Strategia integrata di microplacche e HPTLC per determinare e profilare i fenolici totali e i flavooli negli estratti di buccia di agrumi

Sommario

Questo studio presenta un approccio combinato AlCl₃/Folin–Ciocalteu per la profilazione e la quantificazione di HPTLC di flavoboli/5-idrossiflavoni e composti fenolici nelle bucce di agrumi, integrato da analisi a microplacche.

Abstract

I composti fenolici e i flavonoidi contribuiscono in modo significativo all'attività antiossidante e al valore funzionale dei sottoprodotti degli agrumi. Tuttavia, i saggi colorimetrici convenzionali, sebbene ampiamente utilizzati, non presentano separazione cromatografica e possono essere influenzati da interferenze chimiche. Questo protocollo presenta un flusso di lavoro analitico integrato che combina saghi spettrofotometrici a micropiastre con cromatografia a strato sottile ad alte prestazioni (HPTLC) per la determinazione e la profilazione del contenuto fenolico totale (TPC) e del totale di flavooli più il contenuto di 5-idrossiflavoni (TFHC) negli estratti di buccia di agrumi. Estratti etanolici di pellicce di calce (Citrus aurantifolia) e mandarino (Citrus reticulata) sono stati valutati utilizzando saggi Folin–Ciocalteu (FC) e cloruro di alluminio (AlCl₃) in un formato micropiastra a 96 pozzi, seguiti da un'analisi HPTLC che impiega due fasi mobili sequenziali e una derivatizzazione post-cromatografica doppia. Le misurazioni delle microplacche hanno fornito valori TPC di 74,2 mmol/g per la calce e 72,8 mmol/g per il mandarino, mentre i valori TFHC erano rispettivamente 15,5 mmol/g e 6,0 mmol/g. La separazione HPTLC ha risolto quattro bande fenoliche nel calce e sei nel mandarino. Due bande di calce sono state visualizzate selettivamente dopo la derivatizzazione di AlCl₃, compatibili con flavooli o 5-idrossiflavoni. La somma dei fenomeni nocivi stimata dall'HPTLC era di 22,0 e 20,8 mmol/g di materia secca rispettivamente per calce e mandarino, mentre il TFHC ha raggiunto 13,4 mmol/g nella calce e non è stato rilevato nel mandarino. Questi risultati dimostrano che i saggi a microplacche forniscono una stima rapida e sensibile del contenuto totale, mentre l'HPTLC migliora la selettività tramite separazione dei composti e derivatizzazione specifica per gruppi funzionali. La strategia combinata consente uno screening ad alto rendimento seguito da conferma cromatica, offrendo una piattaforma pratica e riproducibile per la caratterizzazione fitochimica di matrici vegetali complesse.

Introduzione

Le bucce di agrumi sono un sottoprodotto dell'industria dei succhi e hanno dimostrato la presenza di composti funzionali come^{gli antiossidanti 1}. Sono stati utilizzati come alimenti^{neuroprotettivi 2}, antinfiammatori, cosmeceutici^{anti-acne 3} e additivi^{alimentari 4}. Diverse di queste bioattività sono attribuite ai flavonoidi⁵ e ai composti^{fenolici 6}. Metodi generali per stimare la quantità totale di flavonoidi e fenoli sono stati stabiliti nella^{letteratura 7}, i più comuni dei quali sono il Folin-Ciocalteu per il contenuto fenolico totale (TPC⁾⁸, e il cloruro di alluminio per composti flavonoidi totali (TFC⁾⁹ tramite spettrofotometria. Il metodo di Folin-Ciocalteau fu pubblicato per la prima volta nel 1927¹⁰, basato su una modifica della reazione di Folin-Denis¹¹, entrambe basate su una reazione redox di composti fosfogungstico-fosfomoliddici. Il metodo Folin-Ciocalteau misura la capacità riduttiva dei composti^{fenolici 12}. Il test del cloruro di alluminio e dei flavonoidi fu proposto per la prima volta nel 1960, basandosi sui complessi tra il metallo e i liganti^{flavonoidi 13}.

Entrambi i sami spettrofotometrici sono strumenti utili per stimare e confrontare il contenuto complessivo di fitocomposti comunemente presenti nei materiali vegetali. Tuttavia, sono soggetti a varie limitazioni. Ad esempio, alcune limitazioni derivano dall'uso degli standard esterni¹⁴, dove generalmente si presume che la natura chimica dello standard non influenzi significativamente la risposta del segnale. In pratica, questa assunzione è difficile da validare, poiché l'assorbimento molare dipende da fattori come la coniugazione e altre caratteristiche strutturali che sono difficili da standardizzare nei prodotti naturali. Ad esempio, Appel et^{al. 15} hanno valutato il TPC di undici specie di querce e sviluppato il cosiddetto approccio "auto-standard", riportando differenze superiori al 50% nelle pendenze delle curve di calibrazione. L'utilizzo auto-standard è una strategia progettata per rappresentare la stessa miscela composizionale di composti presente nel campione, fornendo così una corrispondenza più vicina al Contenuto Fenolico Totale (TPC) effettivo nel^{campione 16}. Gli auto-standard forniscono anche alcune informazioni sul rapporto tra gruppi reattivi e peso molecolare medio; tuttavia, è laborioso e difficile da standardizzare.

Il saggio totale dei composti flavonoidi basato sulla complessiazione del cloruro di alluminio è stato valutato criticamente in studi^{recenti 17,18}, che hanno concluso che AlCl₃ forma specificamente complessi con due sottogruppi di flavonoidi: flavooli e 5-idrossiflavoni. Tipicamente, i flavooli mostrano un'assorbimento massima intorno ai 440 nm, mentre i 5-idrossiflavoni assorbono intorno ai 415 nm. Inoltre, alcuni flavonoidi possono mostrare assorbanza intrinseca nell'intervallo 415–440 nm anche in assenza di derivatizzazione, e l'aumento dell'assorbimento durante la complessizzazione varia tra i singoli composti. Inoltre, entrambi i sami colorimetrici mancano di separazione e quindi non possono distinguere tra diversi costituenti fenolici; Sebbene questa caratteristica possa essere vantaggiosa per stimare il contenuto totale, comporta una specificità limitata. Queste considerazioni evidenziano la necessità di una strategia analitica che risolva i singoli componenti prima della rilevazione colorimetrica, distinguendo così le vere risposte al saggio dalle interferenze spettrali o chimiche.

Nonostante queste limitazioni, tali saghi restano strumenti preziosi per lo screening generale dei composti fenolici bioattivi negli estratti di piante e^{frutti 19}. Per valutare potenziali interferenze, l'uso di un metodo di cromatografia a strato sottile ad alte prestazioni (HPTLC), che è stato rivelato sia con i reagenti Folin–Ciocalteu che con quelli AlCl₃, rappresenta un approccio efficace. La separazione cromatica consente il rilevamento di sostanze interferenti con bande di assorbimento preesistenti prima della complessizzazione, mentre la documentazione fotografica consente l'analisi simultanea di massimi di assorbimento multipli. Inoltre, l'analisi HPTLC offre diversi vantaggi rispetto a tecniche cromatografiche più complete come HPLC–MS/MS, tra cui un consumo di solvente inferiore, tempi di analisi più brevi dovuti al trattamento simultaneo di più campioni (fino a 18 per placca⁾²⁰, e facilita l'interpretazione di miscele complesse grazie alla selettività della derivatizzazione^{post-cromatografica 21}.

In questo lavoro, presentiamo un protocollo integrato per la determinazione dei composti specifici che comprendono il contenuto polifenolico totale (TPC) e i flavooli totali più 5-idrossiflavoni (TFHC) negli estratti di buccia di agrumi utilizzando la separazione cromatografica a strato sottile ad alte prestazioni (HPTLC), insieme a una stima generale del contenuto basata su un saggio colorimetrico per microplacche. La quantificazione cromatografica planare dei composti fenolici viene effettuata utilizzando il reagente di Folin–Ciocalteu, mentre la derivatizzazione con cloruro di alluminio viene applicata esclusivamente per l'identificazione cromatografica delle bande corrispondenti a flavooli e 5-idrossiflavoni. In questo approccio, la determinazione del TFHC si basa sulla risposta di Folin–Ciocalteu di composti cromatograficamente risolti e chimicamente identificati, piuttosto che sulla complessiazione del cloruro di alluminio per la quantificazione. L'analisi HPTLC consente la separazione e la visualizzazione specifiche per composto, consentendo l'identificazione dei singoli costituenti fenolici e la rilevazione di potenziali interferenze spettrali. Inoltre, viene presentato un metodo spettrofotometrico basato su microplacche per una stima rapida del totale TPC e TFHC, fornendo uno strumento complementare di screening ad alta produttività per matrici di piante complesse.

Protocollo

1. Preparazione delle bucce di frutta

1. Rimuovi circa 50 g di bucce da ogni frutto, separandole dalla parte commestibile. Per i nostri risultati rappresentativi, mandarini sono stati acquistati in un negozio locale (importati dal Cile, varietà Isabellina), e tigli sono stati raccolti da un albero vicino a San José, Costa Rica (esemplare voucher JVR-16434).
2. Metti le bucce in un sacchetto di plastica zip-lock e congelale a -20 °C per almeno 2 ore.
3. Trasferisci le bucce congelate in un liofilizzatore pre-raffreddato, tieni i sacchetti aperti e applica il vuoto (0,1 mbar) per tutta la notte finché non si asciugano completamente.
4. Macina ogni materiale secco a circa 0,1 mm usando un mulino a lame.

2. Estrazione

1. Pesa circa 100 mg di buccia agrumatica secca e macinata (lime o mandarino) e mettila in un tubo di vetro da 15 mL.
2. Aggiungi 3 mL di etanolo al 60% nel tubo.
3. Sonicare la miscela in un bagno ultrasonico per 10 minuti a 40 °C per disturbare le cellule vegetali e facilitare il rilascio fitochimico.
4. Centrifuga il campione a 850 × g per 10 minuti.
5. Trasferire con cura il sovrandante etanolico in una fiaschetta volumetrica da 10 mL utilizzando una pipetta Pasteur, evitando il disturbo del sedimento.
6. Aggiungi altri 3 mL di etanolo al 60% al tubo contenente il residuo solido umido.
7. Ripeti i passaggi di sonicazione e centrifugazione descritti sopra nei passaggi 2.3 e 2.4.
8. Trasferisci il sovrandante nello stesso fiaschone volumetrico e combinalo con l'estratto precedente.
9. Esegui una terza estrazione ripetendo i passaggi precedenti (2.6–2.8).
10. Acidulare l'estratto combinato (≈9 mL) con due gocce di 0,1 mol/L HCl (per aumentare la stabilità degli antocianini e altri composti fenolici) e portare il volume a 10 mL con metanolo.
11. Esegui questa procedura in triplicata per ogni campione.

3. Contenuto totale di flavooli e 5-idrossiflavoni (TFHC) tramite spettrofotometria a microplacche

1. Prepara una soluzione di quercetina (100 μg/mL) o uno standard flavonoide equivalente.
   1. Pesa 10 mg di quercetina usando una bilancia con precisione di 0,1 mg.
   2. Sciogliere la quercetina in circa 5 mL di etanolo al 95% e trasferire la soluzione in una fiaschetta volumetrica da 10 mL etichettata come soluzione standard.
   3. Sciacquare il becher due volte con 2 mL di etanolo al 95% e aggiungere i risciacqui alla fiaschetta.
   4. Porta il volume al livello con il 60% di etanolo.
   5. Preparare soluzioni standard (10–100 μg/mL) e un blank in tubi microcentrifughe da 1,5 mL secondo la Tabella 1.
   6. Assicurarsi che tutti i campioni e gli standard rientrino in un intervallo di assorbenza da 0,2 a 0,8, regolando le concentrazioni se necessario.
   7. Preparare la disposizione della micropiastra dispensando 60 μL di plastica, campione o standard in ciascun pozzo secondo la Figura 1. Esegui tre repliche per campione o standard.
   8. Distribuire soluzioni acquose di cloruro di alluminio al 2%, acetato di sodio al 5% e metanolo all'80% in serbatoi di reattivi separati.
      NOTA: Maneggiare con attenzione cloruro di alluminio e soluzioni metanoliche. Le soluzioni di cloruro di alluminio sono irritanti, e il metanolo è tossico per ingestione, inalazione e assorbimento della pelle. Evita il contatto con pelle e occhi e indossa DPI adeguati
   9. Utilizzando una pipetta multicanale a 8 canali, aggiungere 10 μL di soluzione di AlCl₃, 10 μL di soluzione di acetato di sodio e 200 μL di metanolo all'80% in ciascun pozzo.
   10. Scuoti il piatto a intensità intermedia per 10 secondi e incubalo al buio per 30 minuti.
   11. Misura l'assorbenza a 415 nm. Se non è possibile agitare, mescolare manualmente con una micropipetta prima dell'incubazione (Figura 2).
   12. Interpolare i valori di assorbanza del campione dalla curva di calibrazione e applicare fattori di diluizione, volumetrici e correzione di massa secondo necessità.

Tabella 1: Quantità di standard di quercetina per la curva di calibrazione totale dei flavooli e del contenuto di 5-idrossiflavoni (TFHC). Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figura 1: Disposizione delle microplacche per l'analisi totale dei flavooli e del contenuto di 5-idrossiflavoni (TFHC). (A) Schema delle microplacche. (B) Software Gen5 layout programma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Configurazione software delle microplacche per l'analisi del contenuto totale di flavooli e 5-idrossiflavoni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Contenuto polifenolico totale (TPC) tramite spettrofotometria a microplacche

1. Preparare una curva standard dell'acido gallico (0,000–0,120 mg/mL).
   1. Pesare circa 0,0123 g di acido gallico (98% di purezza) utilizzando una bilancia analitica e scioglierlo in acqua distillata.
   2. Trasferire la soluzione in una fiaschetta volumetrica da 10 mL, risciacquare due volte e riempire fino al punto con acqua distillata per ottenere la soluzione di stock.
   3. Prepara una soluzione operativa diluendo 1 mL della soluzione di macchia a 10 mL con acqua distillata.
   4. Preparare standard di calibrazione diluendo ulteriormente la soluzione di lavoro secondo la Tabella 2.
   5. Regolare le concentrazioni se i valori di assorbanza sono fuori dall'intervallo 0,2–0,8.
   6. Prepara il reagente di lavoro Folin–Ciocalteu diluendo il reagente commerciale 1:14 con acqua distillata.
      NOTA: Il reagente Folin–Ciocalteu e le soluzioni di acido cloridrico sono corrosive. Evita schizzi e contatto diretto. Esegui la gestione dei reagenti in una cappa a fumo.
   7. Pipettare 30 μL di ciascun campione, standard o blank in una micropiastra a 96 pozzi seguendo la disposizione della Figura 3A, utilizzando tre repliche per campione.
   8. Aggiungere 215 μL di reagente di lavoro Folin–Ciocalteu a ciascun pozzo utilizzando una pipetta multicanale.
   9. Aggiungi 50 μL di soluzione di carbonato di sodio al 20% in ogni pozzo e mescola accuratamente con una micropipetta.
   10. Incubare la piastra per 20 minuti a 40 °C con agitazione (Figura 3B).
   11. Misura l'assorbenza a 755 nm.

Tabella 2: Quantità di standard dell'acido gallico per la curva di calibrazione del contenuto fenolico totale (TPC). Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figura 3: Disposizione delle microplacche e configurazione software per l'analisi delle microplacche a contenuto fenolico totale (TPC). (A) Layout. (B) Programma software. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Condizioni generali utilizzate per l'analisi cromatografia a strato sottile ad alte prestazioni

1. Curve standard
   1. Prepara soluzioni stock di quercetina e acido gallico (100 μg/mL ciascuna) come descritto sopra nelle sezioni 3 e 4.
   2. Applicare acido gallico su sei corse a volumi di 2, 4, 6, 8, 10 e 12 μL.
   3. Applicare 5 μL di acido gallico e quercetina individualmente su corsie separate per l'identificazione.
2. Disposizione delle piattie:
   1. Usa una piastra TLC in alluminio con retro in alluminio da 10 × 20 cm e 60 F₂₅₄ come fase ferma.
   2. Imposta i parametri di applicazione come segue: posizione Y 7,0 mm, lunghezza banda 6,0 mm, prima posizione X 14,0 mm, distanza tra i binari 9,4 mm.
   3. Applicare 10 μL di ogni estratto per banda utilizzando azoto come gas di spruzzo.
   4. Imposta la distanza del solvente frontale a 70 mm.
3. Sviluppo delle placche:
   1. Sviluppare piastre in una camera manuale contenente 40 mL di fase mobile e lasciare 10 minuti di saturazione della camera usando carta filtro a contatto con la fase mobile e la parete della camera per aiutare i vapori della fase mobile a saturare l'atmosfera della camera.
   2. Sviluppare le piastre utilizzando MP1 o MP2, eseguendo doppio sviluppo quando necessario. Fase Mobile 1 (MP1), composta da acetato etile:acido formico:acido acetico:acqua (100:11:11:26); e MP2 realizzato in toluene:acetato etilico: acido formico (5:4:1).
      NOTA: Sviluppare piastre HPTLC in una cappa fumi. I componenti della fase mobile (acetato di etil, toluene, acido formico e acido acetico) sono volatili, mentre toluene e acetato di etil sono altamente infiammabili. Evita l'inalazione di vapori ed elimina le fonti di accensione.
   3. Lascia asciugare i piatti a temperatura ambiente.
4. Derivatizzazione
   1. Le piastre di spruzzo con reagente Folin–Ciocalteu (300 μL di reagente + 600 μL di etanolo al 50%), asciugare brevemente con una pistola termica e spruzzare con 1 mL di carbonato di sodio al 10% in etanolo al 50%.
   2. Separatamente, spruzzare altre piastre con cloruro di alluminio all'1% in etanolo al 50%.
5. Piastre riscaldanti uniformemente con una pistola termica finché lo sviluppo del colore non si stabilizza e le piastre sono completamente asciutte.

6. Sviluppo per l'analisi del contenuto totale di flavooli e 5-idrossiflavoni (TFHC) e del contenuto fenolico totale (TPC) tramite cromatografia a strato sottile ad alte prestazioni

1. Applicare campioni in corsie triplice insieme a corsie di riferimento per acido gallico e quercetina (per identificazione, come descritto nel passo 5.1.4).
2. Sviluppa una targa usando MP1.
3. Sviluppa di nuovo la piastra usando MP2.
4. Derivatizzare la piastra usando il reagente FC come descritto in precedenza.
5. Documenta la lastra con illuminazione bianca, oltre a 254 nm e 366 nm.
6. Ripeti la procedura, sostituendo il passaggio finale per la derivatizzazione di AlCl₃ , come mostrato nella Figura 4.

Figura 4: Passaggi di VisionCats per l'analisi di TPC e TFHC da parte di HPTLC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Condizioni di estrazione
Il protocollo generale di estrazione descritto qui utilizza il 60% di etanolo, come precedentemente^{riportato 22}. Quando estrapolate ad altre fonti vegetali, le condizioni di estrazione possono essere ottimizzate in termini di polarità del solvente e numero di cicli. Una motivazione completa per la selezione sia del solvente che del numero di cicli è stata dettagliata^{altrove: 16}. La selezione del solvente può essere guidata dalla letteratura precedente e dagli indici di polarità; In generale, sono raccomandate miscele idroalcoliche di etanolo o metanolo, così come acetone. Il numero ottimale di cicli di estrazione (n) può essere valutato dividendo un volume totale fisso di 10 mL in 1–5 cicli da 10/n mL, seguiti dalla raccolta degli estratti liquidi. L'efficienza dei diversi numeri di ciclo di estrazione viene poi confrontata statisticamente per identificare la condizione che produce la massima assorbenza nel saggio TPC.

Quantificazione delle microplacche e HPTLC
Le curve di calibrazione standard sia per il saggio delle microplacche sia per l'analisi HPTLC sono presentate nella Figura 5. Per la determinazione del contenuto fenolico totale (TPC) tramite il metodo delle microplacche di Folin–Ciocalteu e per le piastre HPTLC derivate con lo stesso reagente, sono state stabilite curve di calibrazione utilizzando l'acido gallico come composto di riferimento. L'acido gallico è stato scelto non solo perché è uno degli standard più comunemente utilizzati per la quantificazione del TPC, ma anche perché può essere eluzionato nelle stesse condizioni di fase mobile applicate ai campioni di calce e mandarino. La quercetina è stata inoltre valutata come potenziale standard per il test HPTLC; tuttavia, si rivelò inadatto a questo sistema cromatografico, poiché co-eluïva con la parte anteriore del solvente e non poteva essere quantificato in modo affidabile. Tuttavia, il TFHC è stato determinato utilizzando la quercetina come standard di riferimento, poiché l'acido gallico non forma un complesso colorato con cloruro di alluminio, dato che non è né un flavonolo né un 5-idrossiflavone.

Figura 5: Lastra HPTLC di calce, mandarino, acido gallico e quercetina sviluppata in sequenza con MP1 seguita da MP2, derivata separatamente con reagenti cloruro di alluminio (AlCl₃) e Folin–Ciocalteu (FC). Viene mostrato il profilo cromatografico dopo la derivatizzazione AlCl₃. Abbreviazioni: FC, derivazione di Folin–Ciocalteu; AlCl₃, derivatizzazione del cloruro di alluminio; W, illuminazione a luce bianca; 366, illuminazione UV a 366 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I risultati per il contenuto totale di fenoli (TPC) e per il contenuto totale di flavonoidi e acidi idrossicinnamici (TFHC) sono presentati nella Tabella 3. Come previsto, i valori di TFHC erano significativamente inferiori rispetto ai valori TPC, circa cinque volte inferiori nei campioni di calce e dodici volte inferiori nei campioni di mandarino.

Tabella 3: Risultati per il contenuto fenolico totale di mandarino e calce tramite il metodo delle microplacche. Abbreviazioni: Abs: assorbenza, CV: coefficiente di variazione, DF: fattore di diluizione, GAE: equivalenti dell'acido gallico, IR: replica indipendente, QE: equivalenti della quercetina, Rep: ripetizione, SD: deviazione standard, TFHC: flavooli totali e composti 5-idrossiflavoni, TPC: contenuto fenolico totale e media . *Calcolato sulla base della materia secca. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Analogamente, i risultati ottenuti dall'analisi HPTLC sono riassunti nella Tabella 4. La separazione cromatografica consente la visualizzazione delle singole bande corrispondenti a composti distinti. Quattro costituenti fenolici sono stati rilevati nei campioni di calce e sei nei campioni di mandarino. Nessuna di queste bande corrispondeva ai fattori di ritenzione degli standard di riferimento impiegati (acido gallico e quercetina), il che è coerente con le aspettative.

Tabella 4: I risultati per il contenuto fenolico totale e le bande corrispondenti ad AlCl₃ hanno rivelato composti derivati da HPTLC con AlCl₃. Clicca qui per scaricare questa tabella.

La Tabella 4 riporta anche il contenuto fenolico totale stimato dall'analisi HPTLC, calcolato come somma dei singoli composti rilevati cromatograficamente (analogo al TPC). Inoltre, la tabella include il contenuto cumulativo delle bande assegnate ai flavooli o ai 5-idrossiflavani (Rf = 0,46 e 0,62 in calce; nessuno rilevato nel mandarino). Queste bande apparivano gialle dopo la derivatizzazione con AlCl₃ e mostravano fluorescenza giallastra sotto un'illuminazione UV a 366 nm. Tuttavia, non è stata osservata alcuna colorazione visibile prima della derivatizzazione, come mostrato nella Figura 5.

Per l'analisi HPTLC, la derivatizzazione Folin-Ciocalteu (FC) fornisce una rilevazione completa dei composti fenolici, anche se possono verificarsi interferenze minori. Inoltre, la derivatizzazione del cloruro di alluminio (AlCl₃) colora selettivamente un sottoinsieme di flavonoidi. L'applicazione combinata di entrambi i reagenti migliora la standardizzazione dei metodi e mitiga alcune delle limitazioni intrinseche di entrambi gli approcci. È in particolare improbabile che un composto non flavonoide mostri sia la caratteristica colorazione blu sotto FC sia l'assorbanza giallo-rossa sotto AlCl₃. Inoltre, cromofori preesistenti possono essere esclusi come interferenze se visibili con la stessa intensità prima della derivatizzazione.

Come mostrato nella Figura 5, l'estratto di calce mostrava due bande a Rf 0,62 e 0,46, che non erano rilevabili sulla lastra non sviluppata ma divennero chiaramente visibili dopo sia la derivatizzazione di Folin–Ciocalteu (FC) che di AlCl₃. Questo comportamento supporta la loro natura flavonoide, forse corrispondente a neoeriocitrin e^{hesperidin 23}. Ulteriori costituenti fenolici sono stati osservati a Rf 0,21 e 0,37 nel calce, e a Rf 0,36, 0,39, 0,42, 0,46, 0,54 e 0,89 nel mandarino. Queste bande erano rilevabili dopo la derivatizzazione FC ma non dopo il trattamento con AlCl₃, suggerendo che possano corrispondere a composti fenolici non flavonoidi. Secondo la letteratura, i principali fenolici non flavonoidi riportati nel mandarino includono l'acido clorogenico e l'acido transferulico^24,25. Nella calce, altri composti precedentemente descritti includono l'acido cumarico e l'acido diidrossiferulico²³. Tuttavia, la conferma di questi incarichi richiede un'analisi con standard di riferimento aggiuntivi.

Confronto delle fasi mobili HPTLC
Entrambe le fasi mobili sono state sviluppate come modifica dei sistemi precedentemente^{segnalati 26, 27, 28}. La fase più polare e mobile (MP1, Figura 6A) ha fornito una separazione superiore dei costituenti fenolici rispetto a MP2. Al contrario, la fase mobile meno polare (MP2) (Figura 6B) ha permesso la conservazione simultanea sia dei componenti del campione che degli standard di riferimento all'interno della stessa esecuzione cromatografica. Tuttavia, in condizioni MP2, i valori Rf dei costituenti del campione erano relativamente bassi, con alcuni composti rimasti vicini all'origine, come mostrato nella Figura 6. Per affrontare questa limitazione, fu implementata una procedura di doppio sviluppo utilizzando MP1 seguito da MP2. Questa strategia ha garantito una migliore migrazione e risoluzione dei componenti del campione, consentendo al contempo la quantificazione rispetto agli standard dell'acido gallico sulla stessa lastra in condizioni cromatografiche identiche. La quercetina mostrava una lieve colorazione gialla prima del trattamento con AlCl₃, che si intensificò dopo la derivatizzazione. Per entrambi gli estratti di calce e mandarino, sono state osservate due bande distinte oltre a una banda rimasta all'origine. Inoltre, una banda gialla con valore Rf di 0,14 è diventata chiaramente visibile dopo la derivatizzazione AlCl₃.

Figura 6: Tavole HPTLC di calce, mandarino, acido gallico e quercetina sviluppate con la fase mobile 1 (A) e la fase mobile 2 (B). Per ogni tavola, le tracce da sinistra a destra corrispondono a: campioni sviluppati (non derivatizzati), derivatizzati Folin–Ciocalteu e derivatizzati AlCl₃. La visualizzazione è stata effettuata sotto illuminazione a luce bianca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

La raccolta e la conservazione dei campioni sono passaggi fondamentali per garantire l'integrità delle analisi fitochimiche. Dopo la raccolta, i campioni devono essere trasportati in condizioni di refrigerazione e liofilizzati il prima possibile per minimizzare il degrado. Sebbene i materiali biologici essiccati siano generalmente stabili, gli estratti in soluzione sono considerevolmente più labili, anche conservati in refrigerazione. Pertanto, le determinazioni analitiche sono preferibilmente effettuate su estratti appena preparati. Una conservazione prolungata, anche per pochi giorni in condizioni fredde e proteggite dalla luce, o per alcune ore a temperatura ambiente, può portare a cambiamenti osservabili nei profili cromatografici, incluse alterazioni nell'intensità della banda e nella formazione di precipitati. Questi cambiamenti sono tipicamente associati a trasformazioni chimiche come ossidazione, idrolisi o reazioni di complessità. Di conseguenza, tutti i reagenti ed estratti devono essere conservati e maneggiati in condizioni di freddo e buio per preservarne la stabilità chimica.

Nel confronto tra le due tecniche (Tabella 3 e Tabella 4), sono evidenti differenze quantitative sistematiche. Sia in calce che in mandarino, i valori TPC ottenuti tramite il test a microplacche erano circa tre volte superiori a quelli stimati dall'HPTLC. Nel calce, il TPC era di 74,2 mmol/g per micropiastra contro 22,0 mmol/g DM per HPTLC, mentre i valori di TFHC erano rispettivamente 15,5 mmol/g e 13,4 mmol/g. Nel mandarino, il TPC ha raggiunto 72,8 mmol/g tramite micropiastra rispetto ai 20,8 mmol/g dell'HPTLC. Per il TFHC, il metodo delle microplacche ha prodotto 6,0 mmol/g, mentre nessuna banda corrispondente è stata rilevata dall'HPTLC.

Queste discrepanze possono essere spiegate dalle limitazioni intrinseche e dai meccanismi di risposta di ciascun metodo. Il saggio Folin–Ciocalteu (FC) è noto per reagire non solo con composti fenolici ma anche con varie sostanze riduttrici non fenoliche, tra cui acido ascorbico, tirosina, acido formico e acido^{acetico 29}, oltre ad altri riduttori a basso peso molecolare. Tali composti contribuiscono al segnale spettrofotometrico complessivo, portando potenzialmente a una sovrastima del TPC. Inoltre, costituenti fenolici minori possono aumentare collettivamente l'assorbenza totale nel saggio a microplacche, anche se le loro concentrazioni individuali sono troppo basse per produrre bande distinte e quantificabili nell'HPTLC. Alcuni metaboliti piccoli o altamente polari possono anche non essere trattenuti, risolti o visualizzati nelle condizioni cromatografiche impiegate.

Figura 7: Rappresentazione schematica dei complessi AlCl₃ formati con flavooli e 5-idrossiflavoni. (A) Flavooli e (B) 5-idrossiflavoni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le differenze metodologiche nella chimica di rilevamento contribuiscono ulteriormente alle variazioni osservate. La reazione FC produce un aumento sostanziale dell'assorbanza dovuto alla riduzione del reagente, con conseguente un'elevata sensibilità analitica. Al contrario, il metodo AlCl₃ è relativamente aspecifico e si basa sulla formazione di complessi con alcuni flavonoidi. I flavooli mostrano tipicamente un assorbimento massimo intorno a 410 nm, mentre i 5-idrossiflavoni assorbono circa 440^{nm 18}, e i loro complessi con Al³⁺ sono illustrati nella Figura 7. Tuttavia, l'aumento dell'assorbanza dopo la complessitazione è relativamente modesto, rendendo il saggio AlCl₃ più suscettibile all'interferenza di componenti della matrice colorata, inclusi i flavonoidi stessi.

Nonostante queste limitazioni, l'uso combinato della derivatizzazione FC e AlCl₃ nell'HPTLC rappresenta una potente strategia complementare per l'analisi fenolica. Questo approccio abbina l'elevata sensibilità della reazione FC alla discriminazione strutturale fornita dalla complessitazione AlCl₃ e dalla separazione cromatografica. Inoltre, diversi flavooli sono noti per mostrare caratteristiche bande giallastre sotto illuminazione UV³⁰, a sostegno ulteriore della classificazione e conferma dei composti.

I metodi a microplacche sono particolarmente vantaggiosi per lo screening ad alta produttività. Richiedono una preparazione minima del campione, un basso consumo di reagenti e permettono l'analisi simultanea di decine di campioni. In condizioni tipiche di laboratorio, un saggio completo a micropiastre può essere eseguito in circa 4 ore utilizzando strumenti ampiamente disponibili. Queste caratteristiche rendono i sagaggi a microplacche estremamente adatti a studi comparativi rapidi, controllo di qualità di routine e alla valutazione preliminare di grandi set di campioni. Al contrario, l'HPTLC richiede più tempo e lavoro, con un flusso di lavoro analitico completo che tipicamente richiede 7–8 ore. Si basa inoltre su strumentazione specializzata che potrebbe non essere disponibile in tutti i laboratori, e l'uso di lastre dedicate e reagenti di derivatizzazione aumenta il costo per analisi. Un'altra limitazione è che i metaboliti presenti a concentrazioni molto basse possono rimanere non rilevabili in condizioni standard di visualizzazione. Tuttavia, queste limitazioni pratiche e legate alla sensibilità sono compensate dal vantaggio chiave della separazione^{cromatografica 30,31}. L'HPTLC consente la risoluzione di singoli costituenti in matrici vegetali complesse, la conferma di risposte autentiche al saggio e la rilevazione di potenziali composti interferenti. Inoltre, la derivatizzazione selettiva post-cromatografica consente una classificazione diretta dei composti in gruppi funzionali (ad esempio, flavooli e 5-idrossiflavoni), migliorando l'interpretazione chimica oltre la stima del contenuto totale.

Di conseguenza, negli studi su larga scala, il flusso di lavoro analitico può iniziare con saghi a microplacche per identificare rapidamente campioni con livelli elevati di composti bersaglio. Campioni selezionati possono poi essere sottoposti all'analisi HPTLC per visualizzare i singoli costituenti, valutare la selettività e valutare possibili interferenze tramite derivatizzazione duale. Questa strategia integrata (illustrata nella Figura 8) combina velocità e capacità di produzione con specificità chimica e intuizione strutturale.

Figura 8: Flusso di lavoro proposto per lo screening e l'analisi dei campioni. (A) Screening micropiastra ad alta produttività di un grande lotto di campioni. (B) Analisi HPTLC di campioni selezionati per la quantificazione utilizzando il metodo Folin–Ciocalteu e per l'identificazione di flavooli e 5-idrossiflavoni tramite derivatizzazione AlCl₃. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Rispetto all'HPTLC, l'HPLC accoppiato alla spettrometria di massa ad alta risoluzione (HPLC–HRMS)—l'alternativa più comune riportata in letteratura—offre una sensibilità impareggiabile e un'identificazione strutturale inequivocabile dei singoli^{composti 32}. Tuttavia, le analisi HPLC–HRMS sono intrinsecamente più lente, poiché ogni esecuzione cromatografica deve essere eseguita in sequenza e comportano costi sostanzialmente più elevati legati alla strumentazione, ai requisiti di purezza dei solventi e al consumo di solventi. Inoltre, lo screening di classe funzionale spesso richiede elaborazione complessa dei dati e interpretazioni specifiche per composti, mentre l'HPTLC consente il raggruppamento visivo diretto dei composti dopo la derivatizzazione. Di conseguenza, l'HPTLC rappresenta una piattaforma intermedia efficace tra lo screening rapido delle microplacche e l'analisi completa HPLC–MS, bilanciando produttività, costi e selettività chimica.

L'analisi dei flavonoidi e fenoliche ha applicazioni molto diverse nella scienza alimentare, nei nutraceutici, nei farmaci, nell'agricoltura e nella ricerca sui materiali. Nella scienza alimentare, viene utilizzata per valutare la capacità antiossidante, l'autenticità, la durata di conservazione e il controllo della qualità di prodotti come succhi, vini e tè, oltre a supportare studi agronomici, inclusa la determinazione del tempo ottimale di raccolta basato sulla maturazione^{fenolica 33}. Nel settore nutraceutico, la profilazione fenolica è essenziale per la standardizzazione e la garanzia della qualità degli estratti botanici e dei prodotti commerciali come capsule di estratto di tè verde, integratori di estratto di semi d'uva, compresse di quercetina e formulazioni di bioflavonoidi agrumi. Nella ricerca farmaceutica e biomedica, queste analisi supportano lo screening di composti bioattivi con potenziale antiossidante, antinfiammatorio e^{antimicrobico 6}. In agricoltura e fisiologia vegetale, la determinazione fenolica aiuta a valutare le risposte allo stress delle piante e a guidare le strategie di miglioramento delle colture. Inoltre, nella scienza dei materiali—in particolare negli studi sugli inibitori della corrosione derivati dalle^{piante 34,35}—la caratterizzazione fenolica aiuta a corrispondere la composizione chimica al comportamento di adsorbimento e all'efficienza protettiva.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubi Eppendorf da 1,5 mL	Eppendorf
Fiaschette volumetriche da 10 mL	Eisco Labs	CH0451B	Tappo in polipropilene 10/19, vetro borosilicato, ambra - Segno di graduazione bianco, tolleranza e plusmn; 0,025 ml
100 & micro; L e 1000 & micro; Punte L micropippette	generico
100– 1000 & micro; Micropipetta L	Eppendorf	Research Plus
10– 100 & micro; Micropipetta L	Eppendorf	Research Plus
Tubi di vetro con tappi da 15 mL	generico
Becher da 50 mL	generico
Micropippetta multicanale a 8 canali	ThermoSciecntific
Micropiastre a 96 pozzi	Greiner	655891	Policicloolefina, fondo in vetro, nero
Bilancio analitico			± 0,0001 g
Campionatore TLC automatico	CAMAG	ATS4
Centrifuga	ThermoSciecntific	Sorvall ST8R	≥ 850 e volte; g
Carta filtrante	Whatman		Per la saturazione della camera
Liofilizzatore	LABCONCO	Modello 10
Serbatoi di reagenti plastici	Eppendorf
Spatola con estremità piatta e estremità cucchiaio	Prodotti chimici Merck	HS15906
Lettore di micropiastre multi-rilevamento Synergy HT	BioTek Instruments	Sinergia HT
Placche in alluminio con retro in alluminio TLC 60 F254 (10 e volte 20 cm)	Merck
Spruzzatore TLC	Sigma-Aldrich		20 mL
TLC Visualizer	CAMAG	2
Bagno/detergente a ultrasuoni	Creworks	ZX-040	con controllo della temperatura a 40 °C; C
Agnello UV	UPV	UVGL-58
Software VisionCATS	CAMAG
Sacchi zip-lock	Generico		1/4 di gallone