Articolo metodologico

Sequenziamento metagenomico di nuova generazione del liquido cerebrospinale per la rilevazione di patogeni del sistema nervoso centrale

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DOI:

10.3791/70075

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17 aprile 2026

 ,  ,  , 
1University of California, San Francisco Weill Institute for Neurosciences, Department of Neurology, University of California, San Francisco

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo di ricerca delinea un flusso di lavoro ottimizzato per il sequenziamento metagenomico di nuova generazione (mNGS) del liquido cerebrospinale. Affrontando sfide uniche dei campioni a basso contenuto di biomassa, il metodo consente una rilevazione robusta dei patogeni in diversi contesti di risorse, fornendo una base versatile per applicazioni nella ricerca sulle malattie neuroinfettive.

Abstract

Il sequenziamento metagenomico di nuova generazione (mNGS) si è affermato come uno strumento potente per la rilevazione imparziale dei patogeni e per la profilazione trascrizionale dell'ospite in contesti clinici e di ricerca. Sebbene la sua utilità nella diagnosi delle infezioni del sistema nervoso centrale (SNC) sia sempre più riconosciuta, i campioni di liquido cerebrospinale (LCR) presentano sfide uniche a causa della bassa abbondanza di acidi nucleici e della suscettibilità alla degradazione. Questo studio presenta un protocollo ottimizzato basato sulla ricerca per le piattaforme di sequenziamento Illumina, adattato al CSF mNGS, che comprende la gestione dei campioni, l'estrazione degli acidi nucleici, la preparazione delle librerie, il sequenziamento e l'analisi bioinformatica. Sono inoltre previsti approcci di controllo qualità adattabili sia a contesti ad alto che a basso livello di risorse, incluse alternative all'elettroforesi capillare. Questo studio dimostra la robustezza del protocollo attraverso due coorti rappresentative: un flusso di lavoro ad alta profondità basato su NovaSeq e un flusso di lavoro basato su NextSeq e attento ai costi. In queste coorti, i patogeni sono stati rilevati in oltre il 50% dei casi, sottolineando il potenziale diagnostico del metodo anche con adattamenti limitati nelle risorse. Questo protocollo facilita il mNGS riproducibile del LCR, fornendo una base per applicazioni diverse nella ricerca e diagnostica delle malattie neuroinfettive.

Introduzione

Il sequenziamento metagenomico di nuova generazione (mNGS) è una tecnica molecolare sempre più utilizzata che consente la rilevazione di un ampio spettro di acidi nucleici all'interno di un dato campione ambientale oospite 1. Amplificando e sequenziando la stragrande maggioranza del materiale genetico all'interno di un campione, la mNGS non richiede un'ipotesi preconcetta sui microrganismi specifici che potrebbero essere presenti. La mNGS ha dimostrato utilità come strumento diagnostico in diversi contesti clinici, come per la rilevazione di patogeni rari o manifestazioni atipiche di malattieinfettive 1,2,3. Inoltre, il profilo trascrizionale dell'ospite è anche catturato dai dati di sequenziamento dell'RNA generati dal saggio mNGS, permettendo ai ricercatori di comprendere meglio la risposta immunitaria dell'ospite a vari statipatologici 4. L'applicabilità del mNGS a un'ampia gamma di contesti clinici e di ricerca, insieme alla drastica diminuzione del costo del sequenziamento generico negli ultimi decenni, ha portato a una crescita straordinaria nell'uso di questatecnologia.

In particolare, la mNGS ha mostrato potenzialità nel rilevamento delle infezioni del sistema nervoso centrale (SNC), che restano difficili dadiagnosticare 2,6,7. Prima dell'avvento dei test clinici mNGS, il California Encephalitis Project esaminava le cause dell'encefalite in tutto lo stato e scoprì che oltre la metà dei casi rimaneva non diagnosticata, nonostante l'utilizzo di un panel ampliato di test molecolari e una valutazione clinicadettagliata 8. Ora, oltre due decenni dopo, un saggio mNGS sul liquido cerebrospinale (LCR) clinicamente convalidato ha rilevato la presenza di organismi patogeni nel LCR di quasi il 15% dei pazienti con sospette infezioni dal SNC in un periodo disette anni 7. Inoltre, tra i pazienti con diagnosi infettive confermate, uno su cinque è stato diagnosticato solo con questo test clinico di LCR (mNGS), sottolineando l'utilità di questo approcciodi test. Inoltre, studi hanno anche dimostrato il potenziale di prevedere la probabilità di varie infezioni dal SNC basandosi sul trascrittoma dell'ospite generato dal testmNGS 9,10,11.

Tuttavia, l'accessibilità di questa promettente tecnica è limitata da sfide uniche nella gestione e lavorazione dei campioni di CSF. In particolare, la quantità di DNA e RNA del LCR è spesso inferiore alla quantità minima specificata dai kit di preparazione della biblioteca12,13. La qualità degli acidi nucleici può anche essere subottimale, dato che i campioni di LCR raccolti a scopo clinico sono spesso conservati a temperature alle quali DNAsi e RNAsi possono rimanereattivi 14. Questo articolo descrive un protocollo CSF mNGS basato sulla ricerca per le piattaforme di sequenziamento Illumina, ottimizzato per massimizzare la probabilità di generare dati utilizzabili per la rilevazione dei patogeni (Figura 1).

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Protocollo

Questo protocollo è stato sviluppato e testato utilizzando campioni raccolti nell'ambito di studi approvati dal Consiglio di Revisione Istituzionale dell'UCSF.

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Figura 1: Elaborazione dei campioni di sequenziamento metagenomico del liquido cerebrospinale (LCR) (mNGS) e flusso di lavoro analitico per la rilevazione dei patogeni .Questo diagramma mostra i primi passaggi nei percorsi di laboratorio umido e bioinformatica del CSF mNGS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Considerazioni sulla gestione del campione di CSF

NOTA: i risultati del mNGS sono ottimali se la preparazione della libreria di CSF avviene al momento della raccolta, oppure se i campioni di CSF vengono conservati tramite congelamento rapido in azoto liquido, seguito da una conservazione a lungo termine a -80 °C 15. In alternativa, l'uso di soluzioni conservanti come lo scudo DNA/RNA al momento della raccolta del campione può permettere la conservazione a temperatura ambiente per periodi piùlunghi di tempo 16,17. Questo può essere preferibile in situazioni in cui ci sono dubbi sull'affidabilità della catena del freddo. Inoltre, evitare cicli di congelamento-disgelo inutili può aiutare a preservare l'integrità degli acidi nucleici, e potrebbe essere consigliabile pre-aliquotare i campioni al momento della raccolta se sono previsti più flussi di lavoro analitici per i campionidi CSF 18,19.

2. Estrazione dell'acido nucleico del LCR

ATTENZIONE: Agire in un armadietto di livello di biosicurezza appropriato con guanti e camice da laboratorio per ridurre il rischio di trasmissione di organismi infettivi. I reagenti sono dannosi se ingeriti, inati o entrano a contatto con la pelle. Smaltire i materiali usati come rifiuti chimici pericolosi in conformità con le normative locali.

  1. Il Quick-DNA/RNA Kit generalmente funziona bene per campioni con bassa abbondanza di acidi nucleici.
  2. Scongelare i campioni di liquido cefaloridale sul ghiaccio, poi trasferire 100 μL–1 mL di ciascun campione in un tubo da 1,5 mL e centrifugare a 16.000 x g a 4 °C per 10 minuti.
  3. Pipetta con cura il surnante, lasciando la pallina (spesso invisibile a occhio nudo) e 100 μL di soprantantante.
  4. Aggiungere 100 μL di scudo DNA/RNA ai restanti 100 μL di soprantantante e pellet, e mescolare accuratamente con pipette.
  5. Successivamente, si aggiungono 600 μL di miscela di tampone di lisi DNA/RNA e pipette finché la soluzione non diventa omogenea.
  6. Segui il resto del protocollo di estrazione DNA/RNA come descritto dal produttore nelle Appendici Supplementari A, con le seguenti importanti modifiche specifiche per il liquido cerebrospinale:
    1. Esegui tutti i passaggi di centrifugazione per 1 minuto alla velocità massima (~21.000 x g) tranne il passaggio finale di lavaggio DNA/RNA, che dovrebbe durare 3 minuti alla massima velocità.
    2. Eludi il campione aggiungendo 22 μL (invece di 25 μL) di acqua priva di nucleasi direttamente sulla matrice della colonna, quindi incubare per 3 minuti a temperatura ambiente. Il volume maggiore generalmente comporta una maggiore quantità totale di acido nucleico eluzionato dalla colonna.
    3. Dopo l'eluzione, pipetta il flusso di flusso di nuovo sulla matrice della colonna e centrifuga di nuovo per un minuto alla massima velocità. Trasferire il campione in un nuovo tubo di stoccaggio da 1,5 mL e procedere immediatamente alla preparazione della biblioteca oppure conservare a -80 °C.

3. Preparazione della libreria RNA del CSF

ATTENZIONE: Lavorare in un adeguato armadietto di biosicurezza, indossando guanti e camice da laboratorio. I reagenti sono dannosi se ingeriti, inati o entrano a contatto con la pelle. Smaltire i materiali usati come rifiuti chimici pericolosi in conformità con le normative locali.

NOTA: Considerazioni importanti prima di iniziare: la deplezione dell'rRNA è preferita rispetto all'arricchimento da poliadenilazione per l'isolamento dell'mRNA, dato che la deplezione dell'rRNA non richiede ulteriori passaggi di pulizia delle perle (che possono ridurre la resa di mRNA utilizzabile), e alcuni trascrivi neuroinvasivi del virus RNA non presentano poliadenilazione. L'ERCC (Consorzio Esterno di Controlli RNA) può essere aggiunto come misura di controllo qualità, anche se non è strettamente necessario. Se l'RNA è stato immagazzinato a -80 °C dopo l'estrazione, si scongela sul ghiaccio prima dell'inizio.

  1. Frammentazione e priming dell'RNA: Pipette mixa quanto segue in un tubo di reazione a catena della polimerasi (PCR): campione di RNA da 3,5 μL, spike-in ERCC diluito 1:2500 0,5 μL, tampone di reazione a primo filo da 4 μL (5x), primer casuali da 1 μL e 1 μL rRNA diluito 1:100 (Tabella dei Materiali). In un termociclatore, imposta il coperchio riscaldato a 105 °C e incuba i campioni a 75 °C per 2 minuti, 70 °C per 2 minuti, 65 °C per 2 minuti, 60 °C per 2 minuti, 55 °C per 2 minuti, 37 °C per 5 minuti e 25 °C per 5 minuti.
  2. Sintesi del cDNA a primo filamento: Pipette miscela l'RNA frammentato e preparato (10 μL) con 8 μL di acqua priva di nucleasi e 2 μL miscela enzimatica di sintesi a primo filamento. In un termociclatore, imposta il coperchio riscaldato a 105 °C e incuba i campioni a 25 °C per 10 minuti, 42 °C per 15 minuti e 70 °C per 15 minuti.
  3. Sintesi del cDNA a seconda catena: Le pipette mescolano il DNA sintetizzato a primo filamento (20 μL) con 8 μL di buffer di reazione di sintesi a seconda catena, 4 μL miscela enzimatica di sintesi a seconda catena e 48 μL di acqua priva di nucleasi. In un termociclatore, incubare i campioni per 1 ora a 16 °C, con il coperchio riscaldato spento.
  4. Eseguire una purificazione delle sfere magnetiche (Appendici Supplementari B) utilizzando un rapporto 1,8x delle sfere magnetiche SPRI (144 μL). Eludi in acqua priva di nucleasi da 53 μL e trasferisci 50 μL del supernante finale (contenente cDNA a doppio filamento purificato) in un tubo PCR pulito e privo di nucleasi. A questo punto, i campioni possono essere congelati in sicurezza a -20 °C durante la notte, se necessario.
  5. Preparazione finale della libreria cDNA: Se il campione è stato conservato a -20 °C durante la notte, scongelarlo sul ghiaccio prima di riavviarlo. Pipette mescola il ds-cDNA purificato (50 μL) con 7 μL di tampone di reazione di preparazione finale e 3 μL di miscela enzimatica di preparazione terminale.
  6. In un termociclatore, incubare i campioni a 20 °C per 30 minuti e a 65 °C per 30 minuti, con il coperchio riscaldato spento.
  7. Legatura dell'adattatore (eseguire questo passaggio sul ghiaccio): Creare una diluizione 1:100 dell'adattatore in acqua priva di nucleasi. Pipetta la miscela di reazione di preparazione finale (60 μL) in un tubo contenente miscela master di legazione da 30 μL, un potenziatore di legatura da 1 μL e un adattatore diluito 1:100 da 2,5 μL. Assicurati che l'adattatore venga aggiunto separatamente (ad esempio, non premiscelato con il mix master di legatura o l'enhancer di legazione) per evitare la formazione di dimer adattatori.
  8. In un termociclatore, incubare i campioni a 20 °C per 15 minuti, con il coperchio riscaldato spento.
  9. Procedere immediatamente alla purificazione delle sfere magnetiche (Appendice Supplementare 2) utilizzando un rapporto 0,9x delle sfere magnetiche SPRI (87 μL).
  10. Eludi in acqua priva di nucleasi da 17 μL e trasferisci 15 μL del supernatant finale in un tubo PCR pulito senza nucleasi
  11. PCR a barre: Pipetta il cDNA purificato e legato con adattatore (15 μL) in un tubo con enzima USER da 3 μL, Master Mix Q5 da 25 μL e primer unici con codice a barre da 10 μL. In un termociclatore, imposta il coperchio riscaldato a 105 °C, incuba i campioni a 37 °C per 15 minuti, poi 98 °C per 30 secondi, e infine esegui 19 cicli a 98 °C per 10 secondi e 65 °C per 75 secondi. Concludi la PCR incubando a 65 °C per 5 minuti.
  12. Eseguire una purificazione finale delle sfere magnetiche utilizzando un rapporto 0,8x delle sfere magnetiche (43 μL). Eludi in acqua priva di nucleasi da 23 μL e, dopo l'ultimo passaggio di separazione delle sfere, trasferisci 20 μL in un tubo PCR pulito e senza nucleasi. A questo punto, i campioni possono essere congelati in sicurezza a -20 °C durante la notte, se necessario.

4. Preparazione della libreria di DNA del CSF

ATTENZIONE: Esegui in un armadietto di livello di biosicurezza appropriato con guanti e camice da laboratorio. I reagenti sono dannosi se ingeriti, inati o entrano a contatto con la pelle. Smaltire i materiali usati come rifiuti chimici pericolosi in conformità con le normative locali.

  1. Se il DNA estratto è stato conservato a -20 °C durante la notte, scongelarlo sul ghiaccio prima di riavviare.
  2. Frammentazione del DNA e preparazione finale: Mescola accuratamente il tampone di reazione del primo filamento tramite vortex e pipette mescolando la soluzione per risospendere eventuali precipitati. Miscela per pipette 3,5 μL del DNA estratto, 22,5 μL acqua priva di nucleasi, 7 μL tampone per la reazione a primo filamento e 2 μL miscela enzimatica a primo filamento.
  3. In un termociclatore, imposta il coperchio riscaldato a 105 °C e incuba i campioni a 37 °C per 5 minuti, poi a 65 °C per 30 minuti.
  4. Il processo di ligatura degli adattatori e PCR a barre è identico per le librerie di DNA e RNA. Ripeti le sezioni 7–10 della "Preparazione della Biblioteca RNA del CSF" con il DNA frammentato e preparato alle estremità per completare la preparazione della libreria del DNA.

5. Controllo qualità delle biblioteche e pooling

  1. Quantificare la concentrazione delle librerie di campioni tramite il kit di quantificazione del DNA e il corrispondente fluorometro. I controlli idrici dovrebbero avere concentrazioni sostanzialmente inferiori (o non quantificabili) rispetto agli altri campioni.
  2. Valuta le dimensioni della libreria dei campioni facendo passare i campioni su una macchina automatica per l'elettroforesi capillare.
  3. In alternativa, se non è disponibile una macchina automatica per elettroforesi capillare, si amplifica ulteriormente 1-2 μL del campione eseguendo una reazione PCR con primer universali Illumina, e poi si esegue l'elettroforesi di 10 μL del prodotto finale su un gel di agarosio al 2%. Smaltire i materiali usati come rifiuti chimici pericolosi in conformità con le normative locali.
    NOTA: La lunghezza ottimale della libreria è di circa 400–500 coppie di basi, quindi le future incubazioni di frammentazione dovrebbero essere adeguate di conseguenza se le dimensioni delle librerie sono maggiori o più corte del desiderato. Inoltre, è fondamentale valutare la presenza di dimeri adattatori, che sono lunghi circa 150 coppie di basi e si verificano quando due molecole adattatori si legano involontariamente insieme senza una sequenza di inserimento. Anche se presenti in piccole quantità, i dimer adattatori tendono a raggrupparsi e sequenziarsi in modo efficiente sulla cella di flusso, riducendo la proporzione di letture utilizzabili durante una sequenza. Pertanto, se sono presenti dimeri adattatori, eseguire una purificazione aggiuntiva delle perle magnetiche con un rapporto 0,8x delle sfere magnetiche SPRI. (Da notare che, se il >10% del campione è un dimero adattatore, potrebbero essere necessari 2-3 cicli di purificazione della sfera magnetica per rimuovere la maggior parte dei dimer adattatori).
  4. Per garantire una profondità di sequenziamento simile tra i campioni all'interno della stessa corsa di sequenziamento, è necessario mettere in pool quantità equimolari di ciascun campione. Se le dimensioni delle librerie sono comparabili su tutti i campioni, basta mettere insieme masse equivalenti di ciascuna libreria di RNA e ripetere separatamente per ogni libreria di DNA.

6. Considerazioni sulla sequenza

  1. I campioni aggregati sono ora pronti per il sequenziamento sui dispositivi di sequenziamento Illumina. Se il sequenziamento è interno (anziché tramite una struttura specializzata di sequenziamento), denatura e diluzione attenta delle librerie aggregate secondo le istruzioni del dispositivo di sequenziamento prima di caricare il pool sulla cartuccia del reagente (la concentrazione tipica è di 4 nM per la maggior parte delle piattaforme di sequenziamento Illumina).
  2. Calcola la profondità di sequenziamento stimata dividendo il rendimento dati atteso per la cella di flusso Illumina per il numero di campioni multiplexati in esecuzione.
    NOTA: La determinazione della profondità di sequenziamento desiderata dipende da diversi fattori, tra cui il costo, il dispositivo di sequenziamento utilizzato e gli obiettivi dell'esperimento. Due esempi di profondità di sequenziamento diverse sono presentati di seguito nella sezione Risultati Rappresentativi.

7. Analisi dei dati per la rilevazione dei patogeni

  1. Utilizzare la piattaforma web open-source Chan Zuckerberg ID (CZID, https://www.czid.org, Illumina mNGS Pipeline v8.3) per eseguire l'analisi metagenomica per il rilevamento dei patogeni. CZID include anche opzioni per caricare campioni tramite interfaccia da riga di comando e trasferimento diretto da un account Illumina BaseSpace a CZID. Una panoramica dettagliata dell'analisi dei dati CZID mNGS è disponibile su https://chanzuckerberg.zendesk.com/hc/en-us/articles/13770737266196-Guide-to-mNGS-Data-Analysis
  2. Accedi a CZID, clicca su "carica", seleziona "metagenomica" per il tipo di analisi e seleziona i file fastq di input dalla sequenza. Inserisci le informazioni necessarie per ogni campione, inclusi nome del campione, tipo di campione (CSF) e nucleotide (RNA o DNA).
    NOTA: I file caricati vengono elaborati automaticamente tramite la pipeline CZID, che incorpora diversi strumenti computazionali come STAR, Bowtie2, Trimmomatic, PriceSeq e GSNAP, tra gli altri, per rimuovere letture di bassa qualità e sequenze di letture umane. La pipeline poi allinea e assembla le sequenze filtrate utilizzando i database di nucleotidi (NT) e proteine (NR) del National Center for Biotechnology Information (NCBI) tramite i programmi software Minimap2 e DIAMOND, rispettivamente. L'output finale del CZID include i conteggi dei taxoni NT/NR e i conteggi contigui (segmenti contigui e sovrapposti generati durante l'assemblaggio) per ogni campione.
  3. Una volta elaborato, clicca sulla cartella del progetto contenente i campioni e naviga nella dashboard riassuntivo.
  4. Scorri verso il basso per esaminare il numero di letture per campione (e confronta con il numero atteso di letture basandosi sulla cella di flusso Illumina utilizzata e sul numero di campioni multiplexati durante l'esecuzione di sequenziamento), la percentuale di letture che superano il filtro di controllo qualità e il rapporto di compressione duplicato per valutare eventuali sovraamplificazioni PCR distorte.
  5. La presenza di contaminazione da frammenti di acidi nucleici ambientali - acquisiti durante il processo di raccolta dei campioni di CSF, o durante l'estrazione/preparazione della biblioteca - è un evento comune20. Per determinare se le letture batteriche, fungine e parassite siano veramente positive, si possono considerare potenziali metodi che utilizzano i conteggi normalizzati delle letture (letture per milione, o rPM):
    1. Creare un modello di fondo (ad esempio, utilizzando campioni d'acqua estratti, preparati e sequenziati) direttamente all'interno del CZID per filtrare eventuali taxon con rPM simili o inferiori in abbondanza rispetto al modello di fondo (e quindi probabilmente rappresentano contaminazione). All'interno della cartella del progetto, seleziona ciascuno dei campioni di controllo dell'acqua e poi clicca su "modello di background" per crearlo. Durante l'analisi di ogni campione, seleziona il modello di fondo e clicca su "filter soglia" per applicare un "NTZ Score" > 1 (o superiore) per filtrare i contaminanti probabili.
    2. Utilizzare soglie rpm predefinite, comeil campione rpM > 10* (controlli rpm medi) o log10 (campione rPM) almeno 1 log superiore a log 10 (rPMmedia per l'intera coorte). Per prima cosa, scarica l'rPM specifico per ogni tasso selezionando ogni campione nella pagina del progetto, cliccando su download e selezionando "Risultati combinati del tasson campione." Il file .csv risultante può essere analizzato utilizzando software statistici come R o Stata a desiderio.
      NOTA: Data la minore abbondanza relativa di patogeni virali, qualsiasi virus con potenziale neuroinvasivo noto e almeno una lettura allineata al genoma virale dovrebbe essere considerato un risultato positivo (e idealmente, confermato tramite mNGS ripetuto o test clinici specifici per il patogeno). Inoltre, la pipeline analitica richiede che ogni lettura nel file fastq sia allineata computazionalmente al genoma di riferimento più probabile nel database NCBI. Di conseguenza, alcune letture possono essere relativamente non specifiche per un patogeno particolare e teoricamente potrebbero essersi allineate a un'ampia gamma di organismi piuttosto che al taxon specifico assegnato nella CZID. Dato questo rischio, la conferma manuale dei richiami positivi dovrebbe essere effettuata confermando l'allineamento tramite lo strumento web NCBI BLAST (le letture specifiche di un taxon possono essere inviate direttamente da CZID a NCBI BLAST cliccando sull'icona blast accanto al taxon pertinente).

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Risultati

Controllo qualità della biblioteca
Dopo l'estrazione di DNA/RNA, la concentrazione misurata del DNA estratto è generalmente di 1–10 ng/μL. Tuttavia, la concentrazione dell'RNA estratto è spesso dell'ordine di pg/μL, e quindi è spesso non rilevabile dagli spettrofotometri. Dopo la preparazione della libreria, le librerie di cDNA e DNA purificate e amplificate sono generalmente a una concentrazione di 0,5–10 ng/μL e 10–30 ng/μL, rispettivamente. I dati di elettroforesi ...

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Discussione

Ci sono considerazioni importanti che potrebbero richiedere modifiche a questo protocollo, a seconda della profondità di sequenziamento desiderata, della piattaforma di sequenziamento utilizzata e della disponibilità di apparecchiature per il controllo qualità. Tuttavia, le due coorti rappresentative qui presentate dimostrano che una rilevazione robusta dei patogeni è possibile in un'ampia gamma di condizioni sperimentali. In particolare, la Coorte B ha dimostrato che, nonostante diverse...

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Dichiarazioni

M.R.W. riceve finanziamenti per la ricerca non correlati da Roche/Genentech, Novartis e Kyverna Therapeutics ed è fondatore e membro del consiglio di amministrazione di Delve Bio Inc. Ha fornito servizi di consulenza a Pfizer, Vertex Pharmaceuticals, Ouro Medicines e Indapta Therapeutics.

Ringraziamenti

Questo studio è stato finanziato dal Fogarty International Center dei National Institutes of Health nell'ambito del Premio Numero D43TW009343. Vorremmo ringraziare i numerosi ricercatori del Wilson Lab, UCSF e CZI che hanno contribuito allo sviluppo e all'ottimizzazione dei protocolli mNGS per diverse applicazioni di ricerca negli ultimi anni.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Striscia per tubi PCR da 0,2 mLEppendorf30124359
Tubi di loBbinding di DNA da 1,5 mLEppendorf30108051
Tubi Safe Lock da 1,5 mLEppendorf30120191
Miscela di Spike-In di RNA ERCCThermo Fisher4456740
Reagenti D1000 ad alta sensibilitàAgilent5067-5585
Invitrogen Collibri Library Amplification Master MixThermo FisherA38539050
Mastercycler x50Thermo Fisher6311000010
NEBNext Multiplex Oligos per IlluminaNew England Biolabs7335S/L
Kit di preparazione per la libreria di DNA NEBNext Ultra IINew England BiolabsE7645
NEBNext Ultra II Kit di Preparazione della Libreria RNA per IlluminaNew England BiolabsE7770
NextSeq 500/550 Kit ad alta potenza v2.5 (150 cicli)Illumina20024907
NextSeq 550IlluminaN/a
QIAseq FastSelect -rRNA HMR KitQuiagen334386
Qubit 1X dsDNA kit per il test ad alta sensibilitàQubitQ33230
Fluorometro Qubit 4Thermo Fishern/a
Quick-DNA/RNA Microprep Plus Kit  ZymoD7005
TapeStation 4150AgilentG2992AA

Riferimenti

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