Articolo metodologico

Registrazioni di fotometria multifibra bicolore della rete comportamentale sociale nei topi

DOI:

10.3791/70049

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17 marzo 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Princeton Neuroscience Institute, Princeton University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fotometria delle fibre è una delle tecniche più comuni utilizzate per registrare l'attività del calcio nelle popolazioni neurali profonde del cervello. Qui descriviamo un protocollo per l'imaging personalizzabile multisito a due colori dell'attività del calcio e di altri segnali dinamici fluorescenti provenienti da popolazioni neurali cerebrali profonde nei topi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fotometria a fibra, ovvero la registrazione di massa dei segnali attraverso un cavo a fibra ottica, è un metodo utile per registrare l'attività calciale di gruppi di neuroni nel roditore in movimento libero. In particolare, questo metodo rende il targeting di piccole popolazioni di neuroni geneticamente specificati in aree più ventrali e meno accessibili del cervello un problema gestibile, poiché rimane difficile registrarlo a risoluzione cellulare. Questa tecnica può essere scalata per registrare contemporaneamente da più siti utilizzando un approccio multifiber aggregato e può colpire più tipi cellulari utilizzando strategie genetiche in ogni sito registrato. Qui forniamo un protocollo su come costruire e inserire array multifiber personalizzati per mirare alla rete di comportamento sociale del mouse (fino a 12 siti). Questo protocollo dettaglia le procedure chirurgiche necessarie per il targeting efficace di più siti utilizzando le nostre array multifibre personalizzate e l'approccio virale per la somministrazione di indicatori fluorescenti green-shifted e red-shift dell'attività del calcio per l'imaging simultaneo di due popolazioni neurali geneticamente identificate in ciascun sito. Dimostriamo come registrare da queste regioni utilizzando un sistema di telecamere CMOS (CMOS) complementare disponibile in commercio durante il comportamento sociale. Inoltre, questo protocollo dimostra metodi di controllo qualità e dettaglia una pipeline di preprocessing per la correzione del rumore e la standardizzazione. Infine, discutiamo alcune potenziali applicazioni dello strumento per scoprire nuove scoperte sulle reti cerebrali su larga scala.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fotometria a fibra, ovvero la registrazione massiva dei segnali fluorescenti attraverso cavi in fibra ottica, è emersa come una tecnica potente per misurare l'attività delle popolazioni neurali nelle regioni profonde del cervello. Spesso, queste regioni non sono facilmente accessibili con la microscopia o con approcci elettrofisiologicitradizionali 1,2,3. Un obiettivo principale nelle neuroscienze dei sistemi contemporanee è identificare e svelare i calcoli impiegati dalle reti cerebrali su larga scala, specifiche per tipi cellulari, coinvolte nella generazione del comportamento. Le sonde neuropixel e le ferrule multifibre disponibili in commercio eccellono nel registrare da popolazioni neurali linearmente allineate 4,5,6,7, mentre l'imaging corticale a campo ampio fornisce un'eccellente copertura delle dinamiche corticali superficiali 8,9. Tuttavia, registrare simultaneamente da popolazioni neurali subcorticali spazialmente disperse ma funzionalmente connesse è rimasto tecnicamenteimpegnativo 5,10,11,12. Inoltre, sebbene sia possibile colpire più strutture cerebrali profonde utilizzando più ferre a fibra singola per la fotometria, questo approccio è limitato a popolazioni neurali sufficientemente distali tra loro da poter impiantare più ferrule12. Gli array di fotometria multifibra su misura colmano questa lacuna consentendo registrazioni simultanee da molte regioni subcorticali in animali che si comportano liberamente con vincoli minimi, offrendo una finestra unica sulla coordinazione a livello di rete durante comportamenti complessi.

La rete comportamentale sociale (SBN) rappresenta un sistema ideale per indagare la dinamica delle reti cerebrali su larga scala. La SBN è un insieme densamente interconnesso e evolutivamente conservato di strutture sottocorticali coinvolte nella generazione del comportamento sociale, identificato in tutte le classi divertebrati 13, 14, 15. Queste strutture tradizionalmente includono, ma non si limitano a, il setto laterale, l'area preottica, il nucleo del letto della stria terminale, i nuclei ipotalamici anteriori e ventromediali, l'amigdala mediale, il nucleo accumbens e il grigioperiacqueduttale 13,14,15. All'interno della SBN, specifiche popolazioni neurali definite da marcatori molecolari svolgono ruoli fondamentali nella regolazione del comportamento sociale. I neuroni SBN Σ-aminobutiric acid-ergico (GABAergico) (caratterizzati dall'espressione del trasportatore vescicolare GABA, o VGAT) e i neuroni glutamatergici (caratterizzati dall'espressione del trasportatore vescicolare di glutammato, o VGlut) rappresentano i principali tipi di cellule eccitatorie e inibitorie all'interno della rete e probabilmente svolgono ruoli dissociativi nella modulazione dell'azionesociale 16,17,18,19 . Oltre a questi sistemi classici di neurotrasmettitori, la segnalazione degli ormoni sessuali svolge un ruolo fondamentale nella funzione della rete. Ad esempio, molti comportamenti sociali maschili e femminili richiedono l'espressione del recettore alfa degli estrogeni, e l'attività nei neuroni SBN che esprimono questi recettori guida causalmente questicomportamenti 16,20,21,22,23,24,25,26 . Inoltre, le popolazioni neurali SBN sono arricchite con liganti e recettori di molti sistemi neuromodulatori, tra cui dopamina, arginina vasopressina, ossitocina, oppioidi, tachichina, neuropeptide Y, prolattina, oresina, peptide correlato agli agouti, melanocortine, kisspeptina e ormone rilascio digonadotropina 17,18,19,27,28,29,30.31, e i recenti progressi nei sensori codificati geneticamente ora permettono di tracciare molte di queste molecole di segnalazione diverse 32,33,34,35,36,37,38. Poiché le popolazioni neurali SBN sono spazialmente disperse nelle strutture sottocorticali, le preparazioni sperimentali tradizionali (ad esempio, elettrofisiologia extracellulare, imaging corticale superficiale e approcci precedenti alla fotometria multifibra) non riescono a catturare la dinamica dell'attività momento per momento attraverso questa rete cerebrale su larga scala. Tuttavia, monitorando la dinamica del calcio in popolazioni neurali definite geneticamente insieme ai modelli di rilascio dei neuromodulatori, piattaforme di fotometria a fibre multisito su misura possono rivelare quali tipi cellulari specifici e molecole di segnalazione codificano particolari caratteristiche del comportamento sociale, fornendo nuove intuizioni meccanicistiche.

Qui abbiamo sviluppato una piattaforma personalizzabile per la fotometria a fibra multisito e bicolore che consente la registrazione simultanea da fino a 12 regioni cerebrali in topi che si comportano liberamente. Utilizzando questo approccio, abbiamo effettuato registrazioni fotometriche a due colori dell'attività del calcio da 22 popolazioni neurali identificate distribuite in 11 regioni cerebrali SBN, insieme a misurazioni delle fluttuazioni dopaminergiche nel nucleo accumbens con un sensore DA basato su attivazione GPCR (GRAB-DA1m)33 (Tabella 1). Questo protocollo (Figura 1) dettaglia la costruzione di array multifibre personalizzati, procedure chirurgiche per mirare a più siti profondi del cervello, strategie di somministrazione virale per l'espressione di indicatori doppi di calcio (GCaMP39 e RCaMP40), acquisizione dati tramite un sistema di fotometria a fibra basato su telecamera CMOS disponibile commercialmente, metodi di controllo qualità e una pipeline di preprocessing per la correzione del rumore e la standardizzazione del segnale. In modo fondamentale, la nostra pipeline di preprocessing incorpora registrazioni di lunghezza d'onda di controllo isosbest che ci permettono di eseguire correzioni di artefatti di movimento. Adottiamo un approccio basato sulla regressione41 per correggere gli artefatti di movimento, garantendo la fedeltà del segnale durante comportamenti sociali vigorosi come montare o combattere. Poiché il nostro metodo di fotometria multifibra su misura può monitorare simultaneamente l'attività dispersa sia nelle strutture cerebrali profonde prossimali che distali mantenendo la specificità cellulare delle registrazioni tramite il targetinggenetico 42,43, offre vantaggi significativi rispetto ad approcci alternativi per registrare la dinamica dell'attività neurale nelle reti cerebrali su larga scala del cervello profondo.

Questo protocollo è ideale per esperimenti che richiedono registrazioni simultanee da regioni cerebrali subcorticali spazialmente disperse (≥4 siti) in animali che si comportano liberamente, in particolare per l'indagine della dinamica a livello di rete tra tipi cellulari definiti geneticamente o per il monitoraggio del rilascio di neuromodulatori insieme all'attività neurale. L'approccio è particolarmente prezioso per studiare comportamenti naturalistici che coinvolgono movimenti vigorosi (ad esempio, interazioni sociali), dove la nostra pipeline di correzione degli artefatti di movimento garantisce la fedeltà del segnale. Tuttavia, i ricercatori che cercano risoluzione a singola cellula, distinzione tra segnali somatici e assonali, o registrazioni da regioni corticali superficiali potrebbero trovare approcci alternativi (ad esempio, microscopia in miniatura, Neuropixel o imaging widefield) più appropriati. Le considerazioni pratiche chiave includono la complessità chirurgica, la necessità di realizzazione personalizzata di array multifibra e l'istituzione dell'infrastruttura materiali necessaria (capacità di stampa 3D, strumenti in fibra ottica).

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Questo protocollo è stato testato e validato utilizzando topi adulti di età compresa tra 8 e 25 settimane. I topi erano alloggiati a 21–26 °C e umidità dal 30%-70% in un ciclo di luce scura-invertita di 12 ore (OFF: 10:00; IL: 22:00). Gli esperimenti sono avvenuti esclusivamente durante la fase attiva soggettiva (oscura). Cibo e acqua venivano forniti ad libitum. Tutte le procedure animali sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Princeton ed erano conformi agli Standard dei National Institutes of Health.

1. Fabbricazione di matrici multifibre e patchcord (Figura 1A)

  1. Fabbricare un corno patch (Figura 2A).
    1. Ottenere un patchcord a ramificazione a fibra 12 e stampare il connettore fornito e gli accessori stereotatattici per la perforazione (File Supplementare 1, File Supplementare 2, File Supplementare 3) utilizzando resina (resistenza alla trazione: 8,7 kilolibbre/pollice quadrato [ksi], modulo e: 377 ksi, deflessione termica: 138 °F, allungamento: 8%).
    2. Costruisci il disco di lucidatura fornito (File Supplementare 4) con un'asta in acciaio inox di 2 pollici di diametro e includi un ritaglio delle dimensioni della matrice multifibra al centro del disco.
    3. Libera manualmente l'eccesso di resina dai fori passanti del perno a perno nel multifibra con una punta da 1,22 mm x 11 mm. Anche con la stampa 3D di precisione, i fori per i perni del perno sono leggermente troppo piccoli perché il perno possa attraversarlo.
    4. Forare i fori di fibra passante.
      1. Inserire perni a perno in lega d'acciaio (1,19 mm x 12,7 mm) in tutti i fori a 4 perni dell'accessorio stereotassico per perforazione e posizionare il connettore patch con la parte inferiore verso l'alto nell'accessorio stereotassico per foratura, con i perni a perno che passano attraverso i fori passanti del perno multifibra.
      2. Stringi le viti M4 di misura fissare i fori filettati per fissare il connettore del patchcord e fissare l'accessorio stereotassico per perforazione nel telaio stereotattico.
      3. Inserisci una punta da 0,25 mm x 5,5 mm nel trapano stereotassico e monta il trapano sul telaio stereotattico. Utilizzando questa punta, livellare l'imbardata, il beccheggio e il rollio dell'array multifibra con una tolleranza massima di deviazione di ±0,03 mm.
        NOTA: Livellare imbardata e beccheggio nelle posizioni più anteriori e posteriori della stampa 3D, livellare il rullo ai quattro angoli dell'array multifibra.
      4. Centra il foro sopra uno dei fori in fibra stampati in 3D e imposta le coordinate del frame stereotastico X/Y alle coordinate ML (X) e AP (Y) della regione cerebrale associata (Tabella 1). Sposta il trapano alle nuove coordinate (0, 0) sul telaio stereotassico per centrare il trapano sopra il foro passante del perno anteriore.
      5. Utilizzare la punta da 0,25 mm x 5,5 mm per forare ogni foro passante della fibra fino a una profondità di 5,5 mm alle coordinate stereotaticamente definite (Tabella 1).
        NOTA: Usa un lungo pezzo di fibra in eccesso per verificare che tutti i fori siano completamente liberi prima di rimuovere l'array multifibra dal telaio stereotattico. Questo limiterà il numero di volte in cui l'array multifibra dovrà essere livellato e forato per liberare i fori passanti.
    5. Collegare il connettore patch e il patchcord ramificato
      1. Esponi >10 cm delle fibre del cordino. Taglia le fibre con una scava per assicurarti che abbiano la stessa lunghezza. Poi, posiziona un singolo pezzo di tubo termorestringente da 3/16" e uno da 5/16" attorno alle 12 fibre del patchcord.
        NOTA: Il tubo proteggerà eventuali fibre esposte dopo che sono state incollate al connettore.
      2. Inserire ogni fibra in uno dei fori passanti del connettore patch cord in modo che circa 0,3 mm di fibra siano esposti sulla superficie inferiore. Dopo aver inserito tutte le fibre, usa una punta di ago da 21–27 G per applicare la supercolla sulla superficie superiore del connettore patchcord e fissare le fibre in posizione.
      3. Applicare l'epossidica sulla superficie superiore del connettore patch cord a forma piramidale alta 0,5–1 cm. Assicurati che nessuna epossidica copra nessuna area tranne la superficie superiore dove sono state inserite le fibre. Lascia asciugare l'epossidica a temperatura ambiente durante la notte.
      4. Usa una pistola termica al minimo per restringere il tubo termotermorestringente sopra l'epossidica e la fibra esposta sopra di esso (<3–5 cm).
        NOTA: Evita di toccare il tubo termorestringente durante questo processo per evitare ustioni.
      5. Taglia un pezzo di tubo di plastica morbida con un diametro interno di 3 mm alla lunghezza delle restanti fibre esposte, taglia una fessura lungo il bordo del tubo e racchiudi la fibra esposta rimanente nel tubo.
      6. Colora il tubo trasparente con un pennarello nero opaco per assicurarti che le fibre non siano più visibili, minimizzando l'illuminazione delle fibre esposte durante gli esperimenti di imaging.
    6. Lucida il cordino.
      1. Fissa il connettore patch sulla superficie inferiore del disco di lucidatura personalizzato. Lucidare il connettore patch su fogli di lucidatura a 6 μm, 3 μm, 1 μm e poi a grana 0,01 μm con 10–20 movimenti a forma del simbolo/foglio dell'infinito. Per le lastre da 1 μm e 0,01 μm, si applicano 5 gocce di acqua distillata prima della lucidatura.
      2. Pulisci la superficie del connettore per eliminare l'eccesso di acqua distillata. Controlla eventuali imperfezioni o crepe in fibra sul lato lucidato del connettore del patchcord usando un microscopio a campo chiaro e, se esistono, ripeti la lucidatura.
    7. Controlla l'uscita del patchcord.
      1. Collega l'estremità del connettore Sub-miniature versione A (SMA) del patchcord a un sistema di fotometria in fibra basato su fotocamera CMOS. Utilizzando software di codifica visiva, segui il manuale del sistema di fotometria e metti a fuoco la fotocamera CMOS sull'estremità SMA del patchcord.
        NOTA: Il manuale viene aggiornato regolarmente per allinearsi agli aggiornamenti software. Poiché il codice visivo del sistema di fotometria cambia spesso con le nuove versioni software, questo manuale contiene le informazioni più aggiornate sulle versioni software attuali.
      2. Misura l'uscita di un patchcable a 470 nm al 20% di potenza con un misuratore di potenza ottica. Ripeti il passaggio 1.1.7 se l'uscita del patchcord è < 2,5 mW.
  2. Fabbrica un array multifibra.
    1. Stampare l'array multifibra fornito (File Supplementare 5, File Supplementare 6) utilizzando resina con le specifiche tecniche descritte nel passo 1.1.1.
    2. Prepara l'array multifibra.
      1. Inserire dadi esagonali M0.6 in ottone in ciascuno dei quattro scanali negli angoli laterali dell'array multifibra e allineare il foro del dado esagonale al centro dell'apertura.
      2. Applica una singola goccia di supercolla dal lato di ogni slot per il dado esagonale con una punta di ago da 21–27 G, aggiungendo gocce aggiuntive per rinforzo se necessario. Lascia asciugare la colla a temperatura ambiente per 5 minuti prima di passare al passaggio successivo.
      3. Radere via qualsiasi colla dai lati della matrice multifibra usando una lametta per assicurarti che si adatti al disco lucidante.
      4. Se la supercolla in eccesso si è asciugata sul lato superficiale della matrice multifibra, lucidare la superficie della matrice multifibra usando il disco di lucidatura personalizzato e fogli di lucidatura a grana 30 μm finché la colla non viene rimossa e la superficie dell'array multifibra è piatta.
      5. Libera manualmente l'eccesso di resina dai fori passanti del perno nel multifibra con una punta da 1,22 mm.
    3. Forare i fori per la fibra attraverso (Figura 2B-C).
      1. Inserire perni a perno in acciaio legato (1,19 mm x 12,7 mm) in tutti i fori a 4 perni dell'accessorio stereotassico e posizionare la matrice multifibra lato superficiale (lato piatto) nell'accessorio stereotassico per la perforazione, con i perni a perno che passano attraverso i fori passanti del perno multifibra.
      2. Ripeti il passo 1.4.2– passo 1.4.5.
    4. Prepara le fibre per l'array multifibra.
      1. Rimuovere la copertura di plastica da una sezione di fibra ottica da 200 μm, 0,39 NA utilizzando uno scappato. Pulisci la fibra con etanolo.
      2. Taglia le fibre in sezioni lunghe ~3–5 cm usando un colpo di fibra. Ulteriormente taglia queste sezioni a metà usando una schermatura in fibra. Usa un microscopio a campo chiaro per assicurarti che almeno un'estremità delle sezioni tagliate sia priva di scheggiature o imperfezioni. Usa solo fibre con almeno un'estremità senza difetti.
      3. Spegna con il nastro un righello preciso di almeno 15 mm di lunghezza sotto il microscopio a campo chiaro. Posizionare il lato non immacolato della fibra nella posizione 0 mm sul righello (Figura 2D). Tagliare le fibre alla lunghezza desiderata per ciascuna regione target (Tabella 1).
        NOTA: La lunghezza della fibra si calcola aggiungendo 6 mm alla coordinata stereotattica D/V per la fibra più profonda, e poi aggiustando quel valore per tutte le fibre in modo che corrisponda alla differenza tra la loro coordinata D/V e la coordinata D/V della fibra più profonda.
    5. Inserisci le fibre nell'array multifibra.
      1. Posiziona l'array multifibra nel supporto di fabbricazione con la superficie verso il basso. Allinea e fissa il pezzo usando perni a perno.
      2. Abbina la lunghezza della fibra al sito (Tabella 1) e inserisci le fibre tagliate nei fori passanti appropriati nell'array multifibra con il lato non immacolato rivolto verso l'alto. Assicurati che tutte le fibre siano spinte fino in fondo prima del passaggio successivo.
      3. Applica la supercolla con una punta di ago da 21–27 g per incollare tutte le fibre in posizione. Lascia che la colla scorra per almeno 30 minuti a temperatura ambiente prima di continuare.
    6. Lucida l'array multifibra ripetendo il passaggio 1.1.6 con l'array multifibra lato verso il basso (Figura 2E).
    7. Controlla l'efficienza degli array multifibra.
      1. Pulisci la superficie lucidata dell'array multifibra con etanolo e poi applica un gel di abbinamento indice. Inserisci 4 perni a perno nel connettore del patchcord e fissa la matrice multifibra usando viti di trasmissione G5 e il cacciavite associato (Figura 2F).
      2. Usa un misuratore di potenza per misurare l'emissione LED di 470 nm e 560 nm dall'array multifibra. Calcolo l'efficienza usando questi valori:
        figure-protocol-1
      3. Se l'efficienza è <75%, ripeti i passaggi 1.2.7.1–1.2.7.2.
        NOTA: Se la rilucidatura non migliora l'efficienza e non ci sono imperfezioni sulle fibre, è possibile che le fibre sull'array multifibra siano disallineate rispetto al connettore patchcord.
    8. Preparare un array multifibra per l'uso (Figura 2G).
      1. Inserire 4 perni a perno nei fori passanti dell'array multifibra. Assicurati che i perni del perno non sporgano più di 1 mm dal lato cervello della matrice multifibra.
      2. Metti la supercolla lato cervello sui perni del perno. Lascia asciugare la colla per almeno 10 minuti a temperatura ambiente prima di usare la matrice multifibra.

2. Chirurgia (Figura 1B)

  1. Prepara spazio chirurgico e strumenti.
    1. Pulisci il telaio stereotassico per garantire un'area di lavoro asettica.
    2. Ottieni sutura sterile e assorbibile.
    3. Autoclave un paio di pinze fine, forbici fini e due pinze bulldog.
    4. Assicurati che il vaporizzatore sia pieno di isoflurano. Assicurati che il tubo per le linee di isofluranza, vuoto e ossigeno sia ben collegato al vaporizzatore, alla camera di induzione e al cono nasale della struttura stereotattica.
  2. Ottenere i virus adeno-associati jRCaMP1b, GCaMP6f e GRAB-DA1m.
    ATTENZIONE: Indossa sempre l'equipaggiamento di protezione individuale durante la gestione dei virus.
    1. Diluire i virus a una concentrazione operativa compresa tra1x10, 13 e 4x10,13 parti/millilitro se necessario.
    2. Prepara una miscela 1:1 di virus adenoassociati jRCaMP1b e GCaMP6f.
    3. Mettere un'aliquota della miscela virale 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f e un'aliquota del virus GRAB-DA1m sul ghiaccio per mantenere la temperatura a 4 °C.
  3. Induzca l'anestesia.
    1. Inserisci il mouse nella camera a induzione e chiudi la porta della camera. Inizia il flusso di ossigeno nel vaporizzatore a 1 L/min.
    2. Dirige il flusso di gas nella camera di induzione e attiva la linea di vuoto per rimuovere il gas in eccesso dalla camera. Imposta il vaporizzatore a una concentrazione di isoflurano compresa tra il 3% e il 5%.
  4. Trasferisci il mouse al fotogramma stereotattico.
    1. Quando il respiro del mouse si è rallentato a 1 respiro/s, sposta il mouse sul frame stereotattico. Aggancia gli incisivi anteriori del topo nella fessura del bocchino del cono del naso e stringi il cono sopra il naso del topo.
    2. Spostare il flusso di gas sul sistema stereotattico con la concentrazione di isoflurano impostata all'1%–2% per mantenere l'anestesia. Cambia la linea di vuoto per rimuovere il gas dal cono anteriore.
      NOTA: Monitorare la respirazione del topo durante l'intervento e regolare la concentrazione di isoflurano secondo necessità per mantenere un'anestesia profonda con una frequenza respiratoria di 1 respiro/s. L'anestesia profonda dovrebbe essere confermata periodicamente durante l'intervento, assicurandosi che il topo non risponda a una pizzicatura del dito dei piedi.
    3. Imposta il sistema di riscaldamento per mantenere una temperatura corporea di 35 °C e applica unguente ottico sugli occhi del topo per evitare che si secchino.
    4. Inserire barre auricolari stereotassici in modo che premano su entrambi i lati del cranio, leggermente dorsali e anteriori rispetto ai canali uditivi. Stringi le cuffie e assicurati che il cranio del topo sia fissato applicando una pressione delicata sulla sommità della testa.
  5. Prepara il cuoio capelluto per l'incisione.
    1. Taglia o rasa i peli sulla sommità della testa del topo finché non sono corti. Applica il gel depilatore sulla sommità della testa del topo e lascia agire per circa un minuto. Rimuovi il gel residuo con un cotton fioc pulito.
    2. Ripeti 2.5.1 secondo necessità finché tutti i peli sulla sommità della testa non sono stati rimossi.
    3. Disinfettare la pelle sulla parte superiore della testa usando cotton fibbs per applicare betadine (soluzione 10% di povidone-iodio) seguita da una soluzione al 70% di etanolo.
  6. Espone il teschio.
    1. Incidere lungo la linea mediana del cranio, che si estende da leggermente posteriore della lambda a leggermente anteriore della vena renale rostrale.
      NOTA: La vena renale rhostrale è il vaso sanguigno che si trova sulla superficie dorsale del cervello tra il bulbo olfattivo e la corteccia prefrontale.
    2. Taglia e rimuovi la pelle rasata ai lati di questa incisione per formare un taglio a forma di lacrima che espone le ossa parietali, la punta anteriore dell'osso intraparietale e la porzione delle ossa nasali anteriore alla vena renale rostrale (Figura 2H).
    3. Pulisci delicatamente la superficie del cranio con soluzione salina allo 0,9% e un cotton fioc pulito.
  7. Rasa il teschio.
    1. Individua dove la vena renale rostrale incontra la sutura sagittale. Segna questo punto con una lama sterile del bisturi.
    2. Inserisci una punta in carburo #92 nel trapano stereotattico e monta il trapano sul telaio stereotattico. Usa il manipolatore stereotattico per posizionare la punta del trapano sulla superficie del cranio nel punto segnato e azzerare le coordinate X, Y e Z del trapano.
    3. Pianeggia l'inclinazione del cranio misurando la profondità Z nel punto segnato e -8,25 mm posteriore ad esso. Livellato lo imbardata del cranio misurando la distanza laterale tra il punto segnato e la posizione -8,25 posteriori. Rollio livellato misurando la profondità Z nelle posizioni ±2,0–2,5 mm dalla linea centrale nelle posizioni -2,0, -4,5 e -7,0 mm rispetto al punto segnato.
  8. Esegui craniotomie e duratomie.
    1. Sostituisci la punta con una punta in carburo #76 o #78. Azzerare il trapano nella posizione segnata alla giunzione della sutura sagittale, della vena renale rostrale e della superficie cranica.
    2. Sposta il trapano alle coordinate A/P e M/L di ciascuna regione cerebrale (Tabella 1). In ogni sito, pratica una craniotomia e rimuovi con cura la dura mater ad ogni craniotomia usando una punta vuota di siringa da 27G o meno.
  9. Iniettate il virus.
    1. Tira micropipete di vetro in modo che la punta si affidoli per almeno 7 mm e abbia un'apertura della punta di 10–30 μm.
      NOTA: Riavviare i passaggi 2.9.2–2.9.12 se la micropipetta contiene bolle d'aria dopo uno qualsiasi dei passaggi successivi.
    2. Riempi una punta vuota di vetro con olio minerale. Inserisci e fissa la punta della micropipetta nell'iniettore a nanolitri. Usa l'interfaccia iniettore nanolitri per espellere quanta più oleo minerale possibile dalla micropipetta.
    3. Monta l'iniettore nanolitrico sul telaio stereotattico. Taglia un piccolo pezzo di foglio di cera di paraffina e posizionalo sulla testa del topo.
    4. Pipetta 1 μL della miscela del virus jRCaMP1b:GCaMP6f sulla cera di paraffina. Abbassare la punta dell'iniettore di nanolitri in modo che la punta della micropipetta di vetro sia nella miscela virale e riempire la micropipetta con il virus usando l'interfaccia dell'iniettore.
    5. Ripeti 2.9.4 finché tutti i virus utilizzati non saranno stati trasferiti all'iniettore a nanolitri (Tabella 1). Rimuovere e smaltire la cera di paraffina in un contenitore per rifiuti biologici.
    6. Zera la punta della micropipetta dell'iniettore nella posizione segnata alla giunzione della sutura sagittale, della vena renale rostrale e della superficie del cranio.
    7. Partendo dal sito di iniezione più ventrale a più dorsale (Tabella 1), sposta la punta della micropipetta su ciascun sito, abbassa fino a toccare la superficie cerebrale e azzera la posizione Z sul telaio stereotattico.
    8. In ogni sito, abbassare la punta della micropipetta nel cervello fino a raggiungere 0,1 mm ventrali rispetto al sito di iniezione. Poi, sollevare la punta della micropipetta di 0,1 mm fino al sito di iniezione finale. Lascia che il tessuto circostante si depositi intorno alla punta della micropipetta per 30 secondi.
    9. Utilizzando l'interfaccia iniettore a nanolitri, iniettare 300 nL della miscela virale 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f a una velocità di 1–2 nL/s per disperdere la miscela nel sito di iniezione attuale.
    10. Lascia che la punta della micropipetta rimanga nel sito di iniezione per almeno 5 minuti dopo il completamento dell'iniezione. Solleva lentamente la punta della micropipetta fuori dal cervello per ridurre il rischio di diffusione dorsale del virus lungo il percorso dell'iniezione.
    11. Dopo aver iniettato la miscela virale 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f in ogni sito, si utilizza l'interfaccia di iniezione di nanolitri per riportare lo sturalavandini dell'iniettore di nanolitri nella sua posizione originale. Rimuovi la micropipetta e gettala in un contenitore per rifiuti per biohazards sharps.
    12. Se necessario, ripetere i passaggi 2.9.2–2.9.11 per ogni regione cerebrale destinata all'espressione di GRAB-DA1m. In ogni sito bersaglio, iniettare 150 nL invece dei 300 nL usati per la miscela virale.
  10. Impianta un array multifibra.
    1. Fissare l'array multifibra al telaio stereotattico usando qualsiasi attacco che possa tenere l'array multifibra tramite i perni del perno, per mantenerlo stabile durante l'impianto (Figura 2I).
    2. Regola la posizione dell'array multifibra in modo che ogni fibra si allinei con il centro della rispettiva craniotomia e con la fibra più lunga che riposi sulla superficie cerebrale. Azza il manipolatore stereotattico in questa posizione e abbassa lentamente l'array multifibra fino a che sia 0,25 mm sopra la posizione D/V dell'iniezione virale più profonda (Tabella 1, Figura 2J).
    3. Metti una teglia fredda per imballare sul ghiaccio e aggiungisci 1 cucchiaio di polvere di cemento, 4 gocce di base liquida e 1 goccia di catalizzatore. Mescola per 20 secondi.
      NOTA: Ripeti questo passaggio ogni volta che viene utilizzato cemento liquido e ne è necessario di più.
    4. Usa una siringa e un ago da 23–31 g per trasferire cemento liquido nello spazio tra la matrice multifibra e il cranio.
    5. Applicare cemento liquido usando un applicatore sottile di plastica o un ago per siringa per coprire completamente i quattro lati della matrice multifibra, formando una forma piramidale dal cranio (Figura 2K). Lascia asciugare il cemento per almeno 15 minuti.
    6. Sutura la pelle insieme lungo l'incisione per assicurare che il cranio non venga esposto.
  11. Permette al mouse di riprendersi.
    1. Riduci la concentrazione di isoflurano a 0.
    2. Trasferisci il mouse dal frame stereotassico a una base riscaldante e aspetta che il mouse sia all'erta e deambulante prima di riportarlo nella sua gabbia.
    3. Lascia che il topo si riprenda per almeno due settimane prima di iniziare gli esperimenti.

3. Imaging multisito e bicolore del calcio (Figura 1C)

  1. Configura il Data Acquisition Device (DAQ).
    1. Collega il GND alla porta AGND sopra la porta Ch7 usando filo elettrico.
    2. Collega il DIO0 alla porta Ch0 usando un filo elettrico.
  2. Collega il sistema di fotometria al DAQ.
    1. Collega l'estremità del connettore Baby Neill Constant (BNC) di un cavo BNC diviso (connettore BNC a un'estremità, fili elettrici rossi e neri all'altra) alla porta di ingresso del sistema di fotometria. Collega l'estremità del connettore BNC di un altro cavo BNC diviso alla porta di uscita del sistema di fotometria.
    2. Prendi il cavo BNC diviso collegato alla porta di ingresso del sistema di fotometria e collega la sua estremità del filo rosso alla porta DIO1 del DAQ. Prendi il cavo BNC diviso collegato alla porta di uscita del sistema di fotometria e collega la sua estremità del filo rosso alla porta Ch1 del DAQ.
    3. Collega i fili di massa neri di entrambi i cavi BNC divisi alla porta DAQ GND.
  3. Sincronizza le fotocamere di comportamento e fotometria.
    1. Collega in catena più telecamere comportamentali per registrare simultaneamente il comportamento da più angolazioni.
      1. Collega l'uscita opto-isolata (pin 4, filo bianco) della camera di comportamento primaria all'ingresso non isolato della telecamera secondaria (pin 1, filo verde) con una resistenza da 3,3 KΩ. Collega l'uscita da 3,3 V della telecamera principale (pin 3, filo rosso) allo stesso resistore da 3,3 KΩ e al Ch2 del DAQ.
      2. Collega l'uscita opto-isolata di ciascuna telecamera secondaria alla sua uscita da 3,3 V utilizzando una resistenza da 3,3 KΩ.
      3. Collega la massa della telecamera principale (pin 6, filo marrone) alla massa di ciascuna seconda telecamera. Collega tutti i fili di massa della fotocamera alla porta DAQ AGND sopra la porta Ch2 e alla massa di uscita del sistema di fotometria.
  4. Configura le impostazioni della fotocamera comportamentale utilizzando il software di imaging associato.
    1. Imposta il "Frame Rate di acquisizione" a 45 Hz e il guadagno a 1.
    2. Imposta il tempo di esposizione a 2998 μs, il limite inferiore a 100 μs e il limite superiore a 150000 μs.
      NOTA: "Acquisition Frame Rate" potrebbe non essere il frame rate effettivo che verrà catturato. A seconda del tempo di esposizione e della larghezza di banda dati richiesta, questo valore potrebbe dover essere impostato più alto della frequenza finale di immagini. Se necessario, regolare "Acquisition Frame Rate" in modo che il "Frame Rate risultante" visualizzato sia di 40 Hz.
  5. Configura il software DAQ (Supplemental File 7).
    1. Nel software DAQ, aggiungi il DAQ come 'Disvolo' e passa al 'Pannello di Configurazione'.
    2. Nella scheda 'Canali', sotto 'Ingresso Analogico', attiva i canali 0–2. Sotto 'Digitale', attiva il canale 0.
      NOTA: Ch0 corrisponde al segnale logica transitore-transitore (TTL), Ch1 al sistema di fotometria e Ch2 alle fotocamere a catena.
    3. Sotto 'Analog Input', si nomina il canale 0 "TTL", il canale 1 "Photometry_system" e il canale 2 "Behavior_cameras" che sta per "Transitor-Transistor Logic". Sotto 'Digitale', nome canale 0 "TTL_trigger".
    4. Nella scheda 'Triggers', imposta i trigger su manuale. Nella scheda 'Frecchi di campionamento', imposta la frequenza di campionamento a 350 Hz.
    5. Passa al 'Display Panel' e inserisci le finestre 'Strip', 'Scalar' e 'Output' nell'interfaccia grafica.
  6. Configura il software di sistema di fotometria (Supplemental File 8).
    1. Sviluppare un flusso di lavoro nel software di codifica visiva per accettare un impulso TTL da 5 V per attivare le registrazioni e salvare il timestamp per ogni fotogramma, le emissioni di fluorescenza per i canali rosso e verde per ogni fibra e il video grezzo, come indicato nel manuale del sistema di fotometria.
    2. Utilizzando il nodo per il sistema di fotometria nel flusso di lavoro, assicurati che il sistema sia configurato per registrare fotogrammi alternati di LED da 560, 470 e 415 nm a 120 Hz per un framerate funzionale di 40 Hz.
      NOTA: Questo approccio di multiplexing a divisione temporale (TDM) affronta la sovrapposizione spettrale tra GCaMP e RCaMP separando temporalmente la loro eccitazione, assicurando che ogni indicatore venga eccitato indipendentemente attraverso frame consecutivi. Il sistema di registrazione utilizzato qui utilizza filtri di emissione passa-banda ottimizzati (canale verde: 500–530 nm; canale rosso: >580 nm passa-lungo) che minimizzano ulteriormente la diafonia spettrale limitando i fotoni rilevati alle lunghezze d'onda prevalentemente emesse da ciascun indicatore. La lunghezza d'onda isosbest di 415 nm eccita sia GCaMP che RCaMP allo stesso modo, ma produce minime variazioni di fluorescenza dipendenti dal calcio, fornendo un segnale di controllo degli artefatti di movimento. Insieme, l'eccitazione TDM e il filtraggio spettrale garantiscono che i frame a 470 nm catturino prevalentemente l'attività GCaMP (Figura 3A), i frame a 560 nm catturino prevalentemente l'attività RCaMP (Figura 3B) e i frame a 415 nm forniscano segnali di riferimento indipendenti dal calcio per la correzione del movimento.
  7. Esegui registrazioni fotometriche in vivo .
    1. Procura un topo che ha subito iniezioni virali e impianto di array multifibre come descritto nel Passo 2.
    2. Pulisci le superfici di collegamento del patchcord e della rete multifibra impiantata con etanolo e un cotton fiob. Utilizzando il nodo per il sistema di fotometria nel flusso di lavoro di codifica visiva e un fotometro, si imposta ciascuno dei livelli di potenza LED 415, 470 e 560 per fornire circa 1,2 mW di illuminazione dal patchcord.
    3. Applica il gel di abbinamento indice sulla superficie di collegamento del patchcord. Allinea il cordone patch all'array multifiber impiantato del mouse con i perni del set e fai scorrere il patchcord fino a farlo scorrere a filo con la superficie dell'array multifiber impiantato.
    4. Stringi le viti del corno patch per fissare la matrice multifibra nel patchcord. Lascia che il topo si abitui prima di iniziare gli esperimenti (Figura 2L–M).
    5. Imposta i nomi dei file.
      1. Per ogni behavior camera, premi il pulsante cerchio rosso 'registra' per aprire la finestra di registrazione nel software di registrazione della behavior camera e specificare il nome file.
      2. Apri il programma software DAQ, clicca sul pulsante ingranaggio e naviga su 'opzioni di loging', specificando il nome file.
      3. Clicca sul nodo 'PhotometryWriter' del flusso di lavoro di codifica visiva del sistema di fotometria per specificare il nome del file.
    6. Nelle finestre di registrazione del software della fotocamera comportamentale, clicca su 'inizia la registrazione' per ogni fotocamera. Successivamente, premi il pulsante play nel flusso di lavoro di codifica visiva del sistema di fotometria e premi record nel software DAQ.
    7. Clicca sull'interruttore TTL per iniziare a registrare in sincronia su tutte le telecamere.
    8. Fine registrazione.
      1. Clicca sull'interruttore TTL per terminare le registrazioni sincrone della telecamera
      2. Premi il pulsante stop nel flusso di lavoro di codifica visiva per il sistema di fotometria, "ferma la registrazione" nel software della fotocamera comportamentale per le finestre.
    9. Ripeti i passaggi 3.7.5–3.7.8 fino alla fine degli esperimenti e disconnetti il mouse.
      NOTA: Dopo gli esperimenti, i flussi di dati della fotometria e della fotocamera comportamentale possono essere allineati con codice personalizzato utilizzando l'output del software DAQ. In particolare, (1) la variazione della tensione TTL indica il tempo di inizio e offset TTL, (2) i cambiamenti nella tensione comportamentale indicano quando si apre e si chiude l'otturatore della fotocamera per catturare ogni fotogramma del video, e (3) la variazione iniziale della tensione del sistema fotometrico registrata sul DAQ può essere confrontata con il tempo di inizio TTL e i timestamp della fotometria della fotometria dal software di codifica visiva per determinare i timestamp della fotometria della fotometria.

4. Elaborazione dati (Figura 1D, Fascicolo Supplementare 9)

  1. Pre-elaborazione dei dati di imaging del calcio.
    1. De-intercalare i fotogrammi dei dati di imaging calcio per creare flussi separati di segnale registrati in risposta a LED da 415 nm, 470 nm e 560 nm.
    2. Usa l'algoritmo Adaptive Iteratively Reweighted Penalized Least Squares (airPLS)44 per correggere la deriva di base.
    3. Calcolare ΔF/F utilizzando:
      figure-protocol-2
      NOTA: Il periodo di base dovrebbe essere un'epoca stabile prima della manipolazione sperimentale (ad esempio, prima di introdurre un partner sociale). Se il periodo di riferimento è troppo breve (<2–3 minuti) o presenta grandi fluttuazioni che possono essere contaminate da artefatti di movimento, si considera la normalizzazione usando la fluorescenza media per tutta la sessione invece di un periodo di base limitato.
  2. Corretti per gli artefatti di movimento (Figura 4A).
    1. Utilizzare un approccio basato sulla regressione, anche se metodi alternativi sono adatti (vedi Tabella 2)
    2. Segnali Z-score ΔF/F che utilizzano la mediana per normalizzare la magnitudine del segnale tra le regioni:
      figure-protocol-3
    3. Applica la regressione Lasso con regolarizzazione L1. Il Lasso (Minor Absolute Shrinkage and Selection Operator) esegue la selezione automatica delle caratteristiche riducendo i coefficienti dei predittori non informativi verso zero.
      1. Eseguire la ricerca a griglia tra parametri di regolarizzazione (α = 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100). La ricerca a griglia identifica l'equilibrio ottimale tra complessità del modello e sovrafitting. Questo passaggio può essere completamente automatizzato utilizzando routine di validazione incrociata disponibili nelle librerie standard di machine learning (ad esempio, scikit-learn in Python).
      2. Per la fotometria a doppio colore (il nostro approccio raccomandato), utilizzare tutti i canali di controllo isosbest a 415 nm disponibili nelle 12 regioni di registrazione come predittori (vedi Figura 4B–C e Risultati per la motivazione). Per la fotometria a colore singolo (solo GCaMP o solo RCaMP), limitare la matrice predittiva solo al segnale isosbest della stessa fibra del segnale di calcio da correggere.
      3. Seleziona il modello che minimizza l'errore quadratico medio tra segnale previsto e osservato.
    4. Si sottrae la componente di moto prevista dal segnale per ottenere l'attività corretta.
  3. Smussare il segnale usando un filtro Savitzky-Golay con una finestra di 725 ms.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per registrare simultaneamente da un massimo di 12 regioni cerebrali SBN, abbiamo costruito un array multifibra personalizzabile seguendo il protocollo sopra descritto. Dopo il recupero dall'intervento, i topi sono stati registrati durante l'interazione sociale (Figura 5). Per tutti gli esperimenti, ai maschi di soggetto CD1 è stato permesso di interagire con maschi Balb/c nella loro gabbia domestica. Abbiamo utilizzato topi Vgat-Cre per esprimere jRCaMP1b40 nei neuroni GABAergici in modo dipendente da Cre in 11 regioni cerebrali SBN, GCaMP6f39 in cellule non GABAergiche in modoesclusivo Cre 45 nelle stesse regioni cerebrali, e GRAB-DA1m33 nel Nucleus accumbens42 (Tabella 1). La conferma istologica del targeting delle fibre si trova nelle nostre pubblicazioniprecedenti 42,43. Qui, abbiamo cercato di testare le prestazioni di diversi metodi per la correzione degli artefatti di movimento. In particolare, abbiamo confrontato l'efficacia dell'uso: (1) di un filtro mediano da solo; (2) Regressione del lazo con regolarizzazione L1 usando solo segnali isosbestici della stessa fibra (approccio a singolo predittore)11 e (3) Regressione del lazo usando segnali isosbestici di tutte le fibre come predittori (approccio multi-predittore)41,42 (Figura 4A). In modo fondamentale, i metodi basati su Lasso correggono il segnale grezzo usando il segnale fluorescente indipendente dall'attività generato in risposta al LED a frequenza isosbest (415 nm), mentre il levigamento del filtro mediano non considera il segnale indipendente dall'attività.

Abbiamo valutato la correzione del movimento utilizzando due diverse misure: rumore ad alta frequenza assoluta e jitter. Il rumore ad alta frequenza è stato definito come la deviazione standard della prima derivata del segnale, che riflette l'entità delle fluttuazioni rapide del segnale. Il jitter è stato definito come il coefficiente di variazione della derivata del segnale, che riflette la grandezza della variabilità del segnale da frame a frame rispetto alla media della derivata del segnale. Abbiamo riscontrato che entrambi gli approcci basati su Lazo (singolo predittore e multi-predittore) hanno notevolmente superato il filtro mediano in termini di riduzione sia del rumore ad alta frequenza che del jitter, con la correzione multi-predittore che ha superato leggermente la correzione a singolo predittore (Figura 4C–D; Rumore ad alta frequenza, n=414 per 23 segnali in 18 sessioni di registrazione: test di Kruskal-Wallis, H = 501,9420, p < 0,001; Test post-hoc Mann-Whitney U con correzione di Bonferroni: Regressione smussata vs a sito singolo ***p < 0,001, regressione smussata vs multisito ***p < 0,001, A sito singolo vs multisito **p = 0,0073; Jitter: test di Kruskal-Wallis, H = 495,6685, p < 0,001; Test post-hoc di Mann-Whitney U con correzione di Bonferroni: Regressione smussata vs a sito singolo ***p < 0,001, Regressione smussata vs multisito ***p < 0,001, A sito singolo vs multisito ***p = 0,0006). In particolare, l'approccio multi-predittore (utilizzando tutte le isosbest in fibra) ha mostrato benefici per i segnali a canale rosso (RCaMP): 5 segnali rossi su 12 hanno mostrato un rumore residuo significativamente inferiore rispetto alla correzione con un singolo predittore (n = 18 registrazioni/regione). Per il jitter, BNST (test t, t = 5,42, ***p < 0,001), POA (test t, t = 2,68, *p = 0,011), AH (test t, t = 2,66, *p = 0,012) e PAG (test U di Mann-Whitney, U = 279, ***p < 0,001) hanno mostrato superiorità multi-predittori. Per il rumore ad alta frequenza, il BNST (test U di Mann-Whitney, U = 285, ***p < 0,001), POA (test U di Mann-Whitney, U = 292, ***p < 0,001), AH (test t, t = 7,10, ***p < 0,001), PAG (test t, t = 13,72, ***p < 0,001) e LHb (test t, t = 5,47, ***p < 0,001) hanno mostrato superiorità multi-predittori. I segnali del canale verde (GCaMP) non hanno mostrato differenze significative tra i due approcci Lasso in tutte e 12 le regioni, sia per le metriche di jitter che per il rumore ad alta frequenza (tutte p>0,05, per l'elenco completo dei test statistici vedi Tabella 3). Questo suggerisce che per la fotometria a doppio colore, incorporare informazioni isosbest trasversali migliora la correzione del movimento per i segnali rossi, probabilmente perché le isosbest a canale verde forniscono informazioni di movimento più pulite. Questi dati dimostrano che la correzione degli artefatti di movimento utilizzando metodi di regressione basati su isosbest supera sostanzialmente gli approcci di filtraggio semplici, con la regressione multicanale che offre vantaggi specifici per le registrazioni a doppio colore.

figure-results-1
Figura 1. Registrazione dalla Social Behavior Network utilizzando fotometria a fibra multisito e bicolore. (A) Rappresentazione schematica di come costruire un array multifibra. (B) Rappresentazione schematica del flusso di lavoro chirurgico. (C) Rappresentazione schematica di esperimenti di imaging del calcio a due colori. (D) Esempio di utilizzo di un segnale isosbest per calcolare un segnale corretto di movimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. Immagini delle procedure chiave per la fabbricazione e la chirurgia. (A) Patch cord fabbricato pronto per la registrazione. (B) Array multifibra inserito in un supporto stereotattico personalizzato con la punta da 0,25 mm x 5,5 mm posizionata sopra un foro passante per fibra. (C) Array multifibra con tutti i fori passanti della fibra liberati e i dadi esagonali incollati. (D) Tagliare una fibra usando una scrittura a fibra. (E) Array multifibra con tutte le fibre incollate con supercolla e posizionate su un disco di lucidatura personalizzato. (F) Vista ingrandita di come allineare e avvitare il connettore patch al multifiber. (G) Array multifibra completamente costruito con perni a perno incollati in posizione. (H) Topo fissato al telaio stereotassico con incisione al cuoio capelluto per esporre il cranio. (I) Array multifibra fabbricato collegato a un manipolatore stereotattico per manovrare l'array multifibra durante l'intervento. (J) Vista ingrandita dell'array multifibra che viene abbassata nel cervello. (K) Array multifibra completamente abbassata e fissata al cranio con cemento dentale. (L) Matrice multifibra su un animale che è collegata saldamente al cavo patch prima della registrazione. (M) Vista allontanata dell'animale in gabbia con un patch collegato prima e/o durante la registrazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. Separazione spettrale. Esempi di tracce che dimostrano una minima interferenza spettrale tra indicatori di calcio. I segnali GCaMP6f (blu) mostrano un'attivazione robusta durante l'eccitazione a 470 nm ma una risposta trascurabile all'eccitazione a 560 nm. I segnali jRCaMP1b (rossi) mostrano il pattern inverso con forte attivazione da 560 nm ma risposta minima a un'illuminazione a 470 nm. (A) Registrato simultaneamente i segnali GCaMP6f e jRCaMP1b con illuminazione solo a 470 nm. (B) Uguale a (a), ma con illuminazione solo a 560 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4. Confronto tra diversi metodi per l'elaborazione del segnale multifibra. (A) Schema che raffigura la correzione basata su regressione multi-sito del segnale di fotometria. Questo approccio prevede passaggi di elaborazione sequenziali in cui tutti i segnali isosbestici disponibili a 415nm vengono mappati linearmente a ciascun segnale dipendente dal calcio. Le componenti del moto previsto vengono sottratte da questo segnale per produrre la lettura finale dell'attività. segnali ΔF/F con punteggio z provenienti da due segnali con forte presenza di artefatti di movimento. (B) Dall'alto verso il basso: segnale isosbest dallo stesso canale fibra/imaging che rappresenta artefatti di movimento, segnale RCaMP solo smussato, o GCaMP (destra) (filtrato mediano, verde), stesso segnale corretto/regressione a fibra/canale di imaging (ciano), segnale corretto a regressione multifibra (blu). (C) Sinistra: punteggio medio di rumore ad alta frequenza per ogni segnale registrato (n = 21 sessioni). Il rumore ad alta frequenza viene calcolato come deviazione standard della prima derivata di ciascun segnale. I punteggi di rumore sono mostrati per 1) segnale corretto alla base ma non corretto (grigio), 2) segnale corretto alla linea di base e filtrato alla mediana (rosa), 3) segnale corretto per regressione di base e a fibra singola con levigatura Savitsky-Golay (ciano), e 4) segnale corretto per regressione a base e multifibra con levigatura Savitsky-Golay (blu). Centro: percentuale media di rumore rimossa usando solo smoothing, regressione single-fiber o multi-fibra, aggregata su tutti e 23 i segnali. La percentuale di rumore rimosso viene calcolata come la frazione di rumore ad alta frequenza risultante dalla correzione rispetto al livello complessivo di rumore nel segnale grezzo corretto di base. I dati sono riportati come media ± SEM (test di Kruskal-Wallis, H = 501,9420, p < 0,001; test post-hoc di Mann-Whitney U con correzione di Bonferroni: Regressione smussata vs a sito singolo ***p < 0,001, regressione smussata vs multisito ***p < 0,001, Regressione a sito singolo vs multisito **p = 0,0073). Destra: Percentuale di segnali in cui il rumore ad alta frequenza è statisticamente diverso dopo una correzione basata su regressione a fibra singola rispetto a multi-fibra, separata per tipo di segnale. Per ciascuno dei 23 segnali, i livelli di rumore dopo la correzione a sito singolo sono stati confrontati con quelli dopo la correzione multi-sito utilizzando test t indipendenti (se normalmente distribuiti) o test Mann-Whitney U (alternativa non parametrica). I segmenti blu indicano segnali in cui la correzione multi-sito ha prodotto rumore significativamente inferiore rispetto alla correzione a sito singolo (p < 0,05). I segmenti grigi indicano segnali senza differenze significative tra i metodi di correzione. I segmenti cian indicano segnali in cui la correzione a sito singolo ha prodotto un rumore significativamente inferiore. E: Vgat- GCaMP6f. DA: AFFA-DA. I: Vgat+ jRCaMP1b. (D) Uguale a (C) ma rappresenta la variabilità frame a frame (jitter), calcolata come derivata del coefficiente di variazione di ciascun segnale (test di Kruskal-Wallis, H = 495.6685, p < 0.001; test post-hoc Mann-Whitney U con correzione di Bonferroni: Regressione smussata vs a sito singolo ***p < 0.001, regressione smussata vs multisito ***p < 0.001, Regressione a sito singolo vs multisito ***p = 0.0006). Per l'elenco completo dei test statistici e dei risultati si veda la Tabella 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5. Esposizione multi-sito di fotometria a fibra bicolore. Segnali rappresentativi da più tipi di indicatori registrati simultaneamente durante il comportamento sociale (test del residente-intruso, epoca di ingresso dell'intruso). Le tracce mostrano GCaMP6f (neuroni Cre-negativi), jRCaMP1b (neuroni Vgat-Cre+ GABAergici e sottratti alla base, non normalizzati e sottratti dalla linea di base) ma non corretti da artefatti di movimento, tra i siti della rete comportamentale sociale nello stesso animale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Coordinate del virus e lunghezze delle fibre per ogni regione cerebrale della rete comportamentale sociale target. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2. Confronto dei metodi di correzione degli artefatti di movimento per la fotometria a fibre multi-sito. Principi di base, casi d'uso ottimali, vantaggi e limitazioni dei seguenti metodi di correzione degli artefatti del movimento: regressione lineare semplice, regressione Lasso con regolarizzazione L1 (usando approccio multi-predittore), modellazione generativa bayesiana, scalatura basata sulla frequenza e minimi quadrati riponderati iterativamente. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3. Dettagli e risultati dei test statistici utilizzati nella Figura 4. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Fascicolo Supplementare 1. File di stampa 3D per il connettore patchcord.Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2. 3D file di stampa per connettore patch senza fori passanti.Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3. 3D file di stampa per accessori di perforazione stereotatsica.Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo Supplementare 4. Progetto personalizzato del disco per lucidatura.Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 5. 3D file di stampa per array di fotometria multisito che mira a 12 siti SBN.Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 6. 3D file di stampa per array di fotometria multisito senza fori passanti che puntano i siti.Clicca qui per scaricare questo file.

File Supplementare 7. File di configurazione DAQ per il software DAQ.Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo Supplementare 8. File di codifica visiva per il sistema di fotometria.Clicca qui per scaricare questo file.

File Supplementare 9. Il codice Python utilizzato nel Protocollo Step 4 e per i confronti corretti con artefatti di movimento. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fotometria delle fibre è una tecnica utile ed economica per registrare l'attività di calcio delle popolazioni provenienti da regioni cerebrali profonde o da specifici tipi cellulari nell'animale in movimentolibero 3. La registrazione simultanea da più regioni cerebrali permette all'utente di confrontare le dinamiche tra regioni o proiezioni durante il comportamento naturalistico o le preparazioni con la testafissa 5,7,12. Qui, dettagliamo metodi per registrare in due colori fino a 12 regioni cerebrali attraverso la "rete comportamentale sociale" subcorticale del cervello, utilizzando un array di fibre su misura e un sistema di telecamere commercialmente disponibile. Di seguito, discutiamo i passaggi fondamentali nell'implementazione di questo metodo, le potenziali modifiche e le strategie di risoluzione dei problemi, nonché il suo significato e le sue limitazioni rispetto agli approcci esistenti.

Il protocollo prevede tre fasi principali. Innanzitutto, la fabbricazione di array multifibre e patchcord richiede che parti personalizzate stampate in 3D vengano forate a coordinate stereotattiche, seguite da inserimento, lucidatura e controllo qualità della fibra per garantire un'efficienza di trasmissione della luce del ≥75%. Un allineamento preciso della foratura (tolleranza di ±0,03 mm) e una lucidatura accurata sono fondamentali. I guasti comuni includono bassa efficienza di trasmissione della luce (<75%) e fori passanti in fibra ostruiti. La bassa efficienza deriva tipicamente da imperfezioni nelle fibre durante la tagliatura o da una lucidatura impropria. Le soluzioni includono la verifica che ogni estremità della fibra sia intatta sotto microscopia a campo chiaro prima dell'inserimento (passo 1.1.6.2), la rilucidatura utilizzando la progressione completa della grana (6 μm → 0,01 μm, passo 1.1.6.1) e l'assicurazione che la lama del tagliatore in fibra sia affilata. Per migliorare la capacità di produzione, i laboratori possono implementare modifiche al flusso di lavoro come jig personalizzati per il taglio di fibre utilizzando stadi di traslazione di precisione o sistemi di taglio basati su laser (passo 1.2.4). I produttori di stampa 3D commerciali con sistemi ad alta precisione possono ridurre le esigenze di foratura manuale (passaggi 1.1.3–1.1.4, passo 1.2.3), anche se la precisione dimensionale può variare tra i lotti.

In secondo luogo, l'impianto chirurgico prevede il livellamento del cranio (tolleranza di ±0,03 mm), iniezioni virali in 11–12 siti e impianto multifibra seguito da fissazione con cemento. La precisione del puntamento è compromessa quando il livellamento del cranio supera la tolleranza. Questo può essere mitigato misurando l'inclinazione in più punti anteriori-posteriori distanti 8,25 mm e misurando il rollio a ±2,0–2,5 mm di posizione laterale, assicurando che le barre auricolari stabilizzino completamente il cranio. Le bolle d'aria nelle micropipette per iniezione virale impediscono una consegna accurata e richiedono la riavvio della preparazione (passo 2.9). Durante l'impianto di array multifibra, evitare il contatto del cemento con le punte delle fibre costruendo piramidi di cemento dalla superficie del cranio verso l'alto (passaggi 2.10.3–2.10.5) e lascia un tempo di asciugatura adeguato (≥15 min).

In terzo luogo, la registrazione e l'elaborazione dei dati prevedono la sincronizzazione della telecamera tramite un sistema DAQ, la calibrazione dell'alimentazione LED (0,1 mW in uscita/fibra 1,2 mW, 1,2 mW in uscita/12-fibra del cavo patch) e la pre-elaborazione del segnale con controlli isosbestici. La pipeline di correzione del movimento introdotta qui utilizza la regressione Lasso, che è molto adatta per configurazioni predittive multicanale perché riduce automaticamente i predittori non informativi verso zero, mantenendo solo quelli che contribuiscono significativamente alla correzione degli artefatti. Questa proprietà lo rende particolarmente vantaggioso per la fotometria a doppio colore: includendo segnali isosbestici sia dai canali rossi che dai verdi come predittori, Lasso sfrutta selettivamente i canali che trasportano informazioni di movimento reali, producendo una riduzione del rumore nei segnali a canale rosso (RCaMP) rispetto alla sola correzione della stessa fibra (Figura 4C–D). Poiché Lasso identifica automaticamente i predittori più informativi, è fortemente consigliato utilizzare tutti i canali isosbestici disponibili come input. Detto ciò, la regressione Lasso è uno dei diversi metodi di correzione validi; le alternative includono la modellizzazione generativabayesiana 46, la scala basata sulla frequenza47 e i minimi quadrati ritativamente riponderati (IRLS)48, tutti probabilmente producono una riduzione comparabile degli artefatti, con linee guida per l'implementazione fornite nella Tabella 2. Una qualità del segnale persistente e scarsa nonostante una pre-elaborazione ottimizzata probabilmente indica problemi hardware o chirurgici, e i passaggi 1–2 dovrebbero essere riesaminati

Oltre a queste considerazioni procedurali, la fotometria a doppio colore introduce ulteriori sfide tecniche legate alla separazione spettrale. Una considerazione cruciale nella fotometria a doppio colore è la gestione della sovrapposizione spettrale tra indicatori di calcio verde e rosso. Sebbene l'eliminazione completa della diafonia spettrale sia una sfida a causa della sovrapposizione degli spettri di emissione GCaMP e RCaMP, il nostro approccio di multiplexazione temporale con eccitazione LED intercalata (470 nm per GCaMP, 560 nm per RCaMP, 415 nm isosbestica) e filtri di emissione in banda ottimizzata mitiga sostanzialmente questo problema. In pratica, osserviamo una diafonia minima: la stimolazione a 470 nm evoca un'attività trascurabile nel canale rosso, e viceversa per la stimolazione a 560 nm nel canale verde (Figura 3). I ricercatori preoccupati per la sovrapposizione spettrale residua possono ottimizzare ulteriormente i loro sistemi selezionando filtri a emissione a banda stretta con la massima separazione spettrale basata sulle loro specifiche combinazioni di indicatori.

Rispetto ad altri approcci per registrazioni neurali su larga scala, la fotometria a fibra multisito bicolore su misura offre molti vantaggi significativi. Innanzitutto, mentre la fotometria a fibrasingola 1,2,3, le registrazioni extracellularicontemporanee 4,6 o gli approcci di imaging corticale 8,9 sono limitati a una singola o a un insieme spazialmente vincolato di regioni cerebrali (ad esempio, sulla superficie corticale), il design personalizzabile della stampa 3D che condividiamo qui permette di indirizzare fino a 12 regioni cerebrali ovunque nel cervello con fibre ottiche da 200 μm. In confronto, le ghiere multifibracommercialmente disponibili 5,7 supportano solo fibre otici a 100 μm e sono analogamente vincolate a un insieme limitato di regioni cerebrali direttamente ventrali rispetto all'array lineare della ghiera. Per quanto riguarda il targeting e la registrazione da specifiche regioni cerebrali, il compromesso principale è tra il diametro della fibra e il campo visivo del sistema fotometrico. Gli array multifibre stampati in 3D dotati di fibre da 200 μm registrano da un'area più ampia in ogni sito rispetto alle ferrule multifibre commercialmente disponibili. Nel protocollo attuale, il campo visivo della fotometria del sistema di fotometria limita la registrazione a 12 fibre ottiche a 200 μm. Questo vincolo può essere superato riducendo il diametro della fibra a 100 μm per un massimo di 60 fibre o costruendo un sistema fotometrico personalizzato con un obiettivo della fotocamera più grande.

Infine, questa piattaforma personalizzabile di fotometria a fibra multisito bicolore è stata utilizzata per tracciare longitudinalmente la dinamica dell'attività neurale di due popolazioni neurali geneticamente distinte in 11-12 regioni cerebrali. Utilizzando una strategia Cre-in/Cre-excludente che esprime RCaMP dipendente da Cre e GCaMP che escluda Cre tra popolazioni SBN in un mouse Vgat-cre, sia l'esperienza aggressiva che l'osservazione hanno dimostrato di promuovere schemi condivisi di dinamiche di attività a livello SBN durante future interazioni socialidifensive 42. Utilizzando la stessa strategia virale in un topo Esr1-cre per registrare dai neuroni che esprimono e non esprimono alfa recettori di estrogeni, i modelli di comportamento sociale specifici per territorio sono stati associati a una rapida riscalatura ormonale di un codice d'azione sociale a livello SBN, aumentando l'attività associata al comportamento nel territoriodi origine 43. Queste differenze specifiche del territorio nel comportamento e nella codifica della rete richiedono testosterone circolante nei topi maschi. Sebbene questi studi abbiano utilizzato un approccio virale e una singola linea Cre, studi futuri possono ampliare questi metodi con approcci virali intersezionali, indicatori di calcio espressi geneticamente o segnalatori fluorescenti di segnalazione neuromodulatrice e neuropeptidica.

Ringraziamenti

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Il finanziamento proveniva da NIH K99MH135212 (a E.M.G.), NIH F32MH126562 (a E.M.G.), DP2MH126375 (a A.L.F.), NIH R01MH126035 (a A.L.F.), NYSCF (a A.L.F.), Simons Foundation (SCGB) (a A.L.F.), Klingenstein Foundation (a A.L.F.) e Alfred P. Sloan Fellowship (a A.L.F.), McKnight Foundation (A.L.F). Allen Institute (A.L.F). A.L.F. è una ricercatrice Robertson della New York Stem Cell Foundation.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Punta da trapano #76Città della Punta da Perforazione#76
Punta da trapano #78Città della Punta da Perforazione#78
Punta da trapano #92Città della Punta da Perforazione#92
0.01 & mu; Fogli per lucidatura M GritThorLabsLFCF2
Punte da 0,25 mm x 5,5 mmCittà della Punta da PerforazioneProdotto personalizzatoPunta da trapano 0,25 x 5,5 mm, contattato l'azienda per la costruzione
1 & mu; Fogli per lucidatura M GritThorLabsLF1D
12 patchord a ramificazione fibraLente DoricaCustomBBP(12)_200/220/3000-0.37
_5m_SMA-12xCL_LAF
200 & mu; Fibra ottica mThorLabsFT200UMT
3 & mu; Fogli per lucidatura M GritThorLabsLF3D
30 & mu; Fogli per lucidatura M GritThorLabsLF30D
6 & mu; Fogli per lucidatura M GritThorLabsLF6D
Sutura assorbibileEthiconJ421H
Documentazione dei Minimi Quadrati Penalizzati Ripesanti Iterativamente AdattiviGoogleN/Ahttps://code.google.com/archive/p/airpls/
Perni a perno in legaMcMaster-Carr98381a983
Telecamere comportamentaliTeledyne FLIRBlackfly S
BonsaiBonsai Software FoundationVersione 2.9.0
Microscopio a campo chiaroLeicaES2
Morsetti BulldogFineScienceTools18038-45
DAQCalcolo delle MisurazioniDAQ serie USB-200 MC
Software DAQCalcolo delle MisurazioniDAQami
DrillKopf InstrumentsModello 1911 Stereotassia Drill
Taglianaio in fibraThorLabsXL411/CLVB
Sistema di fotometria a fibraNeurofotometriaFP3002
Manuale del sistema di fotometria a fibraNeurofotometriaN/AManuale del dispositivo di hosting della pagina web: https://neurophotometrics.com/documentation
Scriba a fibraThorLabsS90C
Sfilatore per fibreThorLabsT10S13
Pinza fineFineScienceTools11252-00
Forbici finiFineScienceTools14084-08
Viti di trasmissione G5Sito di produzione Open EphysOEPS-7105
Cacciavite G5Sito di produzione Open EphysOEPS-7121
GCaMP6fLaboratorio di Neuroingegneria Virale PNIEF1a-Cre out-GCaMP6f-WPRE-hGHpA
PREND-DAAddgenehSyn-GRAB_DA1m-WPRE-hGHpA
Cuscina riscaldanteForniture Mediche AbiliHTP-1500
Sistema di riscaldamentoKent ScientificRT-0515
IsofluranoCovetrus29405
jRCaMP1bAddgenepAAV.Syn.Flex.NES-jRCaMP1b.WPRE.SV40
Capotasto esagonale in ottone M0.6MetricScrews.us21614
Reagenti e strumenti per cemento metabondParkellS380
Stampe 3D in resina simile a MicroFine ABSProtoLabsProdotto personalizzatoVedi Fascicoli Supplementari 1-3, 5, 6
Iniettore a nanolitriDrummond Scientific CompanyNanoject IIIniettore a nanolitri
Fogli di cera ParrafinAmcorPellicola polivalente da laboratorio ParaFilm M
PipetterThermoFisher Scientific4641310N
Puck per lucidareOfficina meccanica del Dipartimento di Fisica dell'Università di PrincetonProdotto personalizzatoVedi Fascicolo di Codice Supplementare 4
Misuratore di potenzaThorLabsPM100D
Unguento ottico PuralubeDechraP1490-1
PythonPython Software FoundationN/A
Tubo di plastica morbida per corno patchMcMaster-Carr3774N4
SpinViewTeledyne FLIRversione 1.25.0.52Software di imaging che controlla le telecamere comportamentali
Fotogramma stereotassicoKopf InstrumentsModello 1900
Documentazione TMACN/AN/ACodice TMAC: https://github.com/Nondairy-Creamer/tmac
Tubi per struttura stereotassicaSaint-GobainE-3603
VaporizzatoreKent ScientificVaporizzatore VetFlo

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cui, G., et al. Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation. Nature. 494 (7436), 238-242 (2013).
  2. Adelsberger, H., Zainos, A., Alvarez, M., Romo, R., Konnerth, A. Local domains of motor cortical activity revealed by fiber-optic calcium recordings in behaving nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (1), 463-468 (2014).
  3. Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
  4. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
  5. Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
  6. Steinmetz, N. A., et al. Neuropixels 2.0: A miniaturized high-density probe for stable, long-term brain recordings. Science. 372 (6539), (2021).
  7. Guo, Z., et al. Neural dynamics in the limbic system during male social behaviors. Neuron. 111 (20), 3288-3306.e4 (2023).
  8. Ma, Y., et al. Wide-field optical mapping of neural activity and brain haemodynamics: considerations and novel approaches. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1705), 20150360(2016).
  9. Musall, S., Kaufman, M. T., Juavinett, A. L., Gluf, S., Churchland, A. K. Single-trial neural dynamics are dominated by richly varied movements. Nature Neuroscience. 22 (10), 1677-1686 (2019).
  10. Zhou, Z. C., et al. Deep-brain optical recording of neural dynamics during behavior. Neuron. 111 (23), 3716-3738 (2023).
  11. Martianova, E., Aronson, S., Proulx, C. D. Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals. JoVE. (152), e60278(2019).
  12. Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
  13. Newman, S. W. The Medial Extended Amygdala in Male Reproductive Behavior A Node in the Mammalian Social Behavior Network. Annals of the New York Academy of Sciences. 877, 242-257 (1999).
  14. Goodson, J. L. The vertebrate social behavior network: Evolutionary themes and variations. Hormones and Behavior. 48 (1), 11-22 (2005).
  15. O’Connell, L. A., Hofmann, H. A. Evolution of a Vertebrate Social Decision-Making Network. Science. 336 (6085), 1154-1157 (2012).
  16. Wu, M. V., Tollkuhn, J. Estrogen receptor alpha is required in GABAergic, but not glutamatergic, neurons to masculinize behavior. Hormones and Behavior. 95, 3-12 (2017).
  17. Moffitt, J. R., et al. spatial, and functional single-cell profiling of the hypothalamic preoptic region. Science. 362 (6416), eaau5324(2018).
  18. Gegenhuber, B., Wu, M. V., Bronstein, R., Tollkuhn, J. Gene regulation by gonadal hormone receptors underlies brain sex differences. Nature. 606 (7912), 153-159 (2022).
  19. Knoedler, J. R., et al. A functional cellular framework for sex and estrous cycle-dependent gene expression and behavior. Cell. 185 (4), 654-671.e22 (2022).
  20. Musatov, S., Chen, W., Pfaff, D. W., Kaplitt, M. G., Ogawa, S. RNAi-mediated silencing of estrogen receptor in the ventromedial nucleus of hypothalamus abolishes female sexual behaviors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (27), 10456-10460 (2006).
  21. Lee, H., et al. Scalable control of mounting and attack by Esr1+ neurons in the ventromedial hypothalamus. Nature. 509 (7502), 627-632 (2014).
  22. Hashikawa, K., et al. Esr1+ cells in the ventromedial hypothalamus control female aggression. Nature Neuroscience. 20 (11), 1580-1590 (2017).
  23. Fang, Y. -Y., Yamaguchi, T., Song, S. C., Tritsch, N. X., Lin, D. A Hypothalamic Midbrain Pathway Essential for Driving Maternal Behaviors. Neuron. 98 (1), 192-207.e10 (2018).
  24. Wei, Y. -C., et al. Medial preoptic area in mice is capable of mediating sexually dimorphic behaviors regardless of gender. Nature Communications. 9 (1), 279(2018).
  25. Yamaguchi, T., Wei, D., Song, S. C., Lim, B., Tritsch, N. X., Lin, D. Posterior amygdala regulates sexual and aggressive behaviors in male mice. Nature Neuroscience. 23 (9), 1111-1124 (2020).
  26. Yang, B., Karigo, T., Anderson, D. J. Transformations of neural representations in a social behaviour network. Nature. , (2022).
  27. Jacobowitz, D. M., O’Donohue, T. L. alpha-Melanocyte stimulating hormone: immunohistochemical identification and mapping in neurons of rat brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (12), 6300-6304 (1978).
  28. Flanigan, M. E., et al. Orexin signaling in GABAergic lateral habenula neurons modulates aggressive behavior in male mice. Nature Neuroscience. 23 (5), 638-650 (2020).
  29. Bayless, D. W., et al. A neural circuit for male sexual behavior and reward. Cell. 186 (18), 3862-3881.e28 (2023).
  30. Dawson, M., et al. Hypocretin/orexin neurons encode social discrimination and exhibit a sex-dependent necessity for social interaction. Cell Reports. 42 (7), 112815(2023).
  31. Iyilikci, O., et al. Age-specific regulation of sociability by hypothalamic Agrp neurons. bioRxiv. , (2025).
  32. Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), eaat4422(2018).
  33. Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496.e19 (2018).
  34. Sun, F., et al. Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo. Nature Methods. 17 (11), 1156-1166 (2020).
  35. Duffet, L., et al. A genetically encoded sensor for in vivo imaging of orexin neuropeptides. Nature Methods. 19 (2), 231-241 (2022).
  36. Ino, D., Tanaka, Y., Hibino, H., Nishiyama, M. A fluorescent sensor for real-time measurement of extracellular oxytocin dynamics in the brain. Nature Methods. 19 (10), 1286-1294 (2022).
  37. Wang, H., et al. A tool kit of highly selective and sensitive genetically encoded neuropeptide sensors. Science. 382 (6672), eabq8173(2023).
  38. Dong, C., et al. Unlocking opioid neuropeptide dynamics with genetically encoded biosensors. Nature Neuroscience. 27 (9), 1844-1857 (2024).
  39. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  40. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, e12727(2016).
  41. Zhang, Z. -M., Chen, S., Liang, Y. -Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. The Analyst. 135 (5), 1138(2010).
  42. Iravedra-Garcia, J. M., Guthman, E. M., Cuturela, L., Ocasio-Arce, E. J., Pillow, J. W., Falkner, A. L. Aggression experience and observation promote shared behavioral and neural changes. bioRxiv. , (2024).
  43. Guthman, E. M., Iravedra-Garcia, J. M., Sirrs, L., Le, A., Falkner, A. L. Context rescales a social action code in a hormone-sensitive network. bioRxiv. , (2025).
  44. Zhang, Z. -M., Chen, S., Liang, Y. -Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. The Analyst. 135 (5), 1138(2010).
  45. Saunders, A., Johnson, C. A., Sabatini, B. L. Novel recombinant adeno-associated viruses for Cre activated and inactivated transgene expression in neurons. Frontiers in Neural Circuits. 6, (2012).
  46. Creamer, M. S., Chen, K. S., Leifer, A. M., Pillow, J. W. Correcting motion induced fluorescence artifacts in two-channel neural imaging. PLOS Computational Biology. 18 (9), e1010421(2022).
  47. Donka, R. M., Loh, M. K., Konanur, V. R., Roitman, M. F., Roitman, J. D. PASTa: An Open-Source Analysis and Signal Processing Toolbox for Fiber Photometry Data. Current Protocols. 5 (7), e70161(2025).
  48. Keevers, L. J., Jean-Richard-dit-Bressel, P. Obtaining artifact-corrected signals in fiber photometry via isosbestic signals, robust regression, and dF/F calculations. Neurophotonics. 12 (02), (2025).

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