L'analisi ratiometrica quantitativa dei biosensori basati su FRET in Arabidopsis thaliana consente la misurazione viva degli analiti nei compartimenti subcellulari

Aditi Subramani Raju; Wayne K. Versaw

doi:10.3791/70028

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Articolo metodologico

L'analisi ratiometrica quantitativa dei biosensori basati su FRET in Arabidopsis thaliana consente la misurazione viva degli analiti nei compartimenti subcellulari

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DOI:

10.3791/70028

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24 febbraio 2026

Aditi Subramani Raju¹ , Wayne K. Versaw¹

¹Department of Biology, Texas A&M University

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un protocollo per l'analisi quantitativa di molecole o ioni nei compartimenti subcellulari di cellule vive utilizzando biosensori basati su trasferimento di energia da risonanza Förster (FRET). Include imaging standardizzato, elaborazione delle maschere binarie e analisi ratiometrica con regressione lineare applicata al fosfato in Arabidopsis thaliana (A. thaliana), ma è ampiamente applicabile ad altri biosensori e organismi.

Abstract

I biosensori fluorescenti offrono un approccio non invasivo e versatile per monitorare i cambiamenti dinamici nelle concentrazioni di metaboliti o ioni all'interno delle cellule vive. In particolare, i biosensori basati su FRET consentono misurazioni ratiometriche che riportano i livelli di analiti subcellulari pur essendo indipendenti dai livelli di espressione dei biosensori. Descriviamo un protocollo completo e standardizzato per l'analisi ratiometrica quantitativa dei biosensori basati su FRET nelle piante. Il protocollo guida gli utenti attraverso la preparazione del campione dal vivo, l'acquisizione di immagini confocali dei donatori, dei canali FRET e accettori, la generazione di maschere binarie per le regioni subcellulari di interesse, seguita da un'analisi dei dati ratiometrica basata su regressione. Il risultato principale è la lettura ratiometrica derivata dalla regressione che consente confronti quantitativi tra genotipi, tessuti, stadi di sviluppo e condizioni di trattamento. Utilizzando il biosensore cpFLIPPi-5.3m per fosfati inorganici come esempio, dimostriamo la misurazione dei livelli di fosfato inorganico nello stroma del cloroplasto di A. thaliana. Questo quadro analitico è ampiamente applicabile ad altri biosensori e sistemi modello basati su FRET, consentendo una quantificazione spaziotemporale precisa di metaboliti e ioni in vivo. Questa strategia fornisce approfondimenti misurabili sulla dinamica subcellulare di metaboliti e ioni, supportando confronti in contesti sperimentali diversi.

Introduzione

Il monitoraggio della dinamica dei metaboliti e degli ioni nelle cellule vegetali vive è essenziale per comprendere come le vie metaboliche e le reti di segnalazione siano coordinate nello spazio e nel tempo per supportare la crescita e lo^sviluppo ^1,2. I livelli di metaboliti cellulari fluttuano rapidamente in risposta a segnali ambientali come la disponibilità di nutrienti, l'intensità luminosa e lo^{stress 3}. Tra questi, il livello di fosfato inorganico (Pi) è particolarmente importante con ruoli chiave nel trasferimento di energia, nella segnalazione e nella regolazione metabolica, eppure la sua dinamica subcellulare resta difficile^{da misurare 4}.

I saggi colorimetrici standard e la risonanza magnetica nucleare fosforo-31, (³¹P)-NMR, possono stimare il Pi totale o compartimentale, ma mancano di risoluzione a cella singola e hanno una precisione temporale^limitata ^5,6. Sebbene la spettrometria a raggi X di sincrotrone e l'imaging con radiotracce forniscano informazioni subcellulari o di flusso, non possono distinguere in modo affidabile Pi dai metaboliti fosforilati e sono spesso invasive. La frazionazione non acquosa e i saggi cinetici basati su enzimi offrono stime indirette del Pi stromale e citosolico, tuttavia questi approcci richiedono molta fadda e sono suscettibili alla^{contaminazione} ^7,8. Insieme, queste limitazioni sottolineano la necessità di metodi non distruttivi con alta risoluzione spaziale e temporale per monitorare metaboliti come Pi, come l'imaging in tempo reale di biosensori basati su FRET.

I biosensori basati su FRET codificati geneticamente sono strumenti potenti per analisi in vivo della dinamica degli ioni e dei metaboliti intracellulari. I primi studi hanno dimostrato l'utilità di tali biosensori nel monitoraggio delle concentrazioni di glucosio, saccarosio e ATP^{all'interno delle cellule} ^9,10,11. I progressi più recenti hanno esteso questo approccio al monitoraggio di calcio, nitrato, fosfato, auxina, acido abscisico e gibberellina, offrendo preziose informazioni sulla regolazione di nutrienti e ormoni 12,13,14,15,16.

cpFLIPPi-5.3m è un biosensore Pi basato su FRET ottimizzato per monitorare i livelli subcellulari di Pi nelle cellule^{vegetali 17}. Questo biosensore consiste in una proteina legante al Pi cianobatterico affiancata da un donatore FRET (eCFP, proteina fluorescente ciano potenziata) e da un accettore FRET (cpVenus, una variante modificata della proteina fluorescente gialla di Venere), e subisce un cambiamento conformazionale al momento del legame con Pi. Questo cambiamento modifica il segnale di fluorescenza derivato dal FRET dipendente da Pi, che viene catturato tramite imaging confocale in modo che un aumento della concentrazione di Pi comporti una diminuzione del rapporto FRET/donatore. L'analisi ratiometrica dipendente da Pi viene effettuata durante la post-elaborazione delle immagini confrontando le intensità delle emissioni accettante e^{donatrice 18}.

L'analisi quantitativa ratiometrica dei FRET nei tessuti vivi di piante richiede correzione per il flusso spettrale e l'eccitazione incrociata dei fluorofori donatori (CFP) e accettori (cpVenus),^{rispettivamente 18}. Il bleed-through si verifica quando l'emissione di CFP viene rilevata nel canale FRET, mentre l'eccitazione incrociata deriva dall'eccitazione di cpVenus durante l'eccitazione CFP. Questi artefatti spettrali possono variare tra cellule e compartimenti subcellulari, in particolare nei tessuti vegetali pigmentati, e quindi confondono le misurazioni ratiometriche. Per ottenere un'emissione corretta o sensibilizzata dei FRET, i contributi di spurgamento e eccitazione incrociata vengono sottratti dal segnale grezzo dei FRET come segue:

Emissione FRET sensibilizzata = Emissione grezza FRET - svuotamento - eccitazione incrociata

I fattori di correzione per il flusso attraverso e l'eccitazione incrociata sono determinati dall'imaging delle piante che esprimono CFP o cpVenus singolarmente nelle stesse posizioni cellulari e subcellulari del^{biosensore 18}. L'emissione sensibilizzata dei FRET viene quindi calcolata come segue:

Emissione FRET sensibilizzata = Emissione FRET grezza - (emissione CFP × fattore di correzione a scorrenza) - (emissione di cpVenus × fattore di correzione incrociata)

Il rapporto tra emissione FRET sensibilizzata e emissione da donatore (rapporto FRET) riporta variazioni relative nella concentrazione di ligandi ed è indipendente dai livelli di espressione¹⁹ dei biosensori.

Il biosensore cpFLIPPi-5.3m è stato selezionato con successo su compartimenti subcellulari distinti di A. thaliana e di altre specie, permettendo la visualizzazione della dinamica Pi 18,20,21,22^. Questo biosensore ha rivelato eterogeneità nella distribuzione e nel trasporto citosolico di Pi tra i tessuti e ha collegato le fluttuazioni stromali Pi del cloroplasto all'attività del trasportatore e alle prestazioni^{fotosintetiche 20,21}. Poiché il biosensore riporta variazioni all'interno di un intervallo dinamico definito, l'interpretazione richiede che l'intervallo includa i livelli di Pi in vivo in condizioni di imaging stabili. L'illuminazione disomogenea o l'abbondanza molto bassa dei biosensori possono influenzare le misurazioni ratiometriche, evidenziando l'importanza di impostazioni di acquisizione standardizzate e controlli negativi appropriati come il sensore di controllo insensibile^{al Pi 20}. Quando la variazione del rapporto FRET tra le regioni di interesse (ROI) è minima, l'analisi di regressione potrebbe non essere appropriata e si raccomanda di aggregare le medie ROI.

In questo articolo presentiamo un protocollo dettagliato per l'analisi ratiometrica quantitativa di cpFLIPPi-5.3m in A. thaliana, inclusi imaging confocale, segmentazione dell'immagine tramite maschere binarie e calcoli del rapporto FRET per il monitoraggio dinamico di Pi nelle cellule vive. Questo metodo fornisce un flusso di lavoro riproducibile per l'analisi dei segnali biosensori basati su FRET, con dati ratiometrici analizzati tramite regressione lineare e confronti statistici tra condizioni sperimentali. Dati rappresentativi sono mostrati utilizzando l'accumulo alterato di stroma Pi di cloroplasto in pht2; 1, un mutante trasportatore Pi di cloroplasto che esprime il sensore cpFLIPPi-5.3m ^21,23. Questo protocollo aiuterà i ricercatori ad applicare l'imaging ratiometrico basato su FRET ad altri sistemi sperimentali, dettagliando correzioni spettrali dei biosensori, impostazioni di imaging e passaggi di analisi quantitativa. Standardizzando l'acquisizione delle immagini e l'analisi basata su regressione all'interno di contesti sperimentali definiti, il flusso di lavoro supporta un confronto coerente delle risposte FRET tra campioni analizzati in condizioni di abbinamento. È appropriato per chi cerca di misurare cambiamenti rapidi e specifici per compartimento nei livelli di analiti nei tessuti vegetali viventi, inclusi mutanti o linee transgeniche con alterazione del trasporto o metabolismo dei metaboliti. Questo approccio standardizzato faciliterà la riproducibilità degli studi quantitativi di imaging con cellule vive in biologia vegetale. Oltre al biorilevamento Pi localizzato nei cloroplasti descritto qui, la strategia analitica può essere adattata ad altri biosensori basati su FRET e tessuti specifici per organismi, a condizione che vengano stabilite la calibrazione e le misurazioni di controllo specifiche per biosensori.

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Protocollo

NOTA: Le linee transgeniche di Arabidopsis che esprimono cpFLIPPi-5.3m e cpFLIPPi-null (varianti citosoliche e mirate ai plastidi) erano state generate in^{precedenza con 17,18} e pht2; 1-1 (CS19883) è stato ottenuto dall'Arabidopsis Biological Resource Center, mezzo MS, occhiali da copertura, perfluorodecalina, microscopio confocale e un obiettivo a immersione in olio 40x (apertura numerica 1.3), laser di eccitazione (CFP/445 nm e cpVenus/515 nm o lunghezze d'onda di emissione appropriate per lo strumento), filtri di emissione per CFP, cpVenus/FRET e accettore, fotocamera o rivelatori cpVenus, workstation di analisi delle immagini, FIJI²⁴ ed Excel.

1 . Preparazione del campione

Generazione delle linee transgeniche di A. thaliana
1. Clonare il biosensore cpFLIPPi-5.3m, e i controlli Pi-insensitive (cpFLIPPi-Null), solo donatore (CFP) e solo accettatore (cpVenus) nei vettori di espressione^{vegetali 17}.
2. Per un'espressione stabile, trasformare le piante di A. thaliana nel fondo mutante SGS3-13 tramite dip floreale di Agrobacterium tumefaciens , raccogliere semi T1 e selezionare trasformanti su piastre agar di Murashige & Skoog (MS) 0,5x contenenti l'agente di selezione appropriato, ad esempio fosfinotricina (10 μg/mL).
3. Sterilizza i semi di A. thaliana che esprimono i biosensori immergendoli nel 70% di etanolo per 1 minuto, trasferisci in candeggina al 50% per 1 minuto, e poi risciacqua 6-10 volte con acqua sterile.
  ATTENZIONE: etanolo e candeggina sono irritanti e devono essere maneggiati indossando l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) adeguata. Effettua la sterilizzazione dei semi in una cappa chimica o in un'area ben ventilata per evitare l'inalazione dei fumi e non mescola mai direttamente candeggina ed etanolo. Smaltire le soluzioni di rifiuto secondo le linee guida istituzionali sulla sicurezza chimica.
4. Stratificare i semi a 4°C al buio per 2-3 giorni per sincronizzare la germinazione, poi trasferire i semi in un mezzo MS solidificato con agar o liquido 0,5x contenente lo 0,25% di saccarosio e la concentrazione desiderata di Pi (250 μM) per il disegno sperimentale. Includi l'agente di selezione se scegli trasformanti.
5. Trasferire le piastre in una camera di crescita controllata impostata a 21°C, 16 ore di luce: 8 ore di fotociclo buio, 120 μmol·m⁻²·s⁻¹ di intensità luminosa e ~60% di umidità relativa. Coltiva le piantine per 4-7 giorni per immaginere le radici o trasferisci le piantine nel terreno per 21 giorni per immaginere le foglie.
6. Se si testano trattamenti Pi, trasferire le piantine nel mezzo Pi desiderato (ad esempio, 250 μM Pi per Pi pieno; 10 μM Pi per Pi-carente) e mantenere il trattamento per il periodo definito (ad esempio, 48 h per la privazione acuta di Pi).
7. If possible, screen plants for adequate sensor expression by imaging for donor or acceptor fluorescence (low-intensity excitation) using a fluorescence stereo microscope (7-‬10x magnification).
8. Valutare linee nello stesso background genetico che esprimono cpFLIPPi-nullo come controlli insensibili al ligando.

2 . Imaging confocale

Per le radici, monta le piantine nel loro mezzo di crescita/acqua sterile su un vetrino di vetro. Sovrapposizione delicata con una piccola copertura per appiattire le radici senza compressione. Immaginela immediatamente.
Per le foglie, si elimina la foglia bersaglio (ad esempio, la terza o quarta foglia in piante di 21 giorni), si posiziona la superficie adassiale in una lamina.
Infiltrare con 10-15 μL di perfluorodecalina per liberare gli spazi d'aria se necessario, e sovrapporsi delicatamente con un piccolo peso di vetro per appiattire il campione. Immaginela immediatamente.
Usa un obiettivo ad alto NA adatto alle cellule vive (ad esempio, 40× / 1.2-1.3 NA). Usa lo stesso obiettivo per tutti i campioni per mantenere la comparabilità.
Utilizzando il software Metamorph, imposta i canali di eccitazione ed emissione e cattura immagini (Figura 1).
NOTA: Per catturare l'emissione del donatore (CFP): si potrebbe utilizzare l'eccitazione a ~445 nm (o linea CFP appropriata allo strumento) e la raccolta dell'emissione del donatore (ad esempio, passaggio di banda 470-500 nm). Ad esempio, l'eccitazione del laser a 445 nm al 70% (Figura 1A) con un tempo di esposizione di 1000 ms (Figura 1B) è stata utilizzata per catturare l'emissione CFP. Per catturare il FRET (emissione dell'accettore sensibilizzato): eccitazione alla lunghezza d'onda donatrice (445 nm) e raccolta della banda di emissione dell'accettore (ad esempio, 530-560 nm). Per catturare il canale accettatore diretto: eccitazione a eccitazione accettore (ad esempio, 500-515 nm) e raccolta della stessa banda di emissione accettore del FRET.
Acquisire immagini in sequenza: cattura l'eccitazione del donatore/emissione del donatore, l'eccitazione del donatore/emissione del FRET, poi l'eccitazione dell'accettore/emissione dell'accettore. Mantenere il tempo di imaging per campo corto per limitare il fotosbiancamento (500-1000 ms).
NOTA: Per ciascuna posizione cellulare (citosolo radicale, citosolo mesofillico delle fogli, stroma del cloroplasto), determinare la potenza laser ottimale, il guadagno del rivelatore e il tempo di esposizione (Figura 1) tali che le intensità medie dei pixel siano superiori al fondo locale ma inferiori alla saturazione del rivelatore. Mantieni le stesse impostazioni di cattura per i canali derivati dall'eccitazione donatrice (donatore e FRET) per una determinata posizione. I parametri di imaging dipendono dal campione, dal microscopio, dalla sorgente luminosa e dal sistema di rilevamento, e quindi devono essere determinati empiricamente, con intervalli accettabili valutati e documentati tramite analisi di regressione come descritto in questo protocollo. Il software di acquisizione immagini utilizzato qui è Metamorph versione 7.
Utilizzare la stessa sensibilità del rivelatore (ad esempio, qui, un guadagno di 2,4x e offset zero) su tutte le immagini per la posizione del bersaglio. Se si utilizzano più rivelatori, caratterizzare le risposte spettrali per ciascun rivelatore e documentarle.
Acquisire immagini di controllo per ogni tessuto/genotipo di interesse.
1. Immagini tessuto selvatico non trasformato per determinare l'autofluorescenza di fondo per ogni canale.
2. Immagini piante che esprimono solo donatore (CFP) e solo accettatore (cpVenus) alle stesse impostazioni di cattura per ciascuna posizione per derivare i coefficienti di correzione spettrale (bleed-through e cross-eccitation). Cattura immagini di più individui (≥6-8) con una gamma di intensità di emissione.

3 . Elaborazione immagini

Apri le immagini grezze dei canali donatore (chiamato CC per eccitazione/emissione donatore), FRET (chiamato CY per eccitazione/emissione accettante da donatore) e accettatore (chiamato YY per eccitazione/emissione accettante) in software di analisi come FIJI o ImageJ. (Figura 2).
Determinare l'intensità media di fondo per canale campionando più ROI (5-10) in posizioni equivalenti da piante non trasformate fotografate con le stesse impostazioni. Sottrai il valore medio di fondo da ciascuna immagine canale corrispondente.
Passaggi da seguire nelle FIJI
1. Clicca su Scheda Analizza> Imposta Misurazioni > Seleziona il valore medio grigio. Misura l'intensità dello sfondo scegliendo un ROI specifico o una media dell'intera immagine.
2. Clicca su Scheda Analizza> Misura. Salva i valori in un foglio Excel e calcola i valori medi di background per ogni canale. Soglia l'immagine del donatore (CFP) per definire il confine spaziale del biosensore (il donatore tipicamente ha il segnale più basso). Converti l'immagine donatrice con soglia in una maschera binaria (Figura 3 A).
3. Clicca su Immagine della Scheda> Aggiusta> Soglia.
4. Si aprirà una finestra per il soglia di soglia che si aprirà. Scegli il metodo Max Entropy per la soglia. Si stabilisce il confine spaziale, in questo caso lo stroma del cloroplasto, e si applica la soglia. Questo genera un'immagine binaria in bianco e nero (Figura 3 B).
5. Clicca su Tab Matematica> Divide> Inserisci valore 255. L'immagine diventerà tutta bianca. Salva questa immagine binaria della maschera come file .tiff.
6. Moltiplicare la maschera binaria con tutte e tre le immagini sottratte dallo sfondo per creare immagini mascherate da analizzare (Figura 3C).
7. Apri il file binario mask in FIJI.
8. Clicca su Tab Process> Matematica>Moltiplica.
9. Scegli la maschera binaria come una delle immagini e l'immagine CC sottratta dallo sfondo come l'altra.
10. Ripeti i passaggi per CY e YY.
11. Ricavare i ROI sulle immagini mascherate appropriate alla struttura in studio (cellula intera, citosol, stromale del cloroplasto). Per ogni ROI, estrarre le intensità medie dei pixel per i canali donatore, FRET e accettori diretti. Salva i metadati ROI (nome immagine, coordinate, condizione sperimentale, ID replica) per l'analisi statistica a valle.
12. Immagini CC, CY e YY aperte.
13. Clicca su Tab Matematica> Sottra> Inserisci il valore medio di background. In alternativa, questo può essere fatto proprio prima di calcolare il FRET sensibilizzato in Excel.
14. Apri il file CC mascherato.
15. Clicca su Scheda Processo > Calcolatrice Immagine. Moltiplica il CC con il file immagine CC mascherato. Questo aprirà un nuovo file immagine a 32 bit.
16. Disegna i ROI usando gli strumenti FIJI appropriati nella barra delle applicazioni principale. Ad esempio, qui lo stroma del cloroplasto viene selezionato usando lo strumento ROI "Ovale". Aggiungi i ROI a un gestore ROI (ctrl+T). Scegli 5-10 ROI per immagine. Seleziona "Mostra tutto". Questi ROI possono essere memorizzati come un metafile separato (Figura 3D). Non chiudere il responsabile ROI.
17. Clicca su Scheda Analizza> Imposta le misure> Seleziona il valore grigio medio.
18. Clicca su "Misura" nel responsabile ROI.
19. I valori medi dei pixel dei ROI scelti appariranno come elenco in una finestra separata.
20. Copia questi dati su Excel. Non chiudere il responsabile ROI.
21. Ripeti la moltiplicazione del file CC mascherato con le immagini CY e YY per ottenere misurazioni degli stessi ROI usando il ROI manager in ogni singolo canale. Memorizza i valori in Excel.

4. Analisi ratiometrica

Apri Microsoft Excel per eseguire le seguenti operazioni (Figura 4).
Calcolo dei coefficienti di correzione.
1. Per ciascuna posizione cellulare, tracciare le intensità del canale FRET (asse Y) delle piante solo donatrici rispetto alle intensità del donatore (asse X). Adatta una regressione lineare. La pendenza è il coefficiente di scorrenza del donatore (designato come a).
2. Ripeti tracciando le intensità dei canali FRET di piante solo accettori (asse Y) rispetto alle intensità degli accettori diretti (asse X). La pendenza è il coefficiente di eccitazione incrociata dell'accettore (designato come b).
3. Utilizzare ≥15-20 ROI da più impianti per ottenere coefficienti robusti. Per lo stroma del cloroplasto, si scelgono 50-60 cloroplasti.
Calcola il FRET sensibilizzato per ogni ROI come
FRET sensibilizzato = FRET grezzo - (donatore × ) - (accettore × b )
dove a e b sono coefficienti specifici di posizione derivati sopra (Figura 4).
Traccia le intensità del FRET (asse Y) sensibilizzate rispetto alle intensità dei canali donatori (asse X) per ROI aggregati. Adattando una regressione lineare Excel fornirà un adattamento nel formato y = mx + c, dove y corrisponde alle intensità sensibilizzate dei FRET, x alle intensità del donatore, c all'intercetto y e m alla pendenza della regressione. Si noti R² per le regressioni adattate. Tipicamente, R² varia da 0,8 a 1, a rappresentare un buon adattamento (Figura 4).
Per misurazioni citosoliche e stromiche, calcola e utilizza la pendenza del FRET/donatore (FRET ÷ donatore sensibilizzato) come lettura ratiometrica, nota anche come rapporto FRET.
NOTA: L'errore dell'adattamento per la regressione rappresenta l'errore standard della pendenza (usa la funzione LINEST in Excel). Utilizzare la selezione specifica per località in modo coerente tra campioni e genotipi di interesse. La regressione lineare applicata a dati provenienti da più ROI e impianti indipendenti conferma che il rapporto FRET è indipendente dall'abbondanza del sensore.
Calibrazione, controlli e distinzione degli effetti non specifici.
1. Utilizzare cpFLIPPi-null (variante insensibile al ligando) espresso in parallelo e elaborato in modo identico per distinguere potenziali variazioni non specifiche nel rapporto FRET (pH, forza ionica, fotofisica) dalle variazioni specifiche per Pi.
2. Dati aggregati a livello ROI con campi: genotipo, compartimento, ID replica della pianta, ID ROI, donatore, accettore, FRET grezzo, FRET sensibilizzato, rapporto adatto (quando applicabile). Conserva le intensità grezze.
3. Per i confronti di popolazione si utilizzano le pendenze derivate dalla regressione come statistiche primarie; riportano pendenze ± SE e % di errore relativo.
4. Applicare le statistiche inferenziali appropriate (ad esempio, test t di Student o ANOVA) sui parametri derivati dalla regressione. Usa test non parametrici se le distribuzioni violano la normalità. Correggi i confronti multipli quando applicabile.
Checklist per il controllo qualità (prima di accettare i dati)
1. Confermare che tutti e tre i canali di ogni immagine siano al di sotto della saturazione del rilevatore e abbiano un adeguato rapporto segnale/rumore (>2-10x di sfondo).
2. Confermare che i controlli a singolo fluoroforo donatore e accettante siano stati fotografiati in impostazioni identiche e che abbiano prodotto relazioni lineari per derivare i coefficienti di correzione a e b.
3. Confermare che la registrazione delle immagini sia accurata e che le maschere definiscono correttamente le regioni contenenti biosensori.
4. Conferma che il controllo cpFLIPPi-null mostra la prevista mancanza di sensibilità Pi.
Metriche rappresentative di controllo qualità per aiutare a escludere le immagini
1. Tasso di saturazione: meno dell'1-2% dei pixel raggiunge l'intensità massima (65.535) per le immagini a 16 bit.
2. Livello di fondo: L'intensità media nelle regioni prive di cellule varia da ~50 a 200 unità.
3. Intervallo di intensità dei pixel: Le intensità medie sono ben al di sopra dello sfondo ma rimangono sotto la saturazione (~2.000-20.000 unità).
4. Rapporto segnale-rumore (SNR): I valori dovrebbero superare 2-10.

5. Test statistico per la differenza tra due pendenze di regressione

Determinare se due pendenze (pendenze del rapporto FRET derivate dalla regressione da due genotipi o trattamenti) differiscono^{significativamente di 25}.
Calcola la statistica di test e i gradi di libertà come segue

con gradi di libertà df = n1 + n2 - 4. m₁ e m₂corrispondono alle pendenze della regressione lineare, s_b₁e s_b₂si riferiscono all'errore standard di ciascuna pendenza (ottenuto da LINEST o dall'output di regressione) e n₁e n₂sono le dimensioni del campione (numero di ROI utilizzati per adattare ogni regressione).
Ottieni un p-valore a due code per t con df (ad esempio, usa una tabella di distribuzione t o un calcolatore^{online 26}). Quando si utilizza il calcolatore online (Figura 5C), inserisci i s_b1 e _{s b2}, n1 e n2 ottenuti nel passaggio precedente per calcolare il valore p e le statistiche di test.
L'interpretazione sarà di rifiutare l'ipotesi nulla (le pendenze non sono significativamente diverse) se p < α (ad esempio, α = 0,05). Rapporto b₁, b₂, s_b1,_{s b2}, t, df e p.

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Risultati

Imaging confocale

Utilizzando microscopia confocale e software Metamorph, sono stati acquisiti canali separati per visualizzare i segnali donatori e accettori FRET nei tessuti fogliari di A. thaliana wildtype (WT) e nel pht2; 1 mutante trasportatore Pi del cloroplasto (Figura 2). Immagini rappresentative illustrano una chiara localizzazione subcellulare del biosensore Pi, con i cloroplasti facilm...

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Discussione

Questo protocollo fornisce un approccio standardizzato per la quantificazione di metaboliti o ioni da cellule vive utilizzando biosensori basati su FRET. I principali vantaggi includono misurazioni ratiometriche non invasive e applicabilità a più compartimenti^subcellulari 17,20,21,22^. L'uso di maschere binarie e la regressione lineare migliora la precisione e l...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse relativi a quest'opera.

Ringraziamenti

Riconosciamo i contributi dei membri passati del laboratorio W.K.V., i cui sforzi hanno supportato lo sviluppo di questo protocollo. Il sostegno finanziario è stato fornito dal Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti, Ufficio della Scienza, dal Programma di Bioimaging Technology (DE-SC0014037) e dalle Scienze Energetiche di Base (DE-FG02-04ER15559). L'A.S.R. fu sostenuta in parte da fondi dell'Hagler Institute for Advanced Study della Texas A&M University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Obiettivo 40X immersione in olio	Olympus	https://www.edmundoptics.in/p/olympus-uplxapo-40x-oil-immersion-objective/55558/?srsltid=AfmBOoo0cqmgz7SoQ3ZCUvlJn_LeA37O42aX5BbFqF76k40CwQLNVn4P	Lente oggettiva per l'imaging
Vetrine di copertura / copertine	VWR	48393-081	Copertura per il posizionamento del campione
FIJI (ImmagineJ)	Open source	2.9.0	Software per l'analisi delle immagini
Microscopio Olympus IX81 rovesciato	Olympus	http://www.olympusconfocal.com/brochures/pdfs/ix81.pdf	Sistema di imaging confocale
Fotocamera iXon3 897 EMCCD	Andor Technology	https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-camera-series/ixon-life-897	Parte del sistema di imaging confocale
MetaMorph software V7	Dispositivi molecolari. LLC	Versione 7	Workstation di analisi delle immagini
Microsoft Excel	Microsoft Suite	v16.68	Software di analisi dei dati
Murashige & Skoog (MS) media	Cassone	MSP11-10LT	Substrato per la crescita delle piante
Perfluorodecalina (Acros Organico)	Acros Organics	P9900-25G	Mezzo di imaging
Fosfinotricina	Sigma	77182-82-2	Antibiotico
Camera di crescita delle piante	Conviron	Consuetudine	Camera di crescita
Unità confocale a disco rotante Yokogawa CSU-X1	Yokogawa	https://www.yokogawa.com/solutions/products-and-services/life-science/spinning-disk-confocal/csu-x1-confocal-scanner-unit/	Parte del sistema di imaging confocale

Riferimenti

Frommer, W. B., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins. Chem Soc Rev. 38 (10), 2833-2841 (2009).
Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. The role of dynamic enzyme assemblies and substrate channelling in metabolic regulation. Nat Communications. 9 (1), 2136(2018).
Plaxton, W. C., Tran, H. T. Metabolic adaptations of phosphate-starved plants. Plant Physiol. 156 (3), 1006-1015 (2011).
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