Questo protocollo descrive un metodo di estrazione acido-solvente a due fasi per isolare acidi grassi a catena corta da campioni fecali di topo a basso input senza derivatizzazione.
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Articolo metodologico
Estrazione degli acidi grassi a catena corta dalle feci del topo utilizzando un metodo acido-solvente a due fasi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo articolo descrive un protocollo per estrarre acidi grassi a catena corta (SCFA) da campioni fecali di topo a basso input, utilizzando una strategia di estrazione acido-solvente a due fasi. Il metodo è progettato per apporti fecali individuali di circa 20–50 mg e impiega acido cloridrico diluito e acetato di etil per consentire la separazione delle fasi senza derivatizzazione. Il protocollo consiste in omogeneizzazione fecale, acidificazione, partizione dei solventi organici e centrifugazione a bassa temperatura, e può essere eseguito utilizzando apparecchiature standard di laboratorio comunemente disponibili nei laboratori di ricerca. Dopo l'estrazione, gli SCFA sono adatti all'analisi a valle tramite piattaforme di cromatografia gassistica di routine. L'esecuzione efficace del protocollo è indicata dal rilevamento di picchi SCFA chiaramente risolti a tempi caratteristici di ritenzione sopra il rumore di fondo, come dimostrato per i principali SCFA fecali tra cui acetato, propionato e butirato da campioni di muro individuali. Questo protocollo affronta una sfida procedurale comune negli studi su piccoli animali fornendo un flusso di lavoro standardizzato per l'estrazione SCFA fecale da materiale campione limitato, mantenendo al contempo la compatibilità con i flussi di lavoro analitici di routine.
Introduzione
Questo protocollo è stato sviluppato per consentire l'estrazione di acidi grassi a catena corta (SCFA) da campioni fecali di topo a basso input, in un formato compatibile con l'analisi di routine basata sulla cromatografia gassistica (GC). Gli SCFA sono acidi grassi organici volatili con meno di sei atomi di carbonio, principalmente tra cui acido acetico, acido propionico e acido butirico, prodotti dal microbiota intestinale attraverso la fermentazione di fibre alimentariindigestibili 1. Quantificare questi metaboliti da singoli topi è spesso necessario in studi su piccoli animali dove il materiale fecale è limitato e i campioni sono collegati ai fenotipi comportamentali, metabolici o fisiologici 2,3,4,5,6. È quindi necessario un flusso di lavoro pratico e a basso input per supportare progetti sperimentali che si basano su misurazioni SCFA per animale.
Gli approcci esistenti per l'analisi SCFA fecale presentano diversi vincoli metodologici. La quantificazione degli SCFA nei campioni fecali rimane analiticamente difficile a causa della loro volatilità, della bassa abbondanza e della complessità delle matricibiologiche 7. I flussi di lavoro standard spesso richiedono fasi di derivatizzazione, grandi volumi di campioni e attrezzature specializzate come la gestione automatizzata dei liquidi, piattaforme di omogeneizzazione specializzate o colonne di estrazione in fasesolida 8, 9, 10, 11. Questi requisiti possono limitare l'accessibilità e la scalabilità, in particolare negli studi sui topi dove la produzione fecale per animale è minima e il campionamento longitudinale o specifico per genotipo è comune 12,13,14. Di conseguenza, rimane una lacuna metodologica per i protocolli che permettono l'estrazione SCFA da piccoli input fecali senza derivatizzazione, pur rimanendo compatibili con i flussi di lavoro standard della cromatografia gassosa.
Il protocollo descritto qui affronta questa lacuna impiegando una strategia di estrazione acido-solvente a due fasi, utilizzando acido cloridrico diluito e acetato di etile. Il flusso di lavoro consiste in omogeneizzazione fecale, acidificazione, partizione dei solventi organici e centrifugazione a bassa temperatura, ed è progettato per operare con piccole masse fecali in ingresso. A differenza dei flussi di lavoro basati sulla derivatizzazione che richiedono ulteriori passaggi di modifica chimica o piattaforme specializzate per la preparazione del campione, questo protocollo consente l'estrazione diretta degli SCFA in un formato compatibile con l'analisi di routine basata su GC utilizzando apparecchiature standard di laboratorio2.
Questo metodo è pensato per studi che richiedono l'estrazione di SCFA da quantità limitate di materiale fecale di topo, in particolare quando sono necessarie misurazioni a livello individuale o quando la disponibilità di campioni limita la progettazione sperimentale. È adatto per l'analisi basata su GC dei comuni SCFA (C2–C6) in campioni fecali, ma non è progettato per applicazioni che richiedono la rilevazione dipendente dalla derivatizzazione, la quantificazione ultra-traccia oltre la sensibilità GC o la valutazione delle concentrazioni sistemiche di SCFA.
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Protocollo
Il Comitato Permanente sugli Animali presso il Mass General Brigham (MGB), Boston, MA, USA, approvò il precedente protocollo sugli animali, progettato per minimizzare il numero di animali utilizzati. Questo protocollo rispetta le linee guida e i regolamenti dei National Institutes of Health. Questo manoscritto è stato formato secondo le linee guida ARRIVE. Il diagramma protocollo è mostrato nella Figura 1, e i materiali necessari sono elencati nella Tabella dei Materiali.
Figura 1: Diagramma del protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
1. Raccolta e preparazione dei campioni fecali
- Raccogli campioni fecali freschi (~30 mg) in tubi separati da 1,5 mL per microcentrifuga. Registrare la massa esatta di ingresso fecale per ogni campione per consentire una normalizzazione accurata delle concentrazioni SCFA.
NOTA: Assicurarsi che il prelievo includa fiale, guanti e pinzette pulite per ogni campione. Tutti i vetri e gli strumenti devono essere autoclavati prima dell'uso. Questo protocollo è stato convalidato per masse di input fecali di circa 20–50 mg per campione, con ~30 mg utilizzati come input rappresentativo. I volumi di estrazione sono mantenuti costanti all'interno di questo intervallo. - Posiziona e etichetta il numero necessario di fiale centrifughe corrispondenti ai campioni.
- Preparare acido cloridrico diluito (0,5 M; pH 1–2) aggiungendo lentamente HCl concentrato (12 M, grado reagente ACS) ad acqua ultrapura.
ATTENZIONE: l'HCl è corrosivo; Può causare gravi ustioni alla pelle, agli occhi e alle vie respiratorie. Pericoloso da inalare. - Scongelare i campioni a temperatura ambiente per 30–45 minuti, o fino allo scongelamento completo.
2. Omogeneizzazione e acidificazione del campione
- Aggiungere 255 μL della soluzione da 0,5 M di HCl a ciascuna fiala della centrifuga.
- Prendi una nuova fiala e riempila con etanolo al 70% da usare per pulire le pinzette. Pulisci le pinzette immergendole nell'etanolo e poi asciugandole su un tovagliolo di carta pulito.
ATTENZIONE: L'etanolo è infiammabile e può irritare pelle e occhi; L'inalazione di vapori può causare vertigini. - Prepara un bagno di etanolo per i pestelli mettendo i peponetti in un contenitore e riempiendo il contenitore con il 70% di etanolo finché tutti i pestelli non sono completamente sommersi.
- Recupera il campione corretto dalla scatola del campione. Togli il coperchio dalla fiala e rimuovi un campione (~ 30 mg) di feci.
- Posizionare i campioni fecali nelle corrispondenti fiale della centrifuga.
- Una volta che tutti i campioni sono stati inseriti nelle fiale corrette della centrifuga, rimuovere un pestello dal bagno di etanolo. Asciuga il pestello con un asciugamano di carta pulito.
NOTA: Usa un nuovo pestello per ogni campione. - Usa i pestelli per schiacciare e dissolvere correttamente i campioni di feci, vedi Figura 2. Macinare il campione fecale fino a ottenere una sospensione visivamente omogenea, senza frammenti solidi visibili.
Figura 2: Macinazione dei campioni fecali usando un pestone. Le feci appena raccolte vengono macinate per ottenere una consistenza uniforme per l'analisi SCFA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Metti i pestelli usati in una scatola vuota da lavare in seguito.
- Vortice i campioni utilizzando un miscelatore a vortice di tipo impulso alla massima velocità per 10 secondi, con i tubi ben tappati.
NOTA: Assicurarsi che le fiale della centrifuga siano ben coperte per evitare che la miscela si rovesci.
3. Estrazione SCFA e separazione di fase
- Centrifugare i campioni a 16.000 × g per 10 minuti a 4 °C, assicurando un corretto bilanciamento della centrifuga.
- Dopo l'avvio della centrifuga, etichetta le nuove fiale corrispondenti ai campioni. Rimuovi i campioni dalla centrifuga una volta completata la centrifugazione.
- Imposta la pipetta da 200 μL a 120 μL. Raccogli con cura 120 μL del soprantantante acquoso dopo la centrifugazione, evitando disturbi del pellet. Trasferisci il surnatante nelle fiale centrifughe appena etichettate e scarta il pellet.
- Aggiungere una quantità uguale (120 μL) di acetato di etil nelle fiale appena etichettate con il liquido sovrantante. Ripeti questo per tutti i campioni.
ATTENZIONE: L'acetato di etil è infiammabile e può irritare pelle, occhi e sistema respiratorio. Evita di inalare vapori e contatti prolungati. - Porta di nuovo i campioni alla centrifuga. Assicurati che la centrifuga sia ben bilanciata e che il coperchio del rotore sia ben fissato. Gira a 2.374 × g per 20 minuti a 4 °C.
- Dopo la centrifugazione, raccogliere con cura 120 μL della fase organica superiore senza disturbare la fase acquosa inferiore. Trasferire il soprannatante contenente SCFA estratto in nuove fiale centrifughe marcate.
NOTA: Il volume raccolto può essere inferiore a 120 μL. Se è presente un'emulsione all'interfaccia, estendere la centrifugazione o raffreddare i campioni sul ghiaccio fino a raggiungere una separazione di fase chiara. I campioni procedurali a blank processati in parallelo senza materiale fecale possono essere inclusi come passaggio opzionale di controllo qualità per valutare i livelli di fondo degli SCFA introdotti da reagenti o da manipolazione. - Esamina le fiale precedenti per assicurarti che lo strato inferiore non sia stato accidentalmente sollevato.
NOTA: I passaggi che coinvolgono l'aggiunta di acidi e la gestione di solventi organici devono essere eseguiti rapidamente, mantenendo i tubi chiusi quando possibile, per minimizzare le perdite da volatilizzazione o evaporazione.
4. Gestione e stoccaggio dell'estrazione
- Individua e etichetta correttamente una scatola di estrazione, poi metti dentro i campioni estratti.
NOTA: I campioni possono essere messi in pausa in sicurezza dopo la raccolta della fase organica conservando gli estratti a −20 °C per un massimo di 24 ore in tubi strettamente chiusi, quindi trasferiti a −80 °C per una conservazione a lungo termine. - Metti la scatola in un congelatore a -80 °C in attesa dell'analisi SCFA.
NOTA: Poiché sia l'acetato di etil che il SCFA sono altamente volatili, i campioni estratti devono essere analizzati tempestivamente dopo la conservazione a −80 °C. Una conservazione prolungata a lungo termine può compromettere l'integrità del campione.
5. Analisi della cromatografia gassografica
- Analizzare gli SCFA estratti tramite GC utilizzando una colonna capillare in silice fusa con una fase stazionaria di acidi grassi liberi a portate di 30, 300 e 20 mL/min rispettivamente per idrogeno, aria e azoto. Iniettare un'aliquota di 1 μL dell'estratto organico per l'analisi.
- Per applicazioni quantitative, incorporare standard interni e procedure di calibrazione (ad esempio, 2-acido etilbutirico) come descrittoin precedenza 2.
NOTA: Le impostazioni dettagliate specifiche per lo strumento sono fornite nei metodi14 citati.
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Risultati
Il protocollo sopra avrebbe prodotto aliquote SCFA estratte di 120 μL corrispondenti al numero di campioni fecali da cui sono state ricamate. L'esecuzione riuscita del protocollo di estrazione è indicata dalla presenza di picchi SCFA chiaramente risolti in tempi caratteristici di ritenzione con intensità del segnale superiore al rumore di fondo. Quando eseguito come descritto, il protocollo produce profili SCFA fecali adatti al confronto quantitativo a valle tra campioni. Abbiamo quantif...
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Discussione
Questo protocollo contiene diversi passaggi critici che garantiscono un'estrazione efficiente e riproducibile degli SCFA da campioni fecali di topo di piccolo volume. Il protocollo impiega un sistema di estrazione acido-solvente a due fasi, utilizzando volumi definiti di acido cloridrico diluito e acetato di etile, adattato alle proprietà fisicochimiche degli SCFA come acidi organici deboli e a basso peso molecolare. L'acidificazione sposta gli SCFA nella loro forma protonata, riducendo ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Ringraziamo con gratitudine il sostegno finanziario a questo studio fornito dai National Institutes of Health tramite R21AG065606 e R21AG08176 assegnato a Yiying Zhang, nonché il sostegno della Borten Family Foundation e la donazione della famiglia Tang a Yiying Zhang.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Centrifuge | ThermoFisher | 75003424 | "Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge" |
| Centrifuge vials | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microtube Rack | Millipore Sigma | HS29025F-5EA | |
| Ethyl acetate | ThermoFisher | 022912.K2 | HPLC Grade, ≥99,5% |
| Green pestles | Fisher Scientific | 50-189-9195 | |
| HCl | Fisher Scientific | SA49 | ACS Certified (10 N, soluzione stock); diluito a 0,5 M per l'uso |
| 1000 μL pipette | USA Scientific | 7110-1000 | |
| 1000 μL pipette tips | USA Scientific | 1111-2821 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | Molecular Biology Grade, soluzione al 70% |
| 200 μL pipette | USA Scientific | 7100-2200 | |
| 200 μL pipette tips | USA Scientific | 1110-1800 | |
| Pinzette | ThermoFisher | 046638.KT | |
| Vortex | Fisher scientific | 50-136-7909 | "Research Products International Corp VORNADO Miniature Vortex Mixer, Purple Cup" |
Riferimenti
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