	Corning	354253
DAPI	Sigma-Aldrich Canada Co.	D9542
Anticorpo secondario adsorbito incrociato anti-Topo IgG (H+L), DyLight 594	Invitrogen	SA5-10168
Anticorpo secondario anti-coniglio IgG (H+L) altamente adsorbito incrociatato per asini, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A31573
DMEM/F-12, nessun rosso fenolico	Gibco	21041025
Medium Eagle Modificato di Dulbecco, alto livello di glucosio, piruvato	Gibco	11995-065
Siero fetale bovino, origine canadese	Gibco	12483-020
Filtri cellulari Flowmi, 40 e micro; M	Bel-Art	136800040
Finestra e porta in silicone GE Advanced, trasparenti	Henkel International	2811093
Policlonale Capra Anti ZO-1	SantaCruz Biotecnologia	SC8146	Anticorpo primario, interrotto
Anti ZO-1 monoclonale di ratto	SantaCruz Biotecnologia	SC33725	Anticorpo primario alternativo per sostituire SC8416 anti-ZO-1 dismesso
Mezzo basale delle cellule epiteliali mammarie	Promocell	C-21210
Matrigel, Fenolo Rosso, Fattore di Crescita Ridotto, Senza LDEV	Corning	356231	Concentrazione proteica: 9-9,6 mg/mL
Anti-Vimentina monoclonale per topi	Sigma-Aldrich Canada Co.	V2258	Anticorpo primario
Siero per vitelli neonatali, origine neozelandese	Gibco	16010159
Penicillina-streptomicina	Gibco	15140-122
Soluzione salina tamponata con fosfato, pH 7,4	Gibco	10010023
Supporto antifade d'oro ProLong	Invitrogen	P36934
Anti-E-Cadherin purificato per topi	BD in Biologia	610181	Anticorpo primario
Coniglio Polyclonal Anti-Claudin 7	Abcam	AB27487	Anticorpo primario
RPMI 1640, Glutamina	Gibco	11875-093
SupplementMix	Promocell	C-39115
Tripano Blu (0,4%)	Gibco	15250-061
Tripsina 0,25%-EDTA	Gibco	25200056