Articolo metodologico

Profilazione fenotipica dei fenotipi comportamentali simili a Parkinson indotti da MPTP nelle larve di pesce zebra, basata su un esperimento comportamentale

DOI:

10.3791/70041

⸱

15 maggio 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry, State Key Laboratory of Discovery and Utilization of Functional Components in Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Chemical Biology (Ministry of Education), NMPA Key Laboratory for Technology Research and Evaluation of Drug Products, School of Pharmaceutical Sciences, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2College of Information Engineering, Ningde Normal University, 3Digital Fujian Research Institute of Big Data for Elderly Rehabilitation and Nursing, 4Department of Neurology, Qilu Hospital Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 5Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Nankai University, 6Jinan Microecological Biomedicine Shandong Laboratory

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo stabilisce un paradigma di fenotipizzazione comportamentale nelle larve di pesce zebra trattate con MPTP per valutare i deficit motori e non motori simili alla malattia di Parkinson.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo introduce un protocollo unico e multiparametrico di fenotipizzazione comportamentale per il morbo di Parkinson (PD) indotto da MPTP nelle larve di pesci zebra. L'induzione chimica di patologie simili alla PD nel pesce zebra fornisce un sistema ad alta capacità e geneticamente trattabile, tuttavia la maggior parte degli studi si è concentrata strettamente su saghi locomotori di base o semplici transizioni luce-buio. Approcci così limitati non riescono a cogliere lo spettro più ampio delle disfunzioni correlate alla DP, che vanno dalla bradicinesia e i deficit sensorimotori a comportamenti simili all'ansia e disturbi del sonno. Per colmare questa lacuna, lo studio ha sviluppato una batteria integrata di 6 saghi complementari: test locomotore per valutare la trasmissione locomotoria generale ed esplorativa; valutazione della thigmotassi per rilevare comportamenti di preferenza ai margini legati all'ansia; test di risposta allo sobbaldo per registrare la bradicinesia e la reattività motoria compromessa; saggi di sfida chiaro-buio per valutare la capacità di assunzione al rischio e la reattività allo stress; paradigmi di risposta fotomotoria (inclusa la stimolazione con luce stroboscopica) per quantificare il movimento sensorimotorio e riflessivo; e monitoraggio della regolazione sonno-veglia per misurare il comportamento sonno-veglia. Le larve di pesce zebra sono esposte a concentrazioni subletali di MPTP da 1 giorno dopo la fecondazione (dpf) fino a 5 dpf, con valutazioni comportamentali avviate da 4 a 6 dpf. Il tracciamento automatizzato ad alta risoluzione genera diversi endpoint comportamentali per ogni saggio. Questo approccio scopre alterazioni simili a disturbi del disturbo di personalità precedentemente non rilevate, come architettura disordinata del sonno, apprendimento dell'abituazione compromesso, movimenti sensorimotori e riflessivi, riflettendo sintomi non motori precoci. Combinando questi saggi, i ricercatori ottengono un sintomo comportamentale completo che rispecchia più da vicino la complessità della DP umana. Questo protocollo amplia il paradigma per lo studio della patogenesi della DP, lo screening delle terapie candidate e l'esplorazione dei modulatori ambientali. Esso esemplifica l'obiettivo della collezione di presentare modelli animali innovativi che migliorano la rilevanza traslazionale attraverso un fenotipaggio robusto e multifaccettato.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il morbo di Parkinson (PD) è il secondo disturbo neurodegenerativo più diffuso dopo il morbodi Alzheimer 1. La sua prevalenza e il numero di persone colpite sono aumentati costantemente negli ultimi anni, rappresentando una significativa sfida per la salute pubblica a livellomondiale 2. Il tasso di incidenza della DP aumenta notevolmente conl'età di 3,4 anni. Clinicamente, la DP si manifesta sia attraverso sintomi motori — come discinesia, bradicinesia, tremolio a riposo e instabilità posturale — sia attraverso una varietà di sintomi non motori, tra cui compromissione cognitiva, ansia e disturbi delsonno 5. Attualmente, la diagnosi di DP dipende principalmente dalla presenza di sintomimotori 6; Tuttavia, quando questi sintomi diventano evidenti, oltre il 60% dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra è già statoperso. Sebbene i sintomi non motori compaiano frequentemente prima, l'assenza di criteri di valutazione specifici e oggettivi complica la diagnosi e l'interventoprecoce 8. Attualmente, il trattamento principale per la DP prevede la somministrazione di levodopa9, che viene convertita in dopamina nel cervello, ripristinando così i livelli di dopamina nello striato. Sebbene questo trattamento possa alleviare temporaneamente i sintomi, non ferma la progressione dellamalattia 10. Di conseguenza, è essenziale ulteriori ricerche sulla patogenesi della DP e sullo screening antidroga.

Costruire modelli animali adeguati è fondamentale per la ricerca sulla patogenesi della DP e sullo screening anti-DP. Ora, ci sono tre modelli principali per gli studi sulla PD: modello di induzionechimica 11, modello di editinggenico 12 e modello di xenotrapiantoumano 13. Gli animali modello comunemente usati includono roditori, come itopi 14, e primati non umani come lescimmie 15. Recentemente, il pesce zebra (Danio rerio) ha attirato sempre più attenzione negli studi sulla PD per i loro vantaggi come dimensioni ridotte, crescita rapida, alta omologia genetica con l'uomo e embrionitrasparenti 16. L'uso della neurotossina MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina) per indurre danni ai neuronidopaminergici 17,18 è un metodo classico per costruire un modello PD. I pesci zebra esposti a concentrazioni subletali di MPTP mostrano vari fenotipi comportamentali simili a quelli del PD19.

Tuttavia, la maggior parte degli studi sulla PD sui pesci zebra oggi si concentra principalmente sui comportamenti locomotori di base o sulle semplici transizioni chiaro-buio16,20, e i sagaggi comportamentali monodimensionali sono difficili da riflettere pienamente le complesse caratteristiche comportamentali della PD, in particolare i cambiamenti comportamentali nella funzione non motoria. Considerando che la DP è una malattia che coinvolge molteplici sistemi neurocomportamentali oltre il controllomotorio 21,22,23, è urgentemente necessario un metodo multiparametrico di valutazione dei fenotipi comportamentali per catturare i suoi fenotipi multisistemici 24.

Di conseguenza, questo studio costruisce un protocollo di fenotipizzazione comportamentale multipla, parametrica e rapida per descrivere in modo più completo i fenotipi comportamentali simili alla PD nelle larve di pesce zebra trattate con MPTP. Una dose subletale di MPTP (50 μM)25 è stata applicata alle larve da 1 a 5 giorni dopo la fecondazione (dpf)16,20,26. Da 4 a 6 dpf16, 20, 24, abbiamo condotto 6 test comportamentali: monitoraggio della regolazione sonno-veglia, paradigmi di risposta fotomotoria, valutazione della tigmotassi, valutazione locomotoria, test di risposta allo sobbaldo e test di sfida luce-oscurità. Queste valutazioni comportamentali coprono sia aspetti motori che non motori, come deficit di movimento, sensorimotori, apprendimento dell'abituazione, assunzione di rischi, reattività allo stress e ritmo sonno-veglia.

Utilizzando il sistema di tracciamento video ad alto throughput Zebrabox e il metodo di analisi quantitativa, abbiamo estratto e quantificato vari parametri comportamentali e confrontato le differenze comportamentali tra il gruppo trattato con MPTP e quello di tipo selvatico (WT) tramite statistica. Rispetto agli attuali saggi PD del pesce zebra, questa batteria comportamentale multiparametrica cattura fenotipi motori e non motori all'interno di un quadro standardizzato. Il sistema di tracciamento automatizzato garantisce acquisizione oggettiva di dati comportamentali e un'alta riproducibilità. Inoltre, la piccola dimensione corporea delle larve permette di collocare singoli animali in piastre multi-pozzetto, consentendo una valutazione ad alto rendimento. I vantaggi sopra sopra sono utili per analizzare a fondo il meccanismo patologico della DP, analizzare i farmaci o i composti candidati e esplorare l'influenza dei fattori ambientali sull'occorrenza o lo sviluppo della MP.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio che ha coinvolto il pesce zebra è stato condotto in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali, ed è stato approvato dal Comitato Etico della School of Pharmaceutical Sciences dell'Università di Shandong (n.YXDW2025-0056). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione MPTP

  1. Prepara 1× mezzo E3 diluendo 100× soluzione stock E3 1:100 con acqua ultrapura (ad esempio, miscela 5 mL di 100× E3 con 495 mL di acqua ultrapura per ottenere 500 mL di mezzo 1× E3).
    NOTA: Prepara E3 medium fresco il giorno dell'uso.
  2. Prepara una soluzione MPTP da 1 mM aggiungendo 5,0 mg di polvere MPTP a un tubo centrifuga da 50 mL e aggiungendo mezzo E3 a un volume finale di 25 mL (usa il tubo della centrifuga come contenitore di miscelazione, ma non è necessaria centrifugazione). Etichetta la soluzione come soluzione MPTP stock da 1 mM. Conserva la soluzione originale al buio.
  3. Preparazione della soluzione MPTP da 50 μM: trasferire 2,5 mL della soluzione stock MPTP da 1 mM in un contenitore pulito e diluire con 47,5 mL di mezzo E3 per ottenere un volume finale di 50 mL a una concentrazione finale di 50 μM MPTP. La parte rimanente della soluzione originale continuò a essere conservata al buio.
    ATTENZIONE: La MPTP è una neurotossina potente e deve essere gestita con estrema cautela. Indossa sempre l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) adeguata, inclusi guanti, camice da laboratorio e occhiali protettivi. Smaltimento dei rifiuti MPTP secondo le linee guida istituzionali per la biosicurezza.

2. Preparazione e raggruppamento degli embrioni di pesce zebra

  1. Seleziona maschi e femmine adulti di pesce zebra sessualmente maturi e effettua riproduzione controllata utilizzando vasche di riproduzione con divisori rimovibili. Alle 20:00, posiziona maschi e femmine di pesci zebra separatamente nelle vasche di riproduzione in un rapporto di 2:3, e separali con dei divisori.
  2. Il giorno successivo, rimuovere i divisori alle 8:00 per permettere l'accoppiamento, iniziando così la deposizione delle uova. Raccogli gli embrioni dopo 1 ora e lavali tre volte con acqua pulita del sistema.
  3. Ospita gli embrioni in piastre di Petri da 100 mm con mezzo E3 fresco, e li incubano a 28 °C in un ciclo di 14 ore di luce / 10 ore di buio (luci accese dalle 08:00 alle 22:00).
    NOTA: Non superare i 50 embrioni per piatto con un substrato di 20 mL per garantire uno sviluppo normale.
  4. A 1 dpf, rimuovere con cura gli embrioni non fecondati, malformati e anomali utilizzando una pipetta Pasteur e sostituire la soluzione contenente embrioni di pesce zebra. Per il gruppo WT, sostituire il mezzo esistente con un nuovo substrato embrionale E3. Per il gruppo trattato con MPTP, sostituire il mezzo con una soluzione MPTP da 50 μM (Figura 1A), poi riportare entrambi i gruppi nell'incubatrice.
  5. Per entrambi i gruppi, sostituire la soluzione e rimuovere ogni embrione morto o malsano ogni 24 ore. Per il gruppo trattato con MPTP, sostituire la soluzione MPTP ogni giorno dalla mattina di 1 dpf fino a quella di 4 dpf (Figura 1A). Successivamente, si passa il gruppo trattato con MPTP al mezzo E3 a partire dalla mattina di 5 dpf fino alla fine dell'esperimento.
    NOTA: Sostituire delicatamente la soluzione con una pipetta Pasteur. Aspirare lentamente il mezzo dal bordo della piastra di Petri e aggiungere una soluzione fresca lungo la parete della piastra di Petri per minimizzare il disturbo agli embrioni.

3. Monitoraggio della regolazione del sonno - veglia

  1. A 4 dpf, selezionare le larve di pesce zebra da ogni gruppo alle 18:00 e trasferirle su una piastra da 96 pozzi utilizzando una pipeta Pasteur modificata da 3 mL con la punta tagliata, una larva per pozzo (Figura 1B). Le prime quattro righe rappresentano i gruppi WT, e le ultime quattro righe rappresentano i gruppi MPTP (48 pesci zebra in ciascun gruppo).
    NOTA: Per evitare di stimolare o danneggiare il pesce zebra, modificare le pipette Pasteur tagliando la punta (10 mm) per fornire un diametro ampio superiore a quello di 4 larve di pesce zebra dpf (la lunghezza del corpo supera i3,7 mm 27,28).
  2. Osserva ogni pozzo con un microscopio stereoscopico per assicurarti che l'aspetto di ogni larva di pesce zebra sia sano, le pinne siano aperte e regolarmente oscillate, il corpo sia eretto e la vescica natatoria sia gonfiata29. Dopo esserti assicurato che i pesci zebra in ogni pozzo siano in uno stato sano, riempi ogni pozzo con un mezzo E3.
    NOTA: Riempire ogni pozzo con E3 da medio a quasi progonfiamento, assicurandosi che la tensione superficiale sia mantenuta. Aggiungi con attenzione il liquido per evitare bolle e traboccare tra i pozzi.
  3. Dopo aver trasferito il pesce e il liquido in una piastra da 96 pozzi, posizionalo nella camera Zebrabox per acclimatarsi per 30 minuti prima del test comportamentale sonno-veglia.
    NOTA: Prima di posizionare la piastra a 96 pozzi nella camera Zebrabox, pulisci con attenzione la parte inferiore della piastra per evitare che sporco possa influenzare i risultati del tracciamento video.
  4. Apri il software di tracciamento video Zebralab, seleziona la modalità Quantizzazione e assicurati che la piastra a 96 pozzi sia posizionata centralmente sul fondo della camera Zebrabox.
  5. Imposta la regolazione della luce per spegnere la luce alle 22:00 e accendere la luce alle 8:00, coerente con le condizioni di luce durante l'allevamento del pesce zebra. Durante il giorno, la luce bianca è generalmente intorno ai 1000 lux. Imposta i parametri software comesegue: 29: soglia di rilevamento, 40; burst, 25 (soglia per il movimento); congelamento (soglia per il movimento), 4; dimensione del contenitore, 60 s; tempo totale di monitoraggio, 52 ore (20:00 del primo giorno fino alle 00:00 del terzo giorno). Inizia la procedura di sonno-veglia alle 20:00.
    NOTA: Una volta avviata la procedura, proibire qualsiasi rumore e vibrazione provenienti dall'esterno durante l'esperimento, per non alterare il normale ritmo sonno-veglia dei pesci zebra. Per prevenire l'evaporazione dell'acqua durante il monitoraggio a lungo termine, copri la piastra a 96 pozzi con pellicola trasparente.
  6. Dopo 52 ore, ferma l'esperimento sonno-veglia e salva il file dati. Rimuovi la piastra a 96 pozzi dalla ZebraBox.
    NOTA: Utilizzando MATLAB ed Excel, parametri necessari come il numero di episodi di sonno (il periodo di sonno è definito come periodi di inattività che durano almeno 1 minuto)29, la durata media dei periodi di sonno (durata media dei periodi di sonno), la durata totale del sonno (tutta la durata dei periodi di sonno durante il periodo di monitoraggio), la latenza del sonno (tempo dalla transizione leggera all'inizio del primo periodo di sonno), l'attività media (definita come attività locomotoria durante tutto il periodo di monitoraggio) e l'attività di veglia (definita come attività locomotoria solo durante il periodo di veglia, escludendo i periodi di sonno) sono state estratte e analizzate dal file dati.
    1. Utilizzare il test t dello studente per confrontare le differenze tra il gruppo WT e quello trattato con l'MPTP. Inoltre, traccia la curva del sonno, la curva dell'attività nella veglia e la curva media di attività dei pesci zebra nelle 52 ore utilizzando il software MATLAB.

4. Paradigmi di risposta fotomotoria

NOTA: I paradigmi di risposta fotomotoria (inclusa la luce stroboscopica) sono test comportamentali ad alta capacità in 5 larve dpf per quantificare i cambiamenti locomotori sensomotori e riflessivi in risposta a una transizione improvvisa della luce. Questo test è stato condotto utilizzando una piastra a 96 pozzi, inclusi 2 paradigmi: (1) una transizione luminosa da 1 minuto di oscurità a 1 minuto di luce costante (1000 lx), e (2) una risposta stroboscopica che comporta una transizione da 1 minuto di oscurità a 1 minuto di luce stroboscopica a 10 Hz.

  1. Posizionare le 5 larve dpf in una piastra da 96 pozzi (1 larva per pozzo) (Figura 1B) e riempire ogni pozzo con mezzo E3. Dividere in totale 96 larve in gruppo WT e gruppo MPTP in media.
  2. Paradigma luce costante al buio:
    1. Posiziona la piastra a 96 pozzi con 5 larve di dpf nella Zebrabox e lascia che le larve si acclimatino per 5 minuti al buio prima del saggio.
    2. Apri la modalità di analisi online Tracciamento.
    3. Imposta il programma di transizione della luce come segue: 0-60 s: Scuro, 60-120s: Luce costante (1000 lx).
    4. Avvia il protocollo, raccogli i parametri di movimento correlati ogni 6 secondi durante il test di 120 secondi.
    5. Ferma il protocollo al 120° s, esporta il file dati. Posizionare le larve nell'oscurità totale per 5 minuti per ambientarsi, preparandole al successivo test di luce stroboscopica scura.
  3. Paradigma della luce stroboscopica scura:
    1. Imposta il programma di transizione luminosa come segue: 0-60 s: Scuro, 60-120s: luce stroboscopica (1000 lx) a 10 Hz.
      NOTA: Uno stroboscopio a 10 Hz corrisponde a 10 impulsi luminosi al secondo. In ZebraLab, implementa questo alternando l'intensità luminosa da 0 a 1000 lx ogni 100 ms.
    2. Al termine dell'adattamento scuro di 5 minuti, inizia il test da scuro a luce stroboscopica. Raccogli i parametri di movimento ogni 6 secondi durante il test di 120 secondi.
  4. Analisi dei dati: una volta terminato il saggio, esporta il file dati. Usa il software MATLAB per estrarre la distanza di nuoto ogni 6 secondi. Traccia la distanza totale (valore medio ogni 6 secondi) effettuata nel periodo di 2 minuti per entrambi i test. Calcolare l'indice di gelo sottraendo la distanza totale percorsa in 1 minuto al buio dalla distanza totale percorsa nellaluce 30.
    NOTA: L'Indice di Congelamento < 0 indica comportamento di congelamento; l'indice di congelamento > 0 indica fuga; Indice di congelamento = 0 significa nessuna reazione. Utilizzare un test t di Student e un'ANOVA bidirezionale per confrontare le differenze tra il gruppo WT e quello trattato con MPTP. Per ogni gruppo sono state utilizzate in totale 48 larve di pesce zebra (n = 48).

5. Valutazione della thigmotassi

  1. Seleziona due piastre a 6 pozzi, riempi ciascuna pozzo con un mezzo E3 da 4 mL.
  2. A 5 dpf, le larve di pesce zebra del gruppo WT e del gruppo trattato con MPTP sono state raccolte e inserite in due piastre a 6 pozzi (una è il gruppo WT e l'altra è il gruppo trattato con MPTP, 1 larva per pozzo) (Figura 1C).
    NOTA: Assicurarsi che la posizione iniziale delle larve sia al centro dei pozzi.
  3. Prima della valutazione della thigmotassi, le piastre del pozzo devono essere posizionate nella posizione appropriata di Zebrabox 15 minuti prima per essere adattate.
  4. Raccolta e analisi dei dati: Utilizzando la funzione Draw Area , disegna due cerchi concentrici nell'area di osservazione di ciascun pozzo (il raggio del cerchio centrale rappresenta 1/2 del raggio del foro) (Figura 1C), e i parametri restanti sono impostati per essere uguali alla valutazione locomotoria. Inizia il protocollo per la valutazione della thigmotassi di 5 minuti e fai un esperimento parallelo.
    NOTA: Dopo la fine del programma, il software Zebralab genererà la traiettoria delle larve di pesce zebra entro 5 minuti e vari parametri di movimento correlati. Nel file dati, an1 rappresenta l'intera area di ogni pozzo, e an2 rappresenta la zona interna di ciascun pozzo. Quindi, dis(an1) totale e dur(an1) totale indicano la distanza totale di nuoto e il tempo totale trascorso nell'intero pozzo, mentre dis(an2) totale e dur(an2) totale rappresentano rispettivamente la distanza e il tempo trascorso nella zona interna.
    1. Calcola la thigmotassi con le seguenti formule:
      Calcola la percentuale di distanza nuotata nella zona esterna:
      figure-protocol-1
      Calcola la percentuale di tempo trascorso nella zona esterna:
      figure-protocol-2
    2. Utilizzare il test t di uno studente per confrontare le differenze di tigmotassi tra il gruppo WT e quello trattato con MPTP. Per ogni gruppo sono state utilizzate in totale 24 larve di pesce zebra (n = 24).

6. Valutazione locomotoria

  1. A 5 dpf, si selezionano le larve di pesce zebra dal gruppo WT e dal gruppo trattato con MPTP, e trasferite rispettivamente su due piastre da 12 pozzi (una è il gruppo WT e l'altra è il gruppo trattato con MPTP, 1 larva per pozzo, con 2 mL di mezzo E3) (Figura 1D).
    NOTA: Assicurati che le dimensioni delle larve del pesce zebra siano simili e le larve selezionate dovrebbero avere pinne aperte, postura eretta, buona espansione della vescica natatoria e movimento regolare.
  2. Prima della valutazione locomotoria, posizionare la piastra del pozzo nella posizione di prova dello Zebrabox 15 minuti prima per adattarla.
    NOTA: Assicurarsi che le condizioni di luce durante l'adattamento siano coerenti con quelle durante il test.
  3. Dopo un periodo di acclimatazione di 15 minuti, selezionare la modalità di tracciamento - analisi online, registrare l'attività locomotoria di ogni larva per 5 minuti utilizzando un sistema automatizzato di video-tracciamento. Utilizzando il software Zebralab per raccogliere traccia di movimento e una varietà di parametri locomotori correlati ogni 60 s, esportare il file dati completo e utilizzare MATLAB per analizzare la distanza totale e la velocità media di ogni larva in 5 minuti.
    1. Utilizzare un test t di Student e un'ANOVA bidirezionale per confrontare le differenze tra il gruppo WT e quello trattato con MPTP. Per ogni gruppo sono state utilizzate in totale 24 larve di pesce zebra (n = 24).

7. Test di risposta allo sobbaldo

NOTA: Questo test misura la risposta visiva allo sobbalzo (VSR), nota anche come sorpresa indotta da lampo di oscurità, provocata da transizioni improvvise verso l'oscurità. Questo test di risposta allo spavento valuta uno sobbalzo visivo evocato da foti, indotto da lampi scuri improvvisi in scala di millisecondi. A differenza del paradigma della luce stroboscopica scura, che prevede impulsi di luce ripetuti per valutare risposte comportamentali sostenute, questo saggio si concentra su reazioni motorie rapide e riflessive a uno stimolo visivo acuto.

  1. Preparazioni: a 5 DPF, selezionare le larve di pesce zebra dal gruppo WT e dal gruppo trattato con MPTP, e trasferirle rispettivamente su due piastre da 12 pozzi (una è il gruppo WT e l'altra è il gruppo trattato con MPTP, 1 larva per pozzo, con 2 mL di mezzo E3) (Figura 1D).
  2. Prima del test di risposta allo sbaldo, posizionare la piastra del pozzo nella posizione di prova dello Zebrabox 5 minuti prima per adattarla.
  3. Imposta i parametri di stimolazione: apri il software Zebralab , esegui la modalità di analisi online Tracking , apri l'interfaccia di innesco della luce , seleziona Usa uno dei 3 metodi di attivazione qui sotto, abilita Stimoli potenziati, imposta su Quando la sessione è iniziata; Nel programma di transizione, il ritmo del lampo scuro è definito come segue (il programma inizia a attivarsi dopo 21 s): Transizione 1: 5 ms, intensità luminosa al 100%; Transizione 2: 2890 ms, intensità luminosa al 100%; Transizione 3: 5 ms, 0% di intensità luminosa; Transizione 4: 100 ms, 0% di intensità luminosa; spunta Ripeti la lista delle transizioni per garantire lampeggiamenti periodici.
  4. Avvio protocollo: assicurati che la funzione di registrazione video Numeriscope sia attivata, il tracciamento automatizzato ad alta produttività genererà un dataset multidimensionale che comprenderà 30 endpoint comportamentali in questo test del '90 s.
  5. Analisi dei dati: Dopo aver completato il test di risposta allo sguardo, esportare i file di dati grezzi e importarli nel software MATLAB per l'analisi. Calcola la distanza di nuoto di ogni larva in intervalli di 3 secondi, insieme alla velocità media di nuoto.
    1. Identifica la distanza di movimento di picco, la velocità di picco o la latenza di risposta dopo lo stimolo lampo per ciascun gruppo. Utilizzare un test t di Student e un'ANOVA bidirezionale per confrontare le differenze tra il gruppo WT e quello trattato con MPTP. Per ogni gruppo sono state utilizzate in totale 24 larve di pesce zebra (n = 24).

8. Saggio di sfida chiaro-oscuro

  1. A 5 dpf, trasferire le larve di pesce zebra singolarmente in due piastre da 24 pozzi (Figura 1E), con una larva per pozzo e 1 mL di mezzo E3 per pozzo. Ogni piastra conteneva 24 larve, e le due piastre da 24 pozzetti erano equamente divise nel gruppo WT e nel gruppo trattato con MPTP (n = 24 per gruppo).
  2. Prima del test, posizionare la piastra a 24 pozzi nell'area designata all'interno dello Zebrabox per un periodo di 5 minuti di acclimatazione alla luce per adattarsi all'ambiente di test. Attiva la modalità Tracciamento-Analisi Online. Configura il programma di luce come segue: 6 minuti di luce costante seguiti da 4 minuti di completa oscurità (Figura 1E). Il tempo totale di test è di 10 minuti, e il tempo intervallare per la raccolta dei dati è di 60 secondi.
    NOTA: I 6 minuti globali di luce servono per l'acclimatazione e l'abituazione, garantendo una linea di base stabile e risposte speciali luce-oscurità31,32.
  3. Aldecimo minuto, interrompi la registrazione comportamentale e il salvataggio dei dati. Rimuovi con attenzione il piatto dalla Scatola Zebra.
  4. Per ogni larva, estrarre la distanza di nuoto a ogni intervallo di 60 secondi. Calcola la distanza percorsa durante la fase di luce (0-6 minuto ), la fase oscura (7-10 minuto ) e il periodo totale di 10 minuti. Quantificare il comportamento della timotassi e le prestazioni di apprendimento dell'abituazione nella fase buia.
    NOTA: L'apprendimento per abituazione è definito come la riduzione di una risposta comportamentale quando un animale è esposto a uno stimolo/ambiente continuo33,34, ed è stato valutato confrontando statisticamente la distanza totale media percorsa (mm) durante il primo minuto e ilquarto minuto successivo alla transizione dalla luce all'oscurità. Utilizzare un test t di Student e un'ANOVA bidirezionale per confrontare le differenze tra il gruppo WT e quello trattato con MPTP. Per ogni gruppo sono state utilizzate in totale 24 larve di pesce zebra (n = 24).

9. Smaltimento dei rifiuti MPTP

NOTA: Dopo ogni esperimento comportamentale, spruzzare e pulire superfici contattate con MPTP (ad esempio, banchi di laboratorio e la ZebraBox) con ipoclorito di sodio appena preparato (candeggina; ≥10% v/v).

  1. Raccogliere i rifiuti liquidi (inclusi i residui di esposizione e i mezzi di risciacqua) e i rifiuti solidi (ad esempio, pipette Pasteur, guanti, piastre di Petri e piastre multi-pozzetto) del MPTP. Etichettali chiaramente come rifiuti neurotossici pericolosi.
  2. Trattare i rifiuti liquidi contaminati e i materiali solidi con ipoclorito di sodio appena preparato (candeggina; ≥10% v/v) per almeno 24 ore per garantire la decontaminazione, seguita dallo smaltimento secondo le normative istituzionali.
  3. Eutanasia le larve di pesce zebra trattate con MPTP immergendole in una soluzione diluita di ipoclorito di sodio (ad esempio, rapporto 1:5 di candeggina 6% acqua) per 5minuti e 35. Morte confermata per mancanza di movimento e battito cardiaco. Trattare le larve e i mezzi decontaminati come rifiuti biologici pericolosi per lo smaltimento istituzionale (seguendo i protocolli approvati dall'istituzione).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monitoraggio della regolazione sonno-veglia
Il monitoraggio della regolazione sonno-veglia di 52 ore è iniziato a 4 dpf ed è stato condotto utilizzando una piastra a 96 pozzi. Il pesce zebra trattato con MPTP ha mostrato significative interruzioni nella struttura del sonno rispetto al gruppo WT. Curve rappresentative del sonno, grafici di attività della veglia e tracce medie di attività sono mostrate nella Figura 2. I parametri dell'anali...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio ha sviluppato e verificato un protocollo completo per valutare e analizzare il fenotipo comportamentale simile al PD indotto da MPTP. Questo protocollo ha integrato 6 diversi test: valutazione locomotoria, test di timotassi, test di risposta allo scosso, paradigmi di risposta fotomotoria (inclusa la stimolazione con luce stroboscopica), test di sfida luce-oscurità e monitoraggio della regolazione sonno-veglia, per valutare e rappresentare i difetti motori e non motori della...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (n. 21906095), del programma Young Scholar Future Sponsorship dell'Università di Shandong, della Shandong Natural Science Foundation (n. ZR2019BB018), i Fondi per la Ricerca Fondamentale dell'Università di Shandong (n. 2017GN0030), la Fondazione Cinese per la Scienza Post-Dottorato (n. 2018M640640). È inoltre supportata sia dall'Open Research Fund 2025 del Digital Fujian Institute of Big Data for Elderly Rehabilitation and Nursing (Grant No. BDRI202502) e il Fondo di Ricerca Aperta 2025 del Laboratorio Chiave dei Materiali Bioattivi, Ministero dell'Istruzione, Università di Nankai (Grant n. SWHX-202503). Progetto di ricerca del Laboratorio di Biomedicina Microecologica Jinan Shandong (Grant No.JNL-2023002KF). Gli autori desiderano ringraziare il Centro per gli Animali da Laboratorio, l'Ospedale Qilu dell'Università di Shandong e il Dr. Sun Chengxi del Dipartimento di Laboratorio Clinico dell'Ospedale Qilu dell'Università di Shandong, per il loro aiuto durante l'esperimento.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
100 e volte; Soluzione standard E3Shanghai Feixi BiotecnologiaN/Acontenente 34,8 g di NaCl, 1,6 g di KCl, 5,8 g di CaCl2 e middot; 2H2O, e 9,78 g di MgCl2· 6H2O per litro
Piastra di coltura cellulare a 12 pozziBiotecnologia NEST712011Non trattato, non pirogenico, sterile, polistirene. Utilizzato per analisi comportamentali larve di pesci zebra
Piastra di coltura cellulare a 24 pozziBiotecnologia NEST702011Non trattato, non pirogenico, sterile, polistirene. Utilizzato per analisi comportamentali larve di pesci zebra
Pipetta Pasteur da 3 mLBiologix30-0238A1
Piastra di coltura cellulare a 6 pozziBiotecnologia NEST703011Non trattato, non pirogenico, sterile, polistirene. Utilizzato per analisi comportamentali larve di pesci zebra
Piastra di coltura cellulare a 96 pozziBiotecnologia NEST701011Non trattato, non pirogenico, sterile, polistirene. Utilizzato per analisi comportamentali larve di pesci zebra
MATLAB R2020aMathWorks, USA & nbsp;N/AMATLAB R2020a, Licenza per tutto il campus ottenuta dal portale software dell'Università di Shandong (softms.sdu.edu.cn). Utilizzato per l'analisi statistica dei dati comportamentali delle larve di pesce zebra.
Microsoft ExcelMicrosoftN/AMicrosoft Excel (parte di Microsoft Office), versione installata tramite il portale software con licenza dell'Università di Shandong (softms.sdu.edu.cn).
MPTP(1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina) Beyotime411252815 mg
Piastra di PetriBiotecnologia NEST704202100 mm, sterile, manico da presa facile, trattato con TC
Soluzione di ipoclorito di sodioMacklinS817439Soluzione di candeggina domestica stock (base cloro attivo 6-14%), diluita a ≥ 10% v/v per la decontaminazione superficiale e dei rifiuti; inoltre diluito 1:5 (6% di candeggina: acqua) per l'eutanasia di larve di pesce zebra trattate con MPTP.
Microscopio stereoOlympusSerie SZX2
Sistema di Tracciamento Video ad Alta Risoluzione Zebrabox  Viewpoint, Francia & nbsp;N/A
Zebralab Software Viewpoint, Francia & nbsp;N/AVersione (3,52,3,87)

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elbaz, A., Carcaillon, L., Kab, S., Moisan, F. Epidemiology of Parkinson's disease. Rev. Neurol. (Paris). 172 (1), 14-26 (2016).
  2. Elgueta, D., et al. Analyzing the Parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human alpha-synuclein. J Vis Exp. (185), e63313(2022).
  3. Peng, S. Y., Liu, P., Wang, X. W., Li, K. Y. Global, regional and national burden of Parkinson's disease in people over 55 years of age: a systematic analysis of the global burden of disease study, 1991-2021. BMC Neurol. 25, 178(2025).
  4. Zhu, J. Q., et al. Temporal trends in the prevalence of Parkinson's disease from 1980 to 2023: a systematic review and meta-analysis. Lancet Healthy Longev. 5 (7), 464-479 (2024).
  5. Goldman, J. G. Non-motor symptoms and treatments in Parkinson's disease. Neurol Clin. 43 (2), 291-317 (2025).
  6. Kobylecki, C. Update on the diagnosis and management of Parkinson's disease. Clin Med. (Lond). 20 (4), 393-398 (2020).
  7. Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson's disease. NPJ Parkinsons Dis. 7, 116(2021).
  8. Tolosa, E., Garrido, A., Scholz, S. W., Poewe, W. Challenges in the diagnosis of Parkinson's disease. Lancet Neurol. 20 (5), 385-397 (2021).
  9. Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. J. Parkinsons Dis. 3 (3), 255-269 (2013).
  10. Kalia, L. V., et al. Disease-modifying therapies for Parkinson's disease: Lessons from multiple sclerosis. Nat Rev Neurol. 20 (12), 724-737 (2024).
  11. Thirugnanam, T., Santhakumar, K. Chemically induced models of Parkinson's disease. Comp. Biochem. Physiol C Toxicol Pharmacol. 252, 109213(2022).
  12. Crabtree, D. M., Zhang, J. H. Genetically engineered mouse models of Parkinson's disease. Brain Res. Bull. 88 (1), 13-32 (2012).
  13. Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell Stem Cell. 16 (3), 269-274 (2015).
  14. Dovonou, A., et al. Animal models of Parkinson's disease: bridging the gap between disease hallmarks and research questions. Transl. Neurodegener. 12, 36(2023).
  15. Potts, L. F., et al. Modeling Parkinson's disease in monkeys for translational studies: A critical analysis. Exp. Neurol. 256, 133-143 (2014).
  16. Doyle, J. M., Croll, R. P. A critical review of zebrafish models of Parkinson's disease. Front. Pharmacol. 13, 835827(2022).
  17. Bagwell, E., Larsen, J. A. A review of MPTP-induced Parkinsonism in adult zebrafish to explore pharmacological interventions for human Parkinson's disease. Front. Neurosci. 18, 1451845(2024).
  18. Feng, X. -Z., et al. Behavioral assessments of spontaneous locomotion in a murine MPTP-induced Parkinson's disease model. J Vis Exp. 143, e58653(2019).
  19. Razali, K., Kumar, J., Mohamed, W. M. Y. Characterizing the adult zebrafish model of Parkinson's disease: a systematic review of dynamic changes in behavior and physiology post-MPTP administration. Front. Neurosci. 18, 1432102(2024).
  20. Brinez-Gallego, P., et al. Experimental models of chemically induced Parkinson's disease in zebrafish at the embryonic larval stage: A systematic review. J Toxicol Environ Health B Crit Rev. 26 (4), 201-237 (2023).
  21. Xu, Z. H., et al. Deep clinical phenotyping of Parkinson's disease: Towards a new era of research and clinical care. Phenomics. 2 (5), 349-361 (2022).
  22. Tinaz, S. Functional connectome in Parkinson's disease and Parkinsonism. Curr Neurol Neurosci Rep. 21, 24(2021).
  23. Costa, H. N., et al. Parkinson's disease: A multisystem disorder. Neurosci Bull. 39 (1), 113-124 (2023).
  24. Christensen, C., Thorsteinsson, H., Maier, V. H., Karlsson, K. Æ Multi-parameter behavioral phenotyping of the MPP⁺ model of Parkinson's disease in zebrafish. Front Behav Neurosci. 14, 623924(2020).
  25. Zhang, S., et al. Anti-Parkinson's disease activity of phenolic acids from Eucommia ulmoides Oliver leaf extracts and their autophagy activation mechanism. Food Funct. 11 (2), 1425-1440 (2020).
  26. Maleski, A. L. A., et al. Integrated behavioral and proteomic characterization of MPP⁺-induced early neurodegeneration and Parkinsonism in zebrafish larvae. Int J Mol Sci. 26 (14), 6762(2025).
  27. Vauti, F., et al. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PLoS One. 15 (8), e0237167(2020).
  28. Parichy, D. M., et al. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  29. Lee, D. A., Oikonomou, G., Prober, D. A. Large-scale analysis of sleep in zebrafish. Bio Protoc. 12 (3), e4313(2022).
  30. Shen, Q., et al. Rapid well-plate assays for motor and social behaviors in larval zebrafish. Behav Brain Res. 391, 112625(2020).
  31. Rock, S., et al. Detailed analysis of zebrafish larval behaviour in the light-dark challenge assay shows that diel hatching time determines individual variation. Front Physiol. 13, 827282(2022).
  32. Hillman, C., Kearn, J., Parker, M. O. A unified approach to investigating 4 dpf zebrafish larval behaviour through a standardised light/dark assay. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 134, 111084(2024).
  33. Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacol. 33 (5), 1206-1215 (2008).
  34. Gomez-Laplaza, L. M., Gerlai, R. Latent learning in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 208 (2), 509-515 (2010).
  35. Winn, A. A., Prestia, K. A., Peneyra, S. M. Testing alternative surface disinfection agents for zebrafish (Danio rerio) embryos. J Am Assoc Lab Anim Sci. 60 (5), 510-518 (2021).
  36. Wagle, M., Nguyen, J., Lee, S., Zaitlen, N., Guo, S. Heritable natural variation of an anxiety-like behavior in larval zebrafish. J Neurogenet. 31 (3), 138-148 (2017).
  37. Maximino, C., et al. Measuring anxiety in zebrafish: a critical review. Behav Brain Res. 214 (2), 157-171 (2010).
  38. Schnorr, S. J., Steenbergen, P. J., Richardson, M. K., Champagne, D. L. Measuring thigmotaxis in larval zebrafish. Behav Brain Res. 228 (2), 367-374 (2012).
  39. Dekens, M. P. S., Fontinha, B. M., Gallach, M., Pflugler, S., Tessmar-Raible, K. Melanopsin elevates locomotor activity during the wake state of the diurnal zebrafish. EMBO Rep. 23 (5), e51528(2022).
  40. Lee, H. B., et al. Key HPI axis receptors facilitate light adaptive behavior in larval zebrafish. Sci Rep. 14 (1), 7759(2024).
  41. Cavanagh, J. F., Kumar, P., Mueller, A. A., Richardson, S. P., Mueen, A. Diminished EEG habituation to novel events effectively classifies Parkinson's patients. Clin Neurophysiol. 129 (2), 409-418 (2018).
  42. Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldua, D. Neurotoxicity assessment in adult Danio rerio using a battery of behavioral tests in a single tank. J Vis Exp. 201, e65869(2023).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Modello di Parkinson nel pesce zebraInduzione con MPTPFenotipizzazione comportamentaleLarve di pesce zebraSaggio locomotorioValutazione della tigmotassiTest della risposta di soprassaltoChallenge luce buioMonitoraggio sonno vegliaVideo tracking automatizzato

Articoli correlati